馬環(huán)，汪運(yùn)洋，王晨，王珣，周第，陳興，潘海龍

1.北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京 102600；2.中國(guó)生物技術(shù)股份有限公司，北京 100020

1926年，GLENNY等證實(shí)，鋁佐劑與抗原吸附后可顯著增強(qiáng)抗原的免疫原性，至今鋁佐劑仍為最廣泛使用的佐劑［1］。鋁佐劑主要由氫氧化鋁、磷酸鋁及鋁幾種形式構(gòu)成，其中氫氧化鋁佐劑應(yīng)用最為廣泛［2-3］。目前，氫氧化鋁佐劑如何發(fā)揮其作用機(jī)制尚未完全明確，其中促進(jìn)抗體產(chǎn)生的主要機(jī)制為儲(chǔ)存庫(kù)效應(yīng)、促吞噬效應(yīng)和免疫刺激效應(yīng)。影響氫氧化鋁佐劑免疫應(yīng)答反應(yīng)的因素包括抗原佐劑的吸附率、吸附強(qiáng)度、佐劑顆粒大小及均一性，佐劑的劑量及抗原的性質(zhì)等［4］，其中，佐劑顆粒大小可影響對(duì)抗原的提取、轉(zhuǎn)運(yùn)及與抗原相互作用［5-7］。與傳統(tǒng)佐劑相比，納米佐劑顆粒更小，比表面積更大，表面能更高、催化和吸附能力更強(qiáng)［8］。納米鋁佐劑在輔佐HBsAg方面優(yōu)于傳統(tǒng)佐劑，能快速激活和提高體液及細(xì)胞免疫水平。從免疫學(xué)觀點(diǎn)來(lái)看，納米佐劑均一性好，包裹或吸附的抗原顆粒可作為巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞首選目標(biāo)，可有效刺激免疫反應(yīng)［9］，且納米佐劑可降低不良反應(yīng)發(fā)生率。

商品化鋁佐劑可采用氨水法或氫氧化鈉法制備得到，其中氨水法反應(yīng)較為溫和，制備的鋁佐劑均一性較好，但需增加去除氨根步驟，與氫氧化鈉法相比，工藝操作更為復(fù)雜，但氫氧化鈉法反應(yīng)更為劇烈，過(guò)程控制難度大，且更易形成聚集性大顆粒［10］。因此，本研究通過(guò)優(yōu)化現(xiàn)有佐劑配制工藝，增加過(guò)程控制手段，以獲得納米級(jí)佐劑，并對(duì)比不同粒徑大小佐劑的質(zhì)量屬性，為納米級(jí)氫氧化鋁佐劑的生產(chǎn)及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原液 白喉類毒素原液、破傷風(fēng)類毒素原液及無(wú)細(xì)胞百日咳原液由北京生物制品研究所有限責(zé)任公司菌苗室提供。

1.2 主要試劑及儀器 結(jié)晶氯化鋁和氫氧化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；激光粒度分析儀Mastersizer3000和Zetasizer Nano購(gòu)自英國(guó)Malvern公司；FiveEasy Plus FE28pH計(jì)購(gòu)自美國(guó)METTLER TOLEDO公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；UV-1990紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自日本Shimadzu公司；電鏡掃描由中科百測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行。

1.3 氫氧化鋁佐劑的配制及后處理 配制40%的氫氧化鈉溶液，提前預(yù)熱至70℃左右，將80%的氯化鋁溶液加入反應(yīng)器內(nèi)，攪拌均勻后維持反應(yīng)溫度為70℃并維持150～200 r／min攪拌轉(zhuǎn)速，按照500 mL／min的速度向氯化鋁溶液中滴加氫氧化鈉溶液。過(guò)程取樣檢測(cè)pH值，當(dāng)反應(yīng)體系pH接近5.6左右時(shí)降低滴加速度，試驗(yàn)過(guò)程分別設(shè)定不同反應(yīng)終點(diǎn)pH為5.8、6.2左右，其中低pH組（5.8左右）為Ⅰ組，高pH組（6.2左右）為Ⅱ組。到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)將反應(yīng)器內(nèi)液體取出20 L，分別放入兩個(gè)立瓶?jī)?nèi)，其中一瓶（10 L）進(jìn)行高溫高壓滅菌，滅菌溫度121℃，滅菌時(shí)間30 min；另一瓶（10 L）室溫放置。Ⅰ組所得佐劑樣品編號(hào)為A、B、C，Ⅱ組所得佐劑樣品編號(hào)為D、E、F。

1.4 無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗半成品配制 按照無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗配制工藝，將鋁佐劑B、D稀釋至一定濃度（成品氫氧化鋁含量為1.3 mg／mL）后進(jìn)行滅菌處理，降溫至20℃左右吸附白喉類毒素原液、破傷風(fēng)類毒素原液及無(wú)細(xì)胞百日咳原液，每種抗原加入后攪拌不少于10 min后加入下一種抗原，所有抗原加入后調(diào)節(jié)pH至6.2～6.5，并定容至所需體積，攪拌不少于10 min，分別得到半成品1和半成品2。

1.5 粒徑分布檢測(cè) 利用激光粒度分析儀測(cè)定顆粒粒徑分布，通過(guò)控制添加樣品的量，使遮光度達(dá)5%～15%之間后進(jìn)行檢測(cè)。其中Mastersizer3000用于微米級(jí)顆粒的測(cè)定，Zetasizer Nano用于納米級(jí)顆粒的測(cè)定。

1.6 佐劑吸附率（BSA）及沉降率檢測(cè)

1.6.1 吸附率 按照《中國(guó)藥典》三部（2020版）方法進(jìn)行。鋁含量（1 mg）相同的佐劑分別吸附含量不同的BSA（0.8、1.6、4、8、12 mg）1 h，離心取上清，采用Lowry法測(cè)定上清中游離BSA含量，與加入的BSA總量比較，并計(jì)算不同佐劑對(duì)BSA的吸附率；除吸附率外，記錄BSA加入量為12 mg經(jīng)吸附后上清中游離BSA含量，即為上清蛋白含量；按照文獻(xiàn)［11］方法測(cè)定吸附能力。

1.6.2 沉降率 在鋁含量相同的情況下，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.2，將樣品充分振搖均勻后取50 mL加至燒杯中，靜置24 h，根據(jù)析出的上清液量，計(jì)算供試品的沉降率。

1.7 佐劑zeta電位的檢測(cè) 在室溫條件下取樣品10 mL，pH調(diào)節(jié)至6.0，使用Zetasizer Nano檢測(cè)zeta電位，每個(gè)樣品檢測(cè)3次后取平均值，為最終報(bào)告內(nèi)zeta電位數(shù)據(jù)。

1.8 佐劑的掃描電鏡觀察 取佐劑B、D，經(jīng)9 379×g離心30 min，棄上清，沉淀用純化水繼續(xù)洗滌2次，烘干后進(jìn)行掃描電鏡觀察。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件Minitab，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 佐劑的pH變化情況 室溫放置24 h后，兩組氫氧化鋁佐劑的pH均有下降趨勢(shì)，兩組佐劑pH變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.57，P=0.624）；121℃滅菌后，pH發(fā)生較為明顯的變化，兩組佐劑pH變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.34，P=0.018）。見(jiàn)表1。

表1 兩組佐劑室溫放置及滅菌后的pH變化Tab.1 Changes of pH values of adjuvants in two groups after storage at room temperature and sterilization

2.2 佐劑的粒徑分布 Ⅰ組氫氧化鋁佐劑A、B、C的粒徑分布在100～200 μm之間，而Ⅱ組氫氧化鋁佐劑D、E、F的粒徑分布在39～67 nm之間，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.24，P=0.003）。見(jiàn)圖1、圖2和表2。

圖1 Ⅰ組氫氧化鋁佐劑A（A）、B（B）、C（C）的粒徑分布Fig.1 Particle size distribution of aluminum hydroxide adjuvants A（A），B（B）and C（C）in groupⅠ

圖2 Ⅱ組氫氧化鋁佐劑D（A）、E（B）、F（C）的粒徑分布Fig.2 Particle size distribution of aluminum hydroxide adjuvants D（A），E（B）and F（C）in groupⅡ

表2 兩組佐劑的粒徑分布Tab.2 Particle size distribution of adjuvants in two groups

2.3 佐劑的吸附率、沉降率及zeta電位 Ⅰ組與Ⅱ組氫氧化鋁佐劑的吸附率、BSA的吸附能力和zeta電位差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別為6.01、5.17和4.24，P分別為0.027、0.035和0.024），且Ⅱ組佐劑不發(fā)生沉降。見(jiàn)表3。

表3 兩組佐劑吸附率、沉降率及zeta電位的比較Tab.3 Adsorption rate，sedimentation rate and zeta potential of adjuvants in two groups

2.4 佐劑的掃描電鏡觀察 兩種佐劑的外觀存在差異，佐劑D顆粒更小，數(shù)量更多，見(jiàn)圖3。

圖3 鋁佐劑B（A）、D（B）的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy of alum adjuvants B（A）and D（B）

2.5 吸附抗原后半成品的粒徑分布 經(jīng)檢測(cè)，半成品1（鋁佐劑B吸附）的DV（10）、DV（50）和DV（90）均大于半成品2（鋁佐劑D吸附），見(jiàn)圖4和表4。

表4 不同半成品的粒徑分布（μm）Tab.4 Particle size distribution of various final bulks（μm）

圖4 半成品1（A）和2（B）的粒徑分布Fig.4 Particle size distribution of final bulks 1（A）and 2（B）

3 討論

本研究采用傳統(tǒng)的氯化鋁與氫氧化鈉反應(yīng)的方法制備氫氧化鋁佐劑，表明在較低pH條件下配制，并采用立即滅菌的方式對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行處理可得到均一性較好的納米佐劑。兩種方法制備的佐劑理化性質(zhì)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與高pH條件下配制的氫氧化鋁佐劑相比，此方法所得佐劑具有較小的粒徑分布、吸附能力更強(qiáng)、不發(fā)生沉降，且zeta電位更高，掃描電鏡觀察可見(jiàn)，兩種方法制備的佐劑外觀不同。對(duì)疫苗用佐劑來(lái)說(shuō)，此種處理方式利于佐劑使用過(guò)程中微生物控制，且可增加佐劑的保存時(shí)限。按照原無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗配制工藝進(jìn)行配制后檢測(cè)粒徑分布，兩種佐劑吸附抗原后的粒徑分布存在差異。

配制過(guò)程中，在pH達(dá)5.7之前（此時(shí)溶液中OH／Al約為2.93），變化趨勢(shì)較為緩慢，膠體的外觀及黏度均緩慢變化，達(dá)到拐點(diǎn)時(shí)，pH增長(zhǎng)較快，黏度也急劇增加，且該體系的外觀從懸浮液轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)。在pH曲線拐點(diǎn)之前，氫氧根與鋁離子結(jié)合，因此對(duì)pH影響較?。贿_(dá)到拐點(diǎn)后，氫氧根以游離的形式存在于溶液中，因此氫氧化鈉的加入對(duì)pH影響較大。

氫氧化鋁為弱晶型的勃姆石，其具有無(wú)定型的表面結(jié)構(gòu)。在氫氧化鋁老化（室溫放置）或高溫高壓滅菌過(guò)程中會(huì)有序化［10］，使其轉(zhuǎn)變成更穩(wěn)定的多晶型物。主要原因是在老化或高溫高壓過(guò)程中水合鋁化合物順序的去質(zhì)子化及脫水反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程如下［12］：Al（OH2）63+→Al（OH）（OH2）52++H+；2Al（OH）（OH2）52+→Al2（OH）2（OH2）84++H2O，上述反應(yīng)使鋁離子之前形成羥基橋，而羥基橋的形成可使無(wú)定型的氫氧化鋁向結(jié)晶形式轉(zhuǎn)換，同時(shí)生成質(zhì)子，使pH降低。同時(shí)，如在鋁鹽溶液中繼續(xù)加入堿液，Al2（OH）2（OH2）84+可生成不帶電荷的中性Al（H2O）3（OH）3相互聚集而沉淀。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，室溫放置約24 h及高溫高壓滅菌后，佐劑pH均降低，與室溫放置相比，高溫高壓后pH降低更多，因此可推斷，在高溫高壓過(guò)程中氫氧化鋁的去質(zhì)子化程度更高。同時(shí)，配制終點(diǎn)pH不同的佐劑相比，終點(diǎn)pH越高，pH變化值越小，原因可能是pH越高，反應(yīng)體系中陰離子越多，陰離子可通過(guò)結(jié)合羥基鋁化合物所帶陽(yáng)離子抑制去質(zhì)子化反應(yīng)，減少去質(zhì)子化反應(yīng)，進(jìn)而減少pH的降低。

在分散體體系中的膠體顆?？赡苌删酆象w而變成大顆粒沉淀，這種集合體如變成更緊密的聚合體，即為凝聚，形成凝聚的過(guò)程是不可逆的。當(dāng)膠體顆粒接近時(shí)，顆粒之間的障礙主要來(lái)自于靜電斥力，如顆粒有足夠高的靜電斥力，膠體相對(duì)穩(wěn)定，它們之間不會(huì)生成凝集。在佐劑去質(zhì)子化過(guò)程中，靜電斥力增加，因此可得到更穩(wěn)定的膠體顆粒，與此相對(duì)應(yīng)的現(xiàn)象為納米膠體不會(huì)出現(xiàn)沉降，且具有較高的zeta電位。

對(duì)APC提呈抗原來(lái)說(shuō)，抗原顆粒大小是重要因素，且合適的顆粒大小為10 μm左右［13-14］。對(duì)用本研究制備的氫氧化鋁佐劑吸附后的無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗進(jìn)行粒徑分布檢測(cè)，使用納米佐劑吸附后的粒徑分布更為均一，顆粒大?。―V50）接近10 μm，更有利于APC提呈作用而誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)。

根據(jù)ICHQ6B［15］要求，應(yīng)采用適宜的技術(shù)進(jìn)行生物技術(shù)產(chǎn)品和生物制品的質(zhì)量特性分析（包括理化結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)活性、免疫化學(xué)性質(zhì)、純度和雜質(zhì)的鑒別）。疫苗一般含有多種成分，如蛋白質(zhì)抗原、佐劑、賦形劑、穩(wěn)定劑等，各成分之間可形成復(fù)雜的相互作用，因此，應(yīng)將疫苗的特性、成分及結(jié)構(gòu)分析作為質(zhì)量控制的手段之一。無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗配制過(guò)程中多使用氫氧化鋁佐劑作為吸附劑，現(xiàn)有無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中包含效價(jià)、無(wú)菌檢查、pH值、滲透壓等項(xiàng)目，但未將粒徑分布納入質(zhì)量控制指標(biāo)。對(duì)于疫苗來(lái)說(shuō)，可能影響安全性和有效性的關(guān)鍵因素可能包括蛋白質(zhì)吸附及構(gòu)象，吸附后產(chǎn)品的粒徑分布和形態(tài)［3］。在疫苗生產(chǎn)過(guò)程中，成品粒徑分布既可表明生產(chǎn)工藝的批間一致性，又可指示產(chǎn)品的穩(wěn)定性，并可作為表征疫苗和疫苗成分的質(zhì)量屬性［16］。因此，后續(xù)可將粒徑分布作為理化性質(zhì)之一，納入無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗質(zhì)量控制范圍內(nèi)。