徐康維，郭航煒，李星星，謝瑩，權(quán)婭茹，趙慧，李長貴

中國食品藥品檢定研究院國家衛(wèi)生健康委員會生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標準化重點實驗室 國家藥品監(jiān)督管理局生物制品質(zhì)量研究與評價重點實驗室，北京 102629

流感病毒是一種重要的呼吸道病原體，能夠引起季節(jié)性流感和大流行流感，嚴重危害人類健康。季節(jié)性流感在全球每年造成5%～15%的人口感染，并導致300萬 ～500萬的嚴重病例和25萬 ～50萬的死亡病例［1］。接種流感疫苗是目前預防流感最有效的手段［2-4］。目前廣泛應(yīng)用的主要有流感病毒裂解疫苗、重組蛋白疫苗和冷適應(yīng)流感減毒活疫苗等［5-7］。其中冷適應(yīng)流感減毒活疫苗采用鼻腔噴霧方式進行接種，病毒在上呼吸道黏膜局部復制，不僅能誘導體液免疫產(chǎn)生IgG抗體，還能產(chǎn)生分泌型IgA抗體，形成預防感染的第一道防線［8］，并且能夠有效激發(fā)T細胞免疫，從而對不同的流感病毒毒株產(chǎn)生一定的交叉保護［9-11］。在前期研究中，本實驗室采用反向遺傳技術(shù)，以A／Ann Arbor／6／60（H2N2）冷適應(yīng)流感病毒內(nèi)部6基因為骨架，與PR8病毒HA、NA基因共同進行病毒拯救，制備了AAPR8冷適應(yīng)流感病毒疫苗株［12］。本研究對該疫苗株在小鼠中的免疫原性及保護效果進行評價。

1 材料與方法

1.1 病毒A／Puerto Rico／8／34（H1N1）株流感病毒（簡稱PR8流感病毒）、AA-PR8冷適應(yīng)流感病毒疫苗株（簡稱AA-PR8疫苗株）由中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室保存。

1.2 實驗動物9～11日齡SPF雞胚，購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；SPF級BALB／c小鼠，雌性，4～6周齡，體重13～15 g，由中國食品藥品檢定研究院提供，并在ABLS-2實驗室進行試驗操作，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0017，動物使用許可證號：SYXK（京）2017-0013。本實驗均以科研為目的進行小鼠的養(yǎng)殖和使用，且進行了實驗動物倫理審查［中檢動（福）第2022（B）004號］。

1.3 主要試劑及儀器HRP標記的山羊抗小鼠IgG購自北京義翹神州科技有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgA購自美國Abcam公司；BSA購自美國Sigma公司；Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；96孔酶標板購自美國Corning公司；酶標儀購自美國TECAN公司。

1.4 小鼠免疫 將AA-PR8疫苗株病毒濃度稀釋至106EID50／50 μL。采用異氟烷對BALB／c小鼠進行麻醉后，左右兩個鼻孔各滴入25 μL AA-PR8疫苗株進行免疫。第1次免疫后21 d，采用相同方法進行第2次免疫。陰性對照組左右兩個鼻孔各滴入25 μL PBS。分別于第1次免疫后0、7、14、21、28、35和42 d，各取5只小鼠，經(jīng)眼眶采血分離血清，處死后，用800 μL PBS灌洗小鼠肺臟，收集肺泡灌洗液。檢測血清和肺泡灌洗液中IgG和IgA抗體效價。

1.5 IgG和IgA抗體效價檢測 采用間接ELISA法。將AA-PR8疫苗株稀釋106倍后接種SPF雞胚，200 μL／枚，33℃孵箱培養(yǎng)48 h，收集尿囊液，采用蔗糖密度梯度離心進行純化，獲得純化的AAPR8病毒，用PBS將其稀釋200倍后，加入酶標板，100 μL／孔，4℃包被過夜；PBS-T（含0.25‰吐溫20的PBS）洗滌3次，加入封閉液（1%BSA，含0.25‰吐溫20的PBS），200 μL／孔，室溫封閉1 h。將小鼠血清用封閉液100倍稀釋后，2倍系列稀釋至12 800倍，加至封閉后的酶標板，100 μL／孔，以100倍稀釋的陰性小鼠血清作為對照；將小鼠肺泡灌洗液用封閉液10倍稀釋后，2倍系列稀釋至1 280倍，加至封閉后的酶標板，100 μL／孔，以10倍稀釋的陰性小鼠肺泡灌洗液作為對照，37℃培養(yǎng)箱孵育1.5 h；PBS-T洗滌3次，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1∶10 000稀釋）或山羊抗小鼠IgA（1∶10 000稀釋），37℃培養(yǎng)箱孵育1 h；PBS-T洗板5次，加入TMB顯色液，室溫顯色15 min；加入0.5 mol／L硫酸溶液終止反應(yīng)，讀取A450／630值。以陰性對照孔A450／630值的2.1倍作為Cut-off值，樣品A450／630值 ≥Cut-off值的最高稀釋倍數(shù)定為效價。IgG抗體效價低于100按50計算，IgA抗體效價低于10按5計算。

1.6 小鼠攻擊保護效果評價 將小鼠按照1.4項所述方式和劑量，采用1次免疫或0、14 d 2次免疫的程序，以PBS作為陰性對照。分別在第1和2次免疫后14 d將小鼠麻醉，采用5倍小鼠半數(shù)致死劑量（5 MLD50／50 μL）的PR8流感病毒左右兩個鼻孔各滴入25 μL進行攻擊。每組取6只小鼠每日觀察體重變化及死亡情況，共觀察14 d。每組取5只小鼠在攻擊后第3天處死取肺臟，加入9倍肺臟體積的Leibovitz′s L-15培養(yǎng)基勻漿后，接種雞胚檢測病毒滴度。

1.7 統(tǒng)計學分析 使用GraphPad Prism 8和Excel 2010軟件繪圖并進行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫后小鼠血清IgG抗體效價 小鼠第1次免疫后7 d，即可檢測到特異性IgG抗體，GMT為152；第14和21天抗體持續(xù)升高，GMT分別為230和264。第1次免疫后21 d進行加強免疫，抗體水平繼續(xù)升高，第2次免疫后7、14和21 d IgG抗體GMT分別達到348、919和1 056。2次免疫后均在14 d內(nèi)抗體效價增長較快，而21 d抗體效價較14 d僅略有增長。第2次免疫后抗體水平顯著高于第1次免疫后，其中第2次免疫后14 d IgG抗體GMT為第1次免疫后14 d的4倍。見圖1。

圖1 免疫后小鼠血清IgG抗體效價Fig.1 Serum IgG titer in immunized mice

2.2 免疫后小鼠肺泡灌洗液IgA抗體效價 小鼠第1次免疫后7 d，可檢測到特異性IgA抗體，GMT為23；第14天GMT升高至211，而在第21天GMT降低為92。第1次免疫后21 d進行加強免疫，第2次免疫后7 d GMT為53，未見升高，第14天GMT升高至368，第21天GMT降低為160。2次免疫后IgA抗體效價均在第14天達到最高值，第21天較第14天降低。第2次免疫后同時間抗體水平均高于第1次免疫后，第2次免疫后14 d IgA抗體GMT為第1次免疫后的14 d的1.7倍。見圖2。

圖2 免疫后小鼠肺泡灌洗液IgA抗體效價Fig.2 Titers of IgA in alveolar lavage fluid of immunized mice

2.3 攻擊后小鼠死亡及體重變化情況 小鼠1次免疫后14 d，采用PR8流感病毒進行攻擊，攻擊后第9天，陰性對照組6只小鼠全部死亡，攻擊后第8天，免疫組6只小鼠死亡1只，保護率為83.33%（5／6），見圖3A。對照組小鼠攻擊后體重持續(xù)降低，至攻擊后第8天，體重降低達25%，而免疫組小鼠在攻擊后7 d內(nèi)體重降低，第7天體重平均降低14%，之后逐漸增長，至攻擊后第14天恢復至97%攻擊前體重。見圖3B。

0、14 d對小鼠進行2次免疫，第2次免疫后14 d，采用PR8流感病毒進行攻擊，攻擊后第8天，陰性對照組6只小鼠全部死亡，而免疫組6只小鼠全部健存，保護率為100%（6／6），見圖3C。陰性對照組小鼠攻擊后體重持續(xù)降低，至攻擊后第7天，體重降低達24%。而免疫組小鼠在攻擊后前3 d體重降低，第3天體重平均降低2%，之后逐漸增長，在攻擊后第5天體重恢復至攻擊前水平，見圖3D。

圖3 PR8流感病毒攻擊后小鼠存活率及體重變化Fig.3 Survival rate and bodyweight change of mice challenged with PR8 influenza virus

續(xù)圖3 PR8流感病毒攻擊后小鼠存活率及體重變化Fig.3（Continued）Survival rate and bodyweight change of mice challenged with PR8 influenza virus

2.4 攻擊后小鼠肺臟病毒載量 免疫1次后攻擊，免疫組小鼠肺臟病毒載量平均值為2.30 lgEID50／g，陰性對照組小鼠為6.01 lgEID50／g，免疫后病毒載量較陰性對照組降低5 128倍（t=19.35，P＜0.000 1）。免疫2次后攻擊，免疫組5只小鼠肺臟中均未檢測到病毒，而陰性對照組小鼠病毒載量為5.82 lgEID50／g（t=36.61，P＜0.000 1）。見圖4。

圖4 攻擊后小鼠肺臟病毒載量Fig.4 Lung viral loads of mice after challenge

3 討論

流感病毒裂解疫苗為目前應(yīng)用最為廣泛的流感疫苗，通過肌肉注射方式接種，使人體產(chǎn)生血清IgG為主的保護性抗體，通常以血凝抑制或微量中和試驗方法進行檢測［13］。冷適應(yīng)流感減毒活疫苗采用鼻腔噴霧方式進行接種，病毒能夠在溫度較低的上呼吸道進行復制，而在溫度較高的下呼吸道不能復制，產(chǎn)生有限程度的感染。相比于裂解疫苗，冷適應(yīng)疫苗的血凝抑制抗體效價較低，但能夠誘導產(chǎn)生分泌型IgA抗體發(fā)揮對機體的保護作用［8］。動物實驗通常采用小鼠模型［14-16］，因此，本研究對小鼠進行免疫后，采用靈敏度較高的間接ELISA法檢測小鼠血清IgG和肺泡灌洗液IgA抗體效價，對AA-PR8冷適應(yīng)流感病毒疫苗株在小鼠中的免疫原性進行評價。結(jié)果顯示，小鼠第1次免疫后7 d，即可檢測到血清IgG抗體，第14和21天抗體效價持續(xù)升高；加強免疫后，IgG抗體效價進一步升高，第2次免疫后21 d GMT約達到第1次免疫后21 d的4倍。第1次免疫后7 d，小鼠肺泡灌洗液同樣可檢測到IgA抗體，第14天GMT達到最高，而第21天GMT降低至約14 d的1／2；第2次免疫后14 d GMT約為第1次免疫后14 d的1.5倍，第21天GMT再次降低至約14 d的1／2，表明IgA抗體的持久性較IgG差。

本研究還評價了AA-PR8疫苗株在小鼠中對同株流感流感病毒的保護作用，采用1次免疫或0、14 d 2次免疫的程序，免疫后14 d用5倍半數(shù)致死劑量的PR8流感病毒進行攻擊。結(jié)果顯示，1次免疫即可使83.33%的小鼠獲得保護，體重降低幅度明顯低于陰性對照組，且在攻擊后第3天，肺臟病毒載量較陰性對照組降低約5 000倍。2次免疫程序保護率為100%，全部小鼠在經(jīng)受致死劑量病毒攻擊后存活，攻擊后前3 d體重僅降低2%，第5天即恢復至攻擊前水平；攻擊后第3天，肺臟中未檢測到流感病毒，表明已完全阻斷了PR8流感病毒對小鼠下呼吸道的侵襲。

綜上所述，AA-PR8疫苗株能夠激發(fā)小鼠體液免疫和黏膜免疫，具有良好的免疫原性，且能夠保護小鼠在經(jīng)受致死劑量的同株流感流感病毒攻擊后存活，可作為冷適應(yīng)流感減毒活疫苗的候選疫苗株。