李 游，陳曉隆，張玉強(qiáng)

(1.愛(ài)爾眼科醫(yī)院集團(tuán)錦州愛(ài)爾眼科醫(yī)院，遼寧錦州 121001；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院眼科，沈陽(yáng) 110004；3.錦州醫(yī)科大學(xué)骨科研究所，遼寧錦州 121001)

在早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的患者中，視網(wǎng)膜新生血管大量增殖可導(dǎo)致出血，牽拉視網(wǎng)膜可導(dǎo)致裂孔及脫離，嚴(yán)重者可永久致盲[1]，由此帶來(lái)的各種問(wèn)題越來(lái)越引起人們的重視。目前已知與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的視網(wǎng)膜新生血管形成有關(guān)的因素有很多，但新生血管的增殖機(jī)制非常復(fù)雜[1-2]，仍有許多未知因素?zé)o確切結(jié)論。因此，本課題組從基因角度入手，進(jìn)一步研究早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變的治療方案。RTK信號(hào)通路是生成新生血管的機(jī)制之一[3]，其中促紅細(xì)胞生成肝細(xì)胞激酶(Eph)/促紅細(xì)胞生成肝細(xì)胞激酶受體相互作用蛋白(Ephrin)系統(tǒng)傳遞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(VEGFR)和內(nèi)皮細(xì)胞TEK酪氨酸激酶(Tie)定位信號(hào)，其在血管形成中影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，控制新生血管發(fā)展[4]，EphB4/EphrinB2在視網(wǎng)膜新生血管的形成和增殖中起到了重要的作用。因此，本課題組擬建立SD大鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型來(lái)模擬人類(lèi)早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變，研究視網(wǎng)膜新生血管增殖過(guò)程中EphB4/EphrinB2表達(dá)的變化，觀察玻璃體腔內(nèi)注射EphB4能否抑制或減少視網(wǎng)膜新生血管的生成，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

20只健康SD孕鼠購(gòu)于錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，待新生幼鼠7 d齡時(shí)進(jìn)行建模和實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1SD大鼠視網(wǎng)膜病變模型的建立

80只7 d齡SD大鼠分為4組：模型組、干預(yù)組和對(duì)照組和正常組，每組20只。將模型組置于氧濃度75%的密閉艙內(nèi)5 d后回到正常室內(nèi)環(huán)境中，建立視網(wǎng)膜病變模型[2]；干預(yù)組建立視網(wǎng)膜病變模型并于出倉(cāng)后(12 d)玻璃體腔注射EphB4 1 μL(美國(guó)VasGene Therapeutics公司)；對(duì)照組幼鼠同樣建立視網(wǎng)膜病變模型，于12 d玻璃體腔注射生理鹽水1 μL；正常組置于正?？諝庵谐Ｒ?guī)飼養(yǎng)。各組分別于17 d處死并取材。

1.2.2組織的制備

腹腔注射3 g/kg水合氯醛處死大鼠，取雙眼。將右眼一部分制作成視網(wǎng)膜鋪片進(jìn)行ADP酶染色，另一部分做冰凍切片進(jìn)行EphB4/Ephrin免疫熒光檢測(cè)。左眼視網(wǎng)膜組織集中冷凍保存，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EphB4 mRNA。

1.2.3視網(wǎng)膜鋪片的制作及ADP酶染色

摘取的SD幼鼠眼球在4%多聚甲醛中充分固定，手術(shù)顯微鏡下仔細(xì)分離出視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜，用0.05 mol/L馬來(lái)酸緩沖液沖洗，在37 ℃的ADP培養(yǎng)液中培養(yǎng)15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底清洗，10%硫酸銨著色，甘油明膠密封，顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜血管的形態(tài)和分布[2]。

1.2.4EphB4/EphrinB2蛋白的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)

制作視網(wǎng)膜冰凍切片。山羊血清封閉后加入一抗EphB4及EphrinB2多克隆抗體，4 ℃冷藏過(guò)夜后加入Cy3和熒光素鈉標(biāo)記的二抗IgG，暗盒內(nèi)室溫靜置90 min，加入DAPI暗盒內(nèi)室溫靜置5 min，充分洗滌，甘油明膠密封，遮光，激光共聚焦顯微鏡下觀察EphB4/EphrinB2蛋白在視網(wǎng)膜的分布和表達(dá)情況[2]。

1.2.5EphB4 mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

根據(jù)EphB4和內(nèi)參β-actin的mRNA序列合成所需引物。先提取出視網(wǎng)膜組織中EphB4和內(nèi)參β-actin的總RNA，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的第一鏈，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，繪制溶解曲線[1]。計(jì)算各組EphB4 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 視網(wǎng)膜新生血管的觀察

新生血管呈毛刷狀或團(tuán)簇狀，而正常血管呈樹(shù)枝狀走形，二者有明顯不同的形態(tài)。模型組和對(duì)照組視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張，可見(jiàn)大量的新生血管分布及眼底片狀出血；干預(yù)組視網(wǎng)膜血管樹(shù)枝狀走向，形態(tài)良好，有少量新生血管；正常組血管發(fā)育良好，見(jiàn)圖1。

A：模型組；B：對(duì)照組；C：干預(yù)組；D：正常組。

2.2 視網(wǎng)膜中EphB4和EphrinB2蛋白的表達(dá)

激光共聚焦顯微鏡下可以清晰地觀察到視網(wǎng)膜各層的組織形態(tài)，EphB4和EphrinB2大量表達(dá)于視網(wǎng)膜新生血管生成區(qū)，且圖像重合后發(fā)現(xiàn)EphB4的紅色熒光與EphrinB2的綠色熒光聚集在視網(wǎng)膜新生血管生成區(qū)互相重合呈黃色。細(xì)胞核染色為藍(lán)色熒光。正常組少量表達(dá)EphB4和EphrinB2，模型組和對(duì)照組大量表達(dá)EphB4和EphrinB2，干預(yù)組EphB4和EphrinB2的熒光染色亮度明顯弱于模型組和對(duì)照組，見(jiàn)圖2。

圖2 SD大鼠視網(wǎng)膜EphB4/EphrinB2蛋白的免疫熒光雙標(biāo)染色(200×)

2.3 大鼠視網(wǎng)膜實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

EphB4 mRNA在模型組視網(wǎng)膜的相對(duì)表達(dá)水平為0.87±0.11，而正常組為0.19±0.03，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。EphB4 mRNA在干預(yù)組視網(wǎng)膜的相對(duì)表達(dá)水平為0.25±0.04，明顯低于模型組及對(duì)照組(0.96±0.13)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

A：擴(kuò)增曲線；B：溶解曲線。

3 討 論

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變是一個(gè)非常復(fù)雜的病理過(guò)程。視網(wǎng)膜的新生血管沒(méi)有發(fā)育完全，容易破裂出血和機(jī)化，形成機(jī)化膜后會(huì)牽拉視網(wǎng)膜發(fā)生裂孔，造成視網(wǎng)膜脫離，手術(shù)很難完全恢復(fù)視力。視網(wǎng)膜要形成新的血管，EphrinB配體及其同源Eph受體是最重要的導(dǎo)向分子之一，在信號(hào)傳輸中起著重要作用[6]。EphrinB2配體及其受體EphB4已被證明在動(dòng)脈和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中均有特異表達(dá)，傳遞血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的雙向信號(hào)，并控制胚胎中的心血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)和連接[7]。內(nèi)皮特異性EphrinB2缺失導(dǎo)致血管形態(tài)發(fā)生缺陷。相反，功能性EphrinB2表達(dá)已被證明在出生后新生血管形成中促進(jìn)動(dòng)脈和靜脈血管之間的相互作用[8]。在血管重塑過(guò)程中，EphrinB2的表達(dá)增強(qiáng)了血管修剪和周細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮組裝的影響[9]，參與了視網(wǎng)膜血管的形成。

有研究表明，玻璃體腔注射可溶性EphB4-Fc、EphrinB2或可溶性EphB4能抑制大鼠視網(wǎng)膜血管的形成[10]。同時(shí)，EphB4和EphrinB2也存在于在動(dòng)脈和靜脈血管叢，以及血管網(wǎng)的深層[11]，EphB4在大鼠視網(wǎng)膜新生血管中的作用主要表現(xiàn)為視網(wǎng)膜淺靜脈的血管生成及連接，在視網(wǎng)膜血管發(fā)育過(guò)程中也大量存在[9]。研究結(jié)果表明，EphB2-Fc激活EphrinB2可明顯增強(qiáng)血管生成[12]。在小鼠胚胎細(xì)胞中敲除EphrinB2結(jié)合的PDZ區(qū)后發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞形成絲狀偽足的能力明顯降低，相互連接不緊密，易形成發(fā)育不完全的新生血管[13-14]。用EphrinB2抗體治療后，血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化達(dá)到平衡，血管形態(tài)多態(tài)性下降，更趨于環(huán)狀，表明EphB4/EphrinB2是影響血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的重要因素之一，是治療視網(wǎng)膜新生血管的有效靶點(diǎn)[15]。

綜上所述，Eph/Ephrin RTK系統(tǒng)的復(fù)雜性、多方面性和普遍性正應(yīng)用于各種復(fù)雜的分子、細(xì)胞研究。這是一個(gè)新的和快速增長(zhǎng)的研究領(lǐng)域，因?yàn)樗鼈冇绊懸幌盗屑?xì)胞行為和生物過(guò)程，因此，在治療人類(lèi)疾病方面具有巨大的潛力。Eph/Ephrin信號(hào)通路可以作為調(diào)節(jié)血管新生的靶點(diǎn)抑制視網(wǎng)膜新生血管的形成，本研究通過(guò)注射EphB4調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜病變中視網(wǎng)膜EphB4/EphrinB2的活性，觀察了EphrinB2表達(dá)的改變及對(duì)新生血管生成的影響，為治療視網(wǎng)膜新生血管提供新的理論依據(jù)和治療策略。