田家俊，夏燕，李玉玲，任雪，謝金芳，王南平，黃曉飛，曹春雨

1.三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443002；2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000

Tn5蛋白最初由BERG等［1］在大腸埃希菌卡那霉素抗性基因研究中發(fā)現(xiàn)，其編碼DNA序列約5 800 bp，由核心序列和兩條倒置的IS50序列（IS50R，IS50L）組成。Tn5轉(zhuǎn)座酶能以其IS50序列的倒置末端結(jié)合到供體基因的轉(zhuǎn)座子序列末端，并形成由一個(gè)二聚體Tn5轉(zhuǎn)座酶和兩分子DNA組成的聯(lián)會(huì)復(fù)合體［2］，由此獲得切割和連接雙鏈DNA的活性，并通過(guò)剪切和粘貼機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)供體基因的轉(zhuǎn)座作用［3-4］。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)野生型Tn5蛋白的轉(zhuǎn)座酶IS50R結(jié)構(gòu)域進(jìn)行E54K、M56A和L372P 3個(gè)點(diǎn)突變，可獲得具有體外轉(zhuǎn)座活性的Tn5轉(zhuǎn)座酶［5-6］。Tn5轉(zhuǎn)座酶的剪切和粘貼機(jī)制已廣泛應(yīng)用于功能基因組學(xué)研究［7-10］，如ATAC-seq技術(shù)使用Tn5轉(zhuǎn)座酶組裝形成帶有測(cè)序接頭的轉(zhuǎn)座復(fù)合體，通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域的DNA雙鏈進(jìn)行剪切和連接測(cè)序接頭引物，獲得染色質(zhì)開(kāi)放區(qū)域DNA的測(cè)序文庫(kù)［11-13］。CUT&Tag是新近開(kāi)發(fā)的染色質(zhì)結(jié)合蛋白鑒定技術(shù)，該技術(shù)利用Tn5轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座作用和葡萄球菌蛋白A（staphylococcal protein A，SPA）對(duì)抗體的結(jié)合作用，通過(guò)制備一種PA和Tn5轉(zhuǎn)座酶的融合蛋白，即可將Tn5轉(zhuǎn)座酶與目的蛋白抗體結(jié)合。這種帶有目的蛋白抗體的Tn5轉(zhuǎn)座酶可在抗體介導(dǎo)下，特異性地將目的蛋白附近的開(kāi)放染色質(zhì)DNA片段切割并連接測(cè)序接頭，從而可檢測(cè)基因組范圍內(nèi)組蛋白修飾酶、RNA聚合酶Ⅱ和轉(zhuǎn)錄因子等結(jié)合的染色質(zhì)區(qū)域［14-16］。

本研究旨在通過(guò)分子生物學(xué)方法獲得帶有Flag標(biāo)簽的PA-Tn5轉(zhuǎn)座酶，為進(jìn)一步探索Tn5轉(zhuǎn)座在功能基因組學(xué)研究中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌株 質(zhì)粒pTXB1-Tn5購(gòu)自美國(guó)Addgene公司；大腸埃希菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 幾丁質(zhì)樹(shù)脂購(gòu)自New England Biolabs（北京）有限公司；DNA限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA及蛋白質(zhì)分子量marker購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；氨芐青霉素購(gòu)自北京華美生科生物技術(shù)有限公司；其他分析純生化試劑購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；BG-gds AUTO320紫外凝膠成像儀購(gòu)自北京百晶生物技術(shù)有限公司；SLPe超聲波細(xì)胞破碎儀購(gòu)自美國(guó)BRANSON公司；3300 mini化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 在NCBI（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）網(wǎng)站中查找SPA的編碼序列（NC_016941.1），合成雙鏈互補(bǔ)的5′端帶有XbaⅠ和3′端帶有NdeⅠ黏性酶切末端的Flag-pA編碼DNA序列（Flag編碼序列：5′-GATTACAAGGATGACGACGATAAG-3′），由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。用XbaⅠ和NdeⅠ酶切消化質(zhì)粒pTXB1-Tn5，瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收得到帶有黏性末端的線性化pTXB1-Tn5載體；將上述插入片段和線性化載體用T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100 μg／mL氨芐青霉素的瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)。提取pTXB1-Flag-pA-Tn5重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，并送蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 重組Flag-pA-Tn5蛋白的原核表達(dá) 將重組表達(dá)質(zhì)粒pTXB1-Flag-pA-Tn5轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布含100 μg／mL氨芐青霉素的瓊脂平板，次日挑取單克隆，接種于3 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r／min振蕩培養(yǎng)16 h；取500 μL菌液，轉(zhuǎn)接至10 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，擴(kuò)大培養(yǎng)4 h至A600達(dá)0.6時(shí)，再次轉(zhuǎn)接至1 L含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r／min培養(yǎng)4 h至A600達(dá)0.6，放置降溫至10℃；加入IPTG至終濃度為0.5 mmol／L，28℃，220 r／min誘導(dǎo)16 h；4℃，13 776×g離心15 min，收集菌體，10% SDS-PAGE結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色分析目的蛋白的表達(dá)。

1.5 重組Flag-pA-Tn5蛋白的分離純化 菌體用80 mL HEGX溶液［20 mmol／L HEPES-KOH（pH 7.2），0.8 mol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，10%甘油，0.2%Triton X-100，1 mmol／L PMSF］充分重懸后，置于冰上，用超聲儀進(jìn)行超聲破碎（超聲破碎15 s，停5 s，記為1個(gè)循環(huán)，持續(xù)20個(gè)循環(huán)）；將超聲裂解液于4℃，30 996×g離心30 min，吸取上清液，置于100 mL燒杯中，將燒杯置于磁力攪拌器上邊攪拌邊逐滴加入2.1 mL 10%聚乙烯亞胺；將上述溶液于4℃，19 837×g離心10 min，取上清液，4℃保存。取5 mL幾丁質(zhì)樹(shù)脂填充于柱子中，加入5倍柱床體積的HEGX溶液平衡柱床，平衡結(jié)束后將預(yù)處理過(guò)的樣品過(guò)柱，用200 mL HEGX溶液洗滌柱子，再用12 mL目的蛋白洗脫液［20 mmol／L HEPES-KOH（pH 7.2），0.8 mol／L NaCl，1 mmol／L EDTA，10%甘油，0.2% Triton X-100，100 mmol／L DTT］快速流過(guò)柱床，待液面與柱床相切時(shí)依次堵住下方液體流出口和上方加樣口。將柱子置于4℃冰箱孵育48 h，用目的蛋白洗脫液洗脫。純化后的蛋白用2×dialysis buffer［10 mmol／L HEPESKOH（pH 7.2），0.2 mol／L NaCl，0.2 mmol／L EDTA，20%甘油，0.2% Triton X-100，2 mmol／L DTT］進(jìn)行透析復(fù)性，每12 h換1次透析液。10%SDS-PAGE結(jié)合考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)目的蛋白的純化。

1.6 重組Flag-pA-Tn5蛋白的Western blot鑒定將純化后的蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE分離后，采用電轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h；TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶3 000稀釋?zhuān)?，室溫孵? h；TBST漂洗后ECL法顯影，化學(xué)發(fā)光成像儀拍照記錄結(jié)果。

1.7 重組Flag-pA-Tn5蛋白的酶活性鑒定 按照PI CELLI等［17］的方法，取純化后透析復(fù)性的重組FlagpA-Tn5蛋白，與含測(cè)序引物接頭的轉(zhuǎn)座子DNA片段組裝為轉(zhuǎn)座體［15］。取100 ng人外周血白細(xì)胞基因組DNA（宜昌市中心血站提供）和4 μL 5×TAPSDMF緩沖液［50 mmol／L TAPS-NaOH（pH 8.5），25 mmol／L MgCl2，50% DMF］，分別加入不同稀釋比例（1∶1、1∶2.5、1∶5、1∶10、1∶25、1∶50）的轉(zhuǎn)座體各1 μL，用無(wú)菌去離子水補(bǔ)足體積至20 μL，混勻，55℃孵育7 min；加入5 μL 0.2% SDS，室溫孵育7 min終止反應(yīng)。取5 μL轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，以接頭序列為引物（正向引物：5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAGCGCTAGACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3′，反向引物：5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-3′）進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pTXB1-Flag-pA-Tn5經(jīng)XbaⅠ和NdeⅠ雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分析可見(jiàn)大小約7 700和640 bp的條帶，大小與預(yù)期相符，見(jiàn)圖1。測(cè)序結(jié)果表明，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pTXB1-Flag-pA-Tn5的雙酶切（XbaⅠ／NdeⅠ）鑒定Fig.1 Restriction map of recombinant prokaryotic expression plasmid pTXB1-Flag-pA-Tn5（XbaⅠ／NdeⅠ）

2.2 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定10% SDS-PAGE分析顯示，經(jīng)終濃度0.5 mmol／L IPTG于28℃誘導(dǎo)16 h，可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約100 000的新蛋白條帶，大小與帶有內(nèi)含肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域的重組Flag-pA-Tn5蛋白一致，見(jiàn)圖2。

圖2 重組Flag-pA-Tn5蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE profile of recombinant Flag-pA-Tn5 protein

2.3 純化產(chǎn)物的鑒定10% SDS-PAGE分析顯示，目的蛋白洗脫液在相對(duì)分子質(zhì)量約85 000處可見(jiàn)一條清晰的蛋白條帶，大小與Flag-pA-Tn5蛋白一致，重組蛋白產(chǎn)量為211.1 μg／mL，純度為84%，見(jiàn)圖3。

圖3 純化的重組Flag-pA-Tn5蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE profile of purified recombinant Flag-pATn5 protein

通過(guò)檢測(cè)雜蛋白洗脫液的吸光度值發(fā)現(xiàn)，洗脫液中蛋白含量隨洗脫體積增加而逐漸減少，并最后趨于0，見(jiàn)圖4A；當(dāng)結(jié)束DTT孵育洗脫目的蛋白時(shí)，洗脫液中的目的蛋白含量呈先上升后逐漸下降的趨勢(shì)，見(jiàn)圖4B，提示本實(shí)驗(yàn)在純化過(guò)程中洗脫雜蛋白和洗脫目的蛋白時(shí)均較徹底。

圖4 雜蛋白和目的蛋白的洗脫峰Fig.4 Elution peaks of foreign and target proteins

2.4 重組Flag-pA-Tn5蛋白的Westernblot鑒定Western blot分析顯示，在相對(duì)分子質(zhì)量約85 000處可見(jiàn)清晰目的條帶，大小與Flag-pA-Tn5預(yù)期相符，見(jiàn)圖5。

圖5 重組Flag-pA-Tn5蛋白的Western blot鑒定Fig.5 Western blotting of recombinant Flag-pA-Tn5 protein

2.5 重組Flag-pA-Tn5蛋白的酶活性 本實(shí)驗(yàn)獲得的重組Flag-pA-Tn5蛋白與含測(cè)序引物接頭的轉(zhuǎn)座子DNA片段組裝后，具有切割雙鏈DNA的活性，其酶活性在一定范圍內(nèi)隨著轉(zhuǎn)座酶稀釋倍數(shù)的增加而減弱，見(jiàn)圖6。取此酶的轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物，以測(cè)序接頭引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可得到250～2 000 bp的DNA片段。在稀釋比例1∶1～1∶10范圍內(nèi)，該DNA片段大小范圍隨著轉(zhuǎn)座酶稀釋倍數(shù)的增加而增大，產(chǎn)物量則呈減少趨勢(shì)，見(jiàn)圖7。表明本實(shí)驗(yàn)制備的重組Flag-pA-Tn5蛋白具有轉(zhuǎn)座酶活性。

圖6 重組Flag-pA-Tn5蛋白的酶活性分析Fig.6 Analysis of enzyme activity of recombinant Flag-pATn5 protein

圖7 轉(zhuǎn)座反應(yīng)產(chǎn)物的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.7 Electrophoretic profile of transposition reaction product amplified by PCR

3 討論

制備文庫(kù)是下一代測(cè)序的關(guān)鍵步驟，利用Tn5轉(zhuǎn)座酶對(duì)雙鏈DNA的切割和標(biāo)記機(jī)制可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定且高效的測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建［18-20］。使用PA標(biāo)記Tn5轉(zhuǎn)座酶進(jìn)行CUT&Tag實(shí)驗(yàn)，一方面不需要甲醛交聯(lián)目的蛋白和DNA復(fù)合體，有利于分離完整的細(xì)胞核；另一方面利用PA與抗體Fc段的結(jié)合，通過(guò)抗體識(shí)別、結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子和組蛋白修飾酶等染色質(zhì)結(jié)合蛋白，可引導(dǎo)Tn5轉(zhuǎn)座酶對(duì)特定區(qū)域DNA序列進(jìn)行標(biāo)記，從而以更高的分辨率和更低的背景噪聲分析特定蛋白因子對(duì)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響［21-22］。FACT-seq技術(shù)利用PA-Tn5轉(zhuǎn)座酶對(duì)石蠟包埋組織樣本進(jìn)行測(cè)序，探尋人結(jié)直腸癌和人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織中的特異性超級(jí)增強(qiáng)子［23］。ACT-seq技術(shù)利用PA-Tn5轉(zhuǎn)座酶在單細(xì)胞水平上繪制組蛋白修飾、組蛋白變異和染色質(zhì)結(jié)合蛋白的全基因組分布［24］。WANG等［25］在CUT&Tag實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行擴(kuò)展，設(shè)計(jì)出同樣利用PA-Tn5轉(zhuǎn)座酶的具有高通量特性和普適性的方法CoBATCH。該技術(shù)通過(guò)兩次添加不同的接頭引物分選捕獲更多的單細(xì)胞DNA片段，利用該方法首次解析了小鼠胚胎多個(gè)器官的內(nèi)皮細(xì)胞譜系發(fā)育、分化和功能的異質(zhì)性。因此，獲得PA-Tn5轉(zhuǎn)座酶有望拓展Tn5轉(zhuǎn)座酶在功能基因組學(xué)中的應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)中原核表達(dá)的Tn5轉(zhuǎn)座酶C-端帶有內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，實(shí)驗(yàn)中采用幾丁質(zhì)樹(shù)脂柱親和層析法對(duì)表達(dá)菌中的重組Flag-pA-Tn5蛋白進(jìn)行純化。目的蛋白上的內(nèi)含肽-幾丁質(zhì)結(jié)合域能與幾丁質(zhì)樹(shù)脂柱結(jié)合，而雜蛋白因無(wú)法與柱子結(jié)合而流出柱床。當(dāng)還原劑DTT存在時(shí)，內(nèi)含肽與目的蛋白之間的肽鍵斷裂，經(jīng)緩沖液洗脫即可得到目的蛋白。因此，純化得到的全長(zhǎng)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量會(huì)低于誘導(dǎo)表達(dá)后的內(nèi)含肽融合蛋白。但純化的重組蛋白濃度不高，后續(xù)將對(duì)試驗(yàn)方法進(jìn)行優(yōu)化，以提高重組蛋白的濃度和純度。由于獲得的重組蛋白含有PA片段，其可直接與抗體Fc段結(jié)合，因此，將IPTG誘導(dǎo)前后的表達(dá)菌和純化蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜后直接與HPR標(biāo)記的二抗孵育，對(duì)純化產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。轉(zhuǎn)座酶具有體外剪切和連接DNA的活性，本實(shí)驗(yàn)將重組Flag-pA-Tn5蛋白與人外周血白細(xì)胞基因組DNA共孵育，檢測(cè)其轉(zhuǎn)座酶活性。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pTXB1-Flag-pA-Tn5，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)和幾丁質(zhì)樹(shù)脂柱純化，獲得了具有良好轉(zhuǎn)座酶活性的Flag-pA-Tn5轉(zhuǎn)座酶，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新的基因功能組學(xué)研究方法奠定了基礎(chǔ)。