楊 針，張文智，盧 鵬

(解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院肝膽外科，海南三亞 572000)

肝癌是最常見的惡性腫瘤之一[1-3]，多數(shù)患者在得到確診時(shí)已發(fā)展至晚期，失去了手術(shù)或其他根治性治療的機(jī)會，而對于晚期肝癌患者的治療效果仍未能令人滿意。小干擾RNA(siRNA)在腫瘤基因靶向治療中已成為研究熱點(diǎn)，成為有希望的治療策略[4-5]。siRNA是指具有特定長度和結(jié)構(gòu)的RNA，由雙鏈RNA被核酸內(nèi)切酶切割而成[5-6]，主要通過互補(bǔ)序列的mRNA降解來調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，在進(jìn)化中高度保守，具有特異性、簡單性及穩(wěn)定性[7]。然而，siRNA在實(shí)際應(yīng)用中存在著“脫靶”效應(yīng)[8]、半衰期短、細(xì)胞攝取率低等問題，從而限制了其在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。聚乙烯亞胺(PEI)是一種人工合成的陽離子納米基因載體，廣泛應(yīng)用于質(zhì)粒、核苷酸的傳輸[9]。PEI通過氨基上的正電荷與磁性納米顆粒(SPIO)的羧基、siRNA磷酸基上的負(fù)電荷結(jié)合，再通過“質(zhì)子海綿效應(yīng)”將siRNA釋放進(jìn)而發(fā)揮RNA干擾作用[10]。有研究表明，聚乙烯亞胺修飾的磁性納米顆粒(PEI-SPIO)與siRNA結(jié)合后能有效保護(hù)其不被核酸酶降解[11]，順利穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，從而發(fā)揮RNA干擾作用[12]。如何將醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用在肝臟腫瘤的靶向治療已成為研究的熱點(diǎn)。本研究通過構(gòu)建帶有熒光素酶的C57BL/6小鼠原位肝癌模型，再將PEI-SPIO包裹的siRNA注入小鼠體內(nèi)，進(jìn)一步測試PEI-SPIO包裹的siRNA在C57BL/6小鼠原位肝癌中的攝取及siRNA在小鼠腫瘤滯留時(shí)間，從而為進(jìn)一步研究PEI-SPIO包裹的siRNA在抑制小鼠肝癌生長的作用提供基礎(chǔ)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

20只雌性C57BL/6小鼠，8周齡，體重20 g左右(購于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心)，飼養(yǎng)于空軍軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，所有操作均符合空軍軍醫(yī)大學(xué)科研倫理要求(審批號：XJYYLL-2014051)。小鼠肝癌luc-hepa1-6細(xì)胞系由本院實(shí)驗(yàn)室凍存。PEI-SPIO由空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系實(shí)驗(yàn)室合成，Cy5熒光標(biāo)記的siRNA(Cy5-siRNA)由廣州銳博公司合成。Matrigel基質(zhì)膠購于美國Discovery Labware公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、小動(dòng)物活體成像儀購于美國Caliper life science公司，微量進(jìn)樣器、D-Luciferin購于美國Goldbio公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

luc-hepa1-6細(xì)胞完全培養(yǎng)基為15%胎牛血清的DMEM，細(xì)胞置于37 ℃的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2luc-hepa1-6細(xì)胞膠懸液制備

將luc-hepa1-6細(xì)胞用胰酶消化，離心，細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，最后用Matrigel基質(zhì)膠稀釋成8×107/mL的膠懸液。用微量進(jìn)樣器吸取膠懸液，放置于冰上防止其凝固。

1.2.3C57BL/6小鼠原位肝癌模型構(gòu)建

用戊巴比妥鈉對小鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。將小鼠仰臥位固定于鼠板，以75%乙醇常規(guī)消毒，于下腹部正中線切開腹部皮膚，依次剪開皮膚、腹膜，由下向上至劍突下，充分暴露肝臟，將微量進(jìn)樣器刺入肝葉內(nèi)約l cm，緩慢推注25 μL含有2×106個(gè)luc-hepa1-6細(xì)胞的Matrigel基質(zhì)膠膠懸液，緩慢拔出微量進(jìn)樣器。逐層縫合關(guān)腹，再次乙醇消毒。

1.2.4活體監(jiān)測小鼠體內(nèi)成瘤情況

在小鼠接種原位肝癌第20天按10 μL/g體重濃度，加入相應(yīng)體積的30 mg/mL D-Luciferin對小鼠進(jìn)行腹腔注射。注射入體內(nèi)15 min后，通過吸入2%異氟烷實(shí)施麻醉且在整個(gè)顯像過程中持續(xù)吸入，將小鼠仰臥位擺放于LuminaⅡ活體成像系統(tǒng)的暗箱中，進(jìn)行原位肝癌的活體成像。

1.2.5活體檢測siRNA在小鼠體內(nèi)的分布

在接種原位瘤后的第21天，通過尾靜脈注射PEI-SPIO包裹的siRNA。先將PEI-SPIO在超聲儀中超聲1 h，然后將PEI-SPIO與Cy5-siRNA(siRNA的量按照與小鼠的體重比為0.5 g/kg)按照一定的比例復(fù)合，使其總體積達(dá)到400 μL，室溫孵育30 min。將C57BL/6荷瘤小鼠固定在小鼠固定器中，尾靜脈注射Cy5-siRNA或孵育好的PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物。分別在注射后2、8、24 h用LuminaⅡ活體成像系統(tǒng)選擇激發(fā)光波長在640 nm檢測Cy5標(biāo)記的siRNA在小鼠體內(nèi)的分布情況。

1.2.6原位肝癌的病理檢測

成像結(jié)束后，腹腔注射戊巴比妥麻醉，待麻醉后固定在小鼠版上，從心尖灌注生理鹽水，灌注后留取肝臟、腎臟、脾臟等組織。經(jīng)10%的甲醛固定液固定24～48 h，制備石蠟切片，蘇木素-伊紅(HE)染色進(jìn)行常規(guī)染色檢查。同時(shí)切片進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，檢測PEI-SPIO在原位肝癌中的分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 C57BL/6小鼠原位肝癌模型

在小鼠肝原左葉接種2×106個(gè)luc-hepa1-6細(xì)胞，接種后第21天用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測小鼠原位肝癌的成瘤情況，結(jié)果顯示luc-hepa1-6細(xì)胞系可在小鼠肝臟種植成瘤，見圖1。

圖1 小鼠接種后第21天原位肝癌的熒光圖

2.2 活體檢測siRNA在小鼠體內(nèi)的分布

Cy5-siRNA和PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物主要在肝臟、腎臟聚集。Cy5-siRNA于2 h在肝臟聚集達(dá)到高峰，很快轉(zhuǎn)移至腎臟，8 h后可見熒光值開始降低，24 h肝臟部位熒光強(qiáng)度明顯降低。而PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物可在肝癌部位持續(xù)存在，24 h后仍可見到Cy5-siRNA的熒光值處于非常高的水平，見圖2。

A.不同時(shí)間點(diǎn)Cy5-siRNA在小鼠肝臟腫瘤的熒光分布圖；B.小鼠肝臟腫瘤Cy5-siRNA熒光值的統(tǒng)計(jì)分析圖；a：P<0.05。

2.3 肝癌大體標(biāo)本和病理學(xué)切片

小鼠灌注取材結(jié)果顯示，腫瘤在小鼠肝臟左葉，其形態(tài)不規(guī)則呈結(jié)節(jié)狀浸潤生長，表明凹凸不平，質(zhì)地較硬，見圖3。病理切片HE染色結(jié)果顯示，肝癌組織內(nèi)的細(xì)胞為類圓形或不規(guī)則形細(xì)胞異型性明顯，核質(zhì)比明顯失調(diào)，呈塊狀或團(tuán)塊狀分布，見圖4。

圖3 接種后第21天后小鼠原位肝癌大體標(biāo)本圖

圖4 小鼠原位肝癌病理圖(HE，200×)

2.4 普魯士藍(lán)染色

切片普魯士藍(lán)染色鏡下明顯可見肝癌組織中SPIO的藍(lán)色顆粒，證實(shí)PEI-SPIO在肝癌中聚集，并能攜帶siRNA到腫瘤組織中，見圖5。

圖5 小鼠原位肝癌普魯士藍(lán)染色結(jié)果(400×)

3 討 論

近年來，siRNA被廣泛應(yīng)用于腫瘤的治療之中，siRNA選擇性地與mRNA的特異性序列結(jié)合從而持續(xù)抑制致病性蛋白的表達(dá)[13-14]，發(fā)揮其抑制腫瘤生長。醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用于肝癌的治療中，已成為研究的熱點(diǎn)，其為肝癌腫瘤的靶向治療提供了新的研究方向[15-16]。本研究將納米材料PEI-SPIO與siRNA結(jié)合，檢驗(yàn)PEI-SPIO包裹的siRNA在小鼠原位肝癌的持續(xù)時(shí)間，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。hepa1-6細(xì)胞是來源于C57小鼠的BW7756肝癌細(xì)胞系，所以，luc-hepa1-6細(xì)胞構(gòu)建的小鼠原位肝癌模型在組織學(xué)上與人的肝癌高度相似，能夠?yàn)楸狙芯扛伟┑陌l(fā)病機(jī)制、藥物療效評價(jià)及治療方法提供動(dòng)物模型。DUAN等[12]通過PEI-SPIO包裹的siRNA來治療關(guān)節(jié)炎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比于對照組，PEI-SPIO包裹的siRNA組能明顯延長siRNA在小鼠體內(nèi)的半衰期。因此，本課題組將PEI-SPIO與siRNA結(jié)合來驗(yàn)證PEI-SPIO在小鼠肝癌組織中保護(hù)siRNA的能力及延長其半衰期，從而為醫(yī)用納米技術(shù)應(yīng)用于肝癌的治療提供了新的方法。

本研究首先通過luc-hepa1-6細(xì)胞在C57BL/6小鼠肝左葉建立小鼠原位肝癌模型，在建立模型過程中選擇肝左葉是因?yàn)樾∈蟾巫笕~體積相對于其他肝葉大，能夠容納25 μL體積的細(xì)胞膠懸液。在小鼠接種原位肝癌后的第21天通過尾靜脈注射Cy5-siRNA或PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物，分別在注射后的2、8、24 h監(jiān)測siRNA在小鼠體內(nèi)的分布，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cy5-siRNA在小鼠肝癌中2 h到達(dá)高峰，8 h后可見siRNA的熒光值開始降低，24 h后不能見到siRNA的熒光值，而PEI-SPIO與Cy5-siRNA的復(fù)合物可在肝癌中持續(xù)存在，24 h仍可在腫瘤部位見到Cy5-siRNA聚集，說明PEI-SPIO包裹的siRNA能明顯延長siRNA在小鼠肝癌組織中的半衰期。進(jìn)一步灌注取材后可見肝左葉腫瘤組織，腫瘤病理切片證實(shí)為腫瘤細(xì)胞，同時(shí)可在腫瘤組織的普魯士藍(lán)染色中見到PEI-SPIO，證明SPIO能夠攜帶siRNA進(jìn)入腫瘤組織中，為進(jìn)一步發(fā)揮siRNA干擾抑制的作用提供載體。

綜上所述，通過將小鼠原位肝癌模型與PEI-SPIO包裹的siRNA結(jié)合建立的模型，為研究肝癌的治療提供了新的思路，同時(shí)也為醫(yī)用納米材料對腫瘤的治療提供了新的手段。PEI-SPIO包裹的siRNA能夠到達(dá)小鼠原位肝癌部位，并在腫瘤組織中持續(xù)存在一定時(shí)間。因此，今后有望通過PEI-SPIO包裹的siRNA實(shí)現(xiàn)針對肝癌的基因治療，提高肝癌的總體治療效果。