王 維， 李振東， 張誠(chéng)誠(chéng)， 張?jiān)戮?/p>

神經(jīng)炎癥是整個(gè)腦卒中康復(fù)過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵而復(fù)雜的病理生理過(guò)程，涉及早期損傷到缺血后組織修復(fù)[1]。研究表面，Nod樣受體蛋白-3(Nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3)炎癥小體可能對(duì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和誘導(dǎo)卒中后細(xì)胞損傷和死亡至關(guān)重要[2,3]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(包含caspase激活的招募域和前體caspase-1)組成，通過(guò)caspase-1激活觸發(fā)IL-1β和IL-18的釋放，在缺血性腦卒中發(fā)揮重要作用[4]。隨后，IL-1β和IL-18都參與炎癥反應(yīng)的啟動(dòng)和放大[4]。然而，NLRP3炎性體在缺血性卒中中的具體細(xì)胞位置和信號(hào)通路仍不清楚。據(jù)報(bào)道，線粒體功能障礙在一些炎癥性疾病中激活NLRP3炎癥體，如代謝綜合征、動(dòng)脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性變和腎病[5,6]。然而，目前還沒(méi)有明確的證據(jù)表明線粒體自噬與NLRP3炎癥體在腦卒中中的關(guān)系。本研究旨在闡明這些問(wèn)題，以揭示神經(jīng)炎癥在介導(dǎo)缺血性卒中損傷中的更多細(xì)節(jié)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立和分組 健康的雄性280～320 g Sprague-Dawley大鼠從廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(粵)2018-0029]獲得。將大鼠飼養(yǎng)在溫度(25±2)℃和濕度可控制的房間中。使動(dòng)物保持在12 h：12 h的光/暗循環(huán)下，自由進(jìn)食和飲水。大鼠隨機(jī)分為6組，每組8只：假手術(shù)組(Sham)、Sham+雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)組、再灌注后6 h組(I/R 6 h)、I/R 6 h+RAPA組、再灌注后24 h(I/R 24 h)和I/R 24 h+RAPA組。參照文獻(xiàn)方法建立短暫性大腦中動(dòng)脈閉塞(Transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO)模型，以刺激大鼠的缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[7]。大鼠通過(guò)腹腔注射戊巴比妥(100 mg/kg)誘導(dǎo)麻醉，在頸部做中線切口以暴露右頸外動(dòng)脈。然后，將一條單絲(北京西濃科技有限公司)插入頸內(nèi)動(dòng)脈中，經(jīng)過(guò)頸外動(dòng)脈，直至感覺(jué)到輕度阻力，表明該細(xì)絲已正確地放置在近端大腦前動(dòng)脈的一部分，并阻塞了流向大腦中動(dòng)脈的血液。將單絲放置在原位120 min，然后抽出以誘導(dǎo)再灌注。當(dāng)大鼠恢復(fù)意識(shí)時(shí)，出現(xiàn)左前肢麻痹或打圈運(yùn)動(dòng)，并且當(dāng)單絲移開(kāi)大腦時(shí)沒(méi)有觀察到腦出血的梗死組織，表明模型成功建立。假手術(shù)作為對(duì)照，除沒(méi)有插入單絲和隨后的再灌注，其余操作同tMCAO方法。藥物組在再灌注后立即以4 mg/kg的劑量腹腔注射RAPA(一種典型的自噬誘導(dǎo)劑，在使用前先溶解在無(wú)菌的DMSO溶液中，劑量參照文獻(xiàn)報(bào)道[8])。其余組動(dòng)物接受等體積的DMSO溶液。

1.2 免疫熒光分析 再灌注6 h和24 h后取腦，4 ℃下用4%多聚甲醛固定過(guò)夜。蔗糖梯度脫水后進(jìn)行冰凍切片。然后，將10 μm厚的冠狀切片在室溫下用含0.5%Triton X-100的10%山羊血清封閉30 min，然后用小鼠抗caspase-1(英國(guó)Abcam公司，1∶50)抗體和兔抗Iba1抗體(美國(guó)Wako公司，1∶250)或兔抗NeuN抗體(Abcam，1∶50)或兔抗GFAP抗體(Abcam，1∶250)在4 ℃過(guò)夜。切片用PBS洗滌3×10 min，然后用Alexa-Fluor 488共軛山羊抗鼠IgG(上海Beyotime公司，1∶500)和Alexa-Fluor 555共軛驢抗兔IgG(Beyotime，1∶500)的混合物在室溫下孵育1 h，再用DAPI染色5 min。使用lx71熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)采集缺血核心皮質(zhì)區(qū)域的圖像。不同類型神經(jīng)細(xì)胞中caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。

1.3 腦組織線粒體形態(tài)分析 取1 mm3缺血核心皮質(zhì)區(qū)域腦組織，分別用4%戊二醛、四氧化鋨固定。用PBS沖洗后，組織經(jīng)梯度酒精脫水。將包埋劑和100%丙酮按1∶1比例孵育1 h，將組織塊進(jìn)行超薄切片，枸櫞酸鉛染色。采用H-7700透射電鏡(日本Hitachi公司)對(duì)切片進(jìn)行超微結(jié)構(gòu)檢查。

1.4 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)和處理 BV2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將BV2細(xì)胞接種在含有10%熱滅活胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)和1%青霉素/鏈霉素(美國(guó)HyClone公司)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)中培養(yǎng)。使用Lipo3000(美國(guó)Invitrogen公司)將si-NLRP3 siRNA(正向，5’-GUACUUAAAUCGUGAAACAdTdT-3’；反向，3’-dTdTCAUGAAUUUAGCACUUUGU-5’)或si-NC(核糖核酸)轉(zhuǎn)染BV2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染24 h后，將BV2細(xì)胞進(jìn)行氧-糖剝奪/復(fù)氧(Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)處理。具體操作：用無(wú)葡萄糖DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)代替培養(yǎng)基，然后將培養(yǎng)板放入含有95%N2和5%CO2的混合氣體的MIC-101缺氧培養(yǎng)箱(美國(guó)Billups Rothenberginc公司)，孵育4 h，然后恢復(fù)正常氣體和培養(yǎng)基，誘導(dǎo)OGD/R模型。將siRNA轉(zhuǎn)染和OGD/R處理組分為以下幾組：對(duì)照組(NC)、OGD/R組(OGD/R)、OGD/R+si-NC組(si-NC轉(zhuǎn)染)、OGD/R+si-NLRP3組(用si-NLRP3轉(zhuǎn)染)、NC+RAPA組和OGD/R+RAPA組。需要藥物治療的細(xì)胞組在復(fù)氧后用含25 nmol/L RAPA的DMEM/F12培養(yǎng)基處理，其他組用PBS作為對(duì)照。

1.5 線粒體膜電位測(cè)量(Δψm) 用JC-10染色法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位。JC-10是一種親脂性陽(yáng)離子菁染料，在線粒體基質(zhì)中呈現(xiàn)紅色熒光聚集體。當(dāng)失去膜電位時(shí)，這些聚集體分解成綠色熒光單體。細(xì)胞與10 μg/ml JC-10在37 ℃黑暗條件下孵育45 min。然后用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD-FACSVerse公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析，激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為530 nm。測(cè)量聚集體(紅色熒光)和單體(綠色熒光)的百分比。線粒體去極化以綠色熒光強(qiáng)度的百分比表示。

1.6 Western blot分析 用RIPA緩沖液(上海Beyotime公司)裂解缺血皮質(zhì)或細(xì)胞提取總蛋白。通過(guò)BCA試劑盒評(píng)估蛋白質(zhì)含量。采用10%SDS-PAGE電泳將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(美國(guó)Invitrogen公司)。將膜用5%脫脂牛奶封閉1 h，然后在4 ℃下用以下一抗封閉過(guò)夜：NLRP3(1∶1000)、caspase-1(1∶1000)、IL-1β(1∶1000)、LC3-Ⅰ/Ⅱ(1∶800)和GAPDH(1∶1000，均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)。將PVDF膜與抗兔IgG(美國(guó)MultiSciences公司，1∶5000)在室溫下孵育1 h。使用蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)化學(xué)發(fā)光試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)觀察目標(biāo)條帶。

2 結(jié) 果

2.1 在I/R損傷過(guò)程中NLRP3炎性體激活的細(xì)胞位置變化情況 在缺血損傷區(qū)觀察到，I/R損傷后6 h，切割的caspase-1主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[(88.4±1.1)%]，在其他細(xì)胞類型中很少表達(dá)。然后，切割的caspase-1在24 h時(shí)主要在神經(jīng)元[(63.4±2.2)%]中表達(dá)，而在小膠質(zhì)細(xì)胞[(12.2±1.1)%]中表達(dá)降低(見(jiàn)圖1A、圖1B)。

圖1 在I/R損傷過(guò)程中NLRP3炎性體激活的細(xì)胞位置變化情況。A：切割的caspase-1在假手術(shù)和腦I/R后6 h和24 h小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中的表達(dá)(放大倍數(shù)：×200，比例尺=100 μm)；B：腦I/R后6 h和24 h切割的caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞在不同類型細(xì)胞中的百分率。與I/R后6 h相比***P<0.001

2.2 NLRP3激活小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥小體途徑 與NC相比，在OGD/R后，BV2細(xì)胞中NLRP3的蛋白水平隨著時(shí)間的推移而增加，尤其是在24 h(均P<0.01)。當(dāng)通過(guò)si-NLRP3轉(zhuǎn)染使BV2細(xì)胞中NLRP3表達(dá)沉默時(shí)，觀察到在OGD/R后，切割的caspase-1和切割的IL-1β表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)，提示NLRP3介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥小體途徑激活(見(jiàn)圖2A、圖2B)。

圖2 Western blot檢測(cè)NLRP3炎性體在BV2細(xì)胞中的表達(dá)。A：OGD/R后不同時(shí)間點(diǎn)NLRP3在BV2細(xì)胞中的表達(dá)；B：轉(zhuǎn)染si-NLRP3對(duì)OGD/R處理的BV2細(xì)胞中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β的表達(dá)。與NC相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；與OGD/R 24 h+NC相比#P<0.05，##P<0.01

2.3 I/R損傷和OGD/R過(guò)程中腦組織線粒體形態(tài)學(xué)變化和自噬情況 假手術(shù)組大鼠線粒體完整，嵴光滑透明，間質(zhì)均勻。I/R損傷后6 h，線粒體腫脹，嵴斷裂，基質(zhì)密度降低，線粒體空泡化。I/R損傷后24 h，大量線粒體被破壞，自噬體少見(jiàn)。體外試驗(yàn)顯示，在OGD/R后，BV2細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化隨著時(shí)間的推移而減少，尤其是在24 h(均P<0.01)。表明OGD/R抑制了BV2細(xì)胞的自噬水平(見(jiàn)圖3A、圖3B)。

圖3 在I/R損傷和OGD/R過(guò)程中腦組織線粒體形態(tài)學(xué)變化和自噬情況。A：透射電鏡顯示假手術(shù)和I/R后6 h和24 h大鼠腦組織線粒體損傷的典型圖像(放大倍數(shù)：×16000)；B：OGD/R對(duì)BV2細(xì)胞自噬標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比*P<0.05，**P<0.01；與OGD/R 4 h組相比###P<0.001

2.4 自噬誘導(dǎo)劑可抑制OGD/R損傷時(shí)NLRP3炎性體的激活 用JC-10和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組線粒體膜電位(Δψm)提示，JC-10形成聚集體，在Q2象限顯示紅色熒光。暴露于OGD/R后24 h，BV2細(xì)胞中Q3象限細(xì)胞比例增加，聚集體分解為綠色熒光單體。細(xì)胞表現(xiàn)出低膜電位(綠色熒光)的百分比表明膜電位丟失。與OGD/R組相比，自噬誘導(dǎo)劑RAPA能夠挽救線粒體的損傷(P<0.05)。接下來(lái)，研究分析了線粒體功能障礙與NLRP3炎癥體之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，RAPA可抑制OGD/R誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中NLRP3、切割的caspase-1和切割的IL-1β表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)(見(jiàn)圖4A～D)。

圖4 OGD/R后BV2細(xì)胞線粒體自噬抑制可激活NLRP3炎性體。A、B：流式細(xì)胞術(shù)觀察各組低細(xì)胞膜電位的百分比及定量分析；C、D：自噬誘導(dǎo)劑RAPA對(duì)OGD/R處理的BV2細(xì)胞中NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β的表達(dá)。與NC相比**P<0.01；與OGD/R 24 h相比#P<0.05

2.5 自噬誘導(dǎo)劑抑制腦I/R損傷時(shí)NLRP3炎性體的激活 I/R+RAPA組在腦I/R損傷后6 h或24 h時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞[(12.7±1.8)% vs (70.0±2.0)%]和神經(jīng)元[(11.9±1.9)% vs (70.8±1.7)%]中切割的caspase-1的表達(dá)均顯著低于I/R組(P<0.001) 。這些結(jié)果表明，自噬誘導(dǎo)劑在腦I/R損傷中能抑制NLRP3炎性體的激活，提示線粒體功能障礙在腦I/R損傷中起重要作用(見(jiàn)圖5A～C)。

圖5 自噬誘導(dǎo)劑可抑制腦I/R后NLRP3炎性體的活化。A：切割的caspase-1在腦I/R后6 h和24 h小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中的表達(dá)；B：腦I/R后6 h切割的caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞在小膠質(zhì)細(xì)胞的百分率；C：腦I/R后24 h切割的caspase-1陽(yáng)性細(xì)胞在神經(jīng)元中的百分率。與Sham相比***P<0.001；與I/R后6 h或24 h相比***P<0.001

3 討 論

最近，在I/R損傷后的一些器官中發(fā)現(xiàn)了NLRP3炎癥體，如大腦、心臟、腎臟和睪丸[9]。據(jù)報(bào)道，損傷相關(guān)分子模式是激活NLRP3的關(guān)鍵初始刺激[10]。NLRP3可激活前半胱氨酸蛋白酶-1裂解成活性片段，然后裂解的半胱氨酸蛋白酶-1誘導(dǎo)形成成熟的促炎細(xì)胞因子，即IL-1β和IL-18[4]。這些細(xì)胞因子隨后啟動(dòng)或放大多種下游信號(hào)通路，以驅(qū)動(dòng)促炎癥過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，并可能會(huì)釋放損傷相關(guān)分子以誘導(dǎo)更多炎癥[11]。在小鼠腦內(nèi)，觀察到LPS刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)NLRP3、ASC和caspase-1的表達(dá)，而星形膠質(zhì)細(xì)胞中未檢測(cè)到這種表達(dá)，表明小膠質(zhì)細(xì)胞可能是參與功能性NLRP3炎癥體形成的主要部位[12]。此外，Zhang等發(fā)現(xiàn)，在OGD/R條件下，原代皮質(zhì)神經(jīng)元中NLRP3炎癥體蛋白和IL-1β和IL-18的水平上調(diào)[13]。相反，在MCAO小鼠模型中，Sun等證明NLRP3在小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但在神經(jīng)元中不表達(dá)[2]。因此，NLRP3炎性體在腦I/R損傷中的特異性表達(dá)和分布尚未得出結(jié)論。

在本研究中，我們選擇大鼠作為動(dòng)物模型，因?yàn)榇笫蟮幕蚺c人類的基因相對(duì)接近，并動(dòng)態(tài)觀察了I/R損傷后NLRP3炎性體途徑的細(xì)胞定位。結(jié)果顯示，在tMCAO大鼠中裂解的caspase-1主要在24 h內(nèi)的缺血核心區(qū)域表達(dá)，并且活化的炎癥小體在腦I/R損傷后首先在小膠質(zhì)細(xì)胞中形成，但在星形膠質(zhì)細(xì)胞中不形成，然后在24 h內(nèi)主要在神經(jīng)元中表達(dá)。而當(dāng)BV2細(xì)胞中的NLRP3 siRNA轉(zhuǎn)染使NLRP3表達(dá)沉默時(shí)，觀察到在OGD/R后，切割的caspase-1和切割的IL-1β表達(dá)水平顯著下調(diào)，提示NLRP3介導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥小體途徑激活。先前的一項(xiàng)研究表明，NLRP3炎性體誘導(dǎo)了caspase-1依賴性焦磷酸化，可能是氯胺酮誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)毒性中與線粒體相關(guān)凋亡相關(guān)的重要途徑[14]。這些先前的結(jié)果與本研究結(jié)果一致。因此，小膠質(zhì)細(xì)胞是腦I/R損傷后早期激活的NLRP3炎性小體的主要來(lái)源，可能驅(qū)動(dòng)促炎過(guò)程，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和破壞，并在后期主要聚集在神經(jīng)元中，誘發(fā)神經(jīng)元死亡和血腦屏障完整性障礙[15]。

線粒體對(duì)I/R損傷極為敏感。NLRP3炎癥體的升高引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放和線粒體極化，導(dǎo)致線粒體膜電位和mPTP開(kāi)放降低，從而導(dǎo)致線粒體自噬[16]。線粒體自噬不僅選擇性地清除受損的線粒體，而且阻止受損線粒體產(chǎn)生ROS，并可改善炎癥反應(yīng)[17]。因此，中度自噬是正常代謝中不可或缺的一部分，可清除受損蛋白質(zhì)，并在腦損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。研究表明，氧化苦參堿通過(guò)促進(jìn)SIRT1介導(dǎo)的自噬來(lái)減輕缺血性卒中引起的認(rèn)知障礙[18]。此外，許多神經(jīng)保護(hù)藥物被認(rèn)為可以通過(guò)激活自噬來(lái)減輕缺血誘導(dǎo)的繼發(fā)性腦損傷[19]。同樣，本研究觀察到，I/R損傷后大量線粒體被破壞，自噬體減少，并且暴露于OGD/R的BV2細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化隨著時(shí)間的推移而減少，表明OGD/R抑制了BV2細(xì)胞的自噬水平。此外，自噬誘導(dǎo)劑RAPA可以通過(guò)上調(diào)線粒體自噬水平來(lái)保護(hù)線粒體的功能，這與先前發(fā)現(xiàn)RAPA可阻止氧化應(yīng)激缺血環(huán)境中mPTP開(kāi)放和線粒體去極化的研究一致[20]。因此，我們使用RAPA來(lái)確定BV2細(xì)胞中線粒體自噬和NLRP3炎性體之間的關(guān)系。結(jié)果表明，線粒體自噬在OGD/R后BV2細(xì)胞NLRP3炎性體途徑的激活中起重要作用，RAPA能有效減輕BV2細(xì)胞NLRP3炎性體反應(yīng)，并且RAPA能抑制I/R損傷后NLRP3炎性體的激活，提示線粒體自噬在腦I/R損傷中起重要作用。

綜上所述，本研究確定了腦I/R損傷后NLRP3炎性體途徑細(xì)胞定位的動(dòng)態(tài)變化，表明小膠質(zhì)細(xì)胞是腦I/R損傷早期激活NLRP3炎性體的主要來(lái)源，隨著時(shí)間的推移，NLRP3炎癥小體在神經(jīng)元中被激活。此外，線粒體自噬下調(diào)是激活小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3炎性體的關(guān)鍵，自噬誘導(dǎo)劑可有效減輕OGD/R和腦I/R損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的NLRP3炎性體反應(yīng)。