汪夢俊，安歡歡，田宇璇，劉睿倫，張小宇，吳杰，郭靖，申碩

武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室，湖北 武漢 430207

截至目前為止，SARS-CoV-2全球累計感染病例已近6億人次，并出現(xiàn)多種如α、β、γ等值得關(guān)注的突變株（variants of concern，VOC），對人類生命健康安全及公共衛(wèi)生事業(yè)造成極大威脅［1］?，F(xiàn)有研究表明，非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structure protein，NSP）在病毒的變異及傳播過程中發(fā)揮重要作用［2］。NSP是病毒復(fù)制過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，但不作為病毒顆粒組分存在的蛋白，通常具有RNA復(fù)制、修飾、校對等活性［3-5］。SARS-CoV-2共包含16個NSP［6］，其中，非結(jié)構(gòu)蛋白1（NSP1）是SARS-CoV-2編碼的第1個NSP［7］，在病毒感染細胞后，能夠與宿主細胞核糖體40S小亞基結(jié)合，介導(dǎo)宿主mRNA 5′-非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）附近的區(qū)域被核酸內(nèi)切酶酶切［8］，而由于病毒mRNA存在1個5′-端前導(dǎo)序列，使得病毒自身mRNA避免被切割［9］。在對SARS-CoV-2的研究中，NSP1與核糖體40S小亞基之間的相互作用已被證明與其第164位賴氨酸殘基（K164）高度相關(guān)［10］。而反向遺傳學(xué)試驗也證明，SARS-CoV-2 NSP1 C-端結(jié)構(gòu)域與α-干擾素的mRNA降解有關(guān)［11］。

然而，目前對NSP1結(jié)構(gòu)及功能的認識相對不足，如NSP1如何與其本身mRNA保守的5′-UTR相互作用，從而避免自身mRNA降解的機制仍不清楚［12］。而研究NSP1在SARS-CoV-2復(fù)制過程中的具體作用機制可為SARS-CoV-2抗病毒藥物研發(fā)、減毒位點發(fā)掘及感染后治療提供更為可靠的方向和途徑［13］。同時，檢測SARS-CoV-2滅活疫苗生產(chǎn)過程中NSP1含量的變化，還可為滅活疫苗生產(chǎn)提供1個質(zhì)量監(jiān)控指標。因此，本研究制備了NSP1兔抗血清，旨在為SARS-CoV-2 NSP1功能的進一步研究及滅活疫苗質(zhì)量監(jiān)控方法的確立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞、載體及樣品E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞購自日本TaKaRa公司；Vero細胞、帶有GST標簽的原核表達載體pGEX-6p-1及帶有eGFP標簽的pcDNA3.1為武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室保存，RD細胞由該公司質(zhì)量控制部門提供，SARS-CoV-2滅活疫苗生產(chǎn)過程中的細胞裂解液及純化病毒顆粒樣品由該公司新發(fā)傳染病疫苗室提供，SARS-CoV-2 S、N、M、E蛋白兔抗血清為該公司病毒性疫苗研究一室制備［14］。

1.2 主要試劑及儀器DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒及DNA清潔試劑盒購自德國QIAGEN公司；DNA聚合酶Phanta?及無縫連接試劑盒Clon ExpressⅡ購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、XhoⅠ購自美國NEB公司；T4 DNA連接酶、BCA試劑盒、PageRuler Plus預(yù)染蛋白marker（26619）、轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自美國Thermo公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；鼠抗eGPF單抗購自美國Abcam公司；HRP標記的兔抗鼠IgG、HRP標記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑購自美國Sigma-Aldrich公司；ImmobilonTM Western購自美國Millipore公司；SDS細胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；加強型膜再生液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；eBlotTML1快速濕轉(zhuǎn)儀購自南京金斯瑞生物科技有限公司。

1.3 實驗動物 普通級日本大耳白兔，雄性，3月齡，體重2.0～2.5 kg，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司實驗動物中心提供，動物合格證號：4200-0400011459。本實驗均以科研為目的進行大耳白兔的養(yǎng)殖和使用，且按照動物倫理相關(guān)規(guī)定進行（WIBPAII382021002）。

1.4 引物設(shè)計及合成 根據(jù)SARS-CoV-2武漢株全基因序列（NC_045512），通過ProteinHomology／analog Y Recognition Engine V 2.0對NSP1親水性進行分析后，選取NSP1全段作為抗原序列。同時，經(jīng)引物設(shè)計在目的基因兩端插入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位點及相應(yīng)的保護堿基，引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 載體構(gòu)建相關(guān)引物Tab.1 Primers for vector construction

1.5 抗原制備及純化 以SARS-CoV-2 WIV04株基因組（MN996528.1，由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室提供）為模板，PCR擴增獲得相應(yīng)目的片段，經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，用相同酶酶切帶有GST標簽的pGEX-6p-1質(zhì)粒，將目的基因片段與線性化載體片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接，電轉(zhuǎn)至E.coli DH5α感受態(tài)細胞中，37℃過夜培養(yǎng)；挑取單菌落，利用引物pGEX-6p-1-Check-F、pGEX-6p-1-Check-R進行菌落PCR鑒定，鑒定正確的菌落提取質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pGEX-6p-1-GST-NSP1。

將質(zhì)粒pGEX-6p-1-GST-NSP1電轉(zhuǎn)至E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落，經(jīng)PCR鑒定后，于LA（LB+Amp）液體培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)，加入IPTG至終濃度為1 mmol／L，設(shè)不加誘導(dǎo)劑的對照組，37℃培養(yǎng)7 h；取5 mL菌液，進行8% SDSPAGE分析。

取200 mL菌液，15 000×g離心3 min；收集沉淀，用0.01 mol／L PBS（pH 7.2）重懸，冰水浴下100 W超聲破碎20 min；PBS重懸，重復(fù)破碎2次。分別收集第1次破碎上清及3次破碎后沉淀，進行8% SDS-PAGE分析。

取破碎后菌體沉淀，用8 mL PBS溶解，并加入2 mL 5×protein loading，100℃煮樣10 min變性；經(jīng)8%瓊脂糖凝膠電泳分離及電洗脫后，即獲得純化的目的蛋白。將純化后的目的蛋白置透析袋中，用0.01 mol／L PBS透析去離子，BCA蛋白濃度測定試劑盒進行檢測。將純化后蛋白稀釋至400 ng／mL，按500 μL／管分裝至1.5 mL EP管中，置-50℃冰箱凍存。

1.6 兔抗血清的制備 取2只日本大耳白兔，1只作為實驗組，以凍存的500 μL／管分裝的GSTNSP1為抗原；另1只作為對照組，以等體積的PBS作為抗原。將抗原與等體積（500 μL）弗氏完全佐劑充分振蕩乳化后，經(jīng)背部多點注射的方式進行初次免疫，200 ng／劑，之后每間隔14 d，與弗氏不完全佐劑等劑量乳化進行加強免疫，共免疫6次。收集全血血清，置37℃孵箱孵育2 h；6 500×g離心5 min；收集上清再次離心，重復(fù)2次，所得上清即為純化后的兔抗血清。按兔抗血清∶100%甘油∶PBS（10×）=10∶9∶1的比例混勻，分裝后置-50℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 兔抗血清的鑒定

1.7.1 純度 采用Western blot法。將純化后重組GST-NSP1蛋白經(jīng)8% SDS-PAGE分離后，eBlotTML1快速濕轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，5% BSA 4℃封閉過夜；加入各組血清（均1∶10 000稀釋），4℃孵育12 h；PBST洗滌，加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶10 000稀釋），室溫孵育45 min；PBST洗滌，化學(xué)發(fā)光儀掃描，保存圖片。

1.7.2 特異性 為進一步證明抗NSP1抗血清的特異性，采用人RD細胞瞬時表達、剪切和加工成熟的NSP1蛋白對抗血清進行特異性驗證。以上述構(gòu)建的帶有NSP的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NSP及質(zhì)粒pcDNA3.1為模板，利用pcDNA3.1-NSP1-eGFP載體構(gòu)建相應(yīng)引物對擴增帶有互補同源臂的NSP1（eGFP）及eGFP（NSP1）序列。同時通過EcoRⅠ、XhoⅠ37℃3 h酶切pcDNA3.1空載體，獲得長度5 366 bp的線性化載體片段。將對應(yīng)的帶有同源臂的NSP1和eGFP片段與線性化載體片段按摩爾比3∶3∶1混合后，經(jīng)Infusion-HD Enzyme 50℃反應(yīng)15 min，連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)至E.coli DH5α感受態(tài)細胞，利用在pcDNA3.1插入位點兩側(cè)設(shè)計的鑒定引物，對重組質(zhì)粒pcDNA3.1-NSP1-eGFP進行PCR鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。挑取鑒定及測序正確的保存菌種進行擴大培養(yǎng)。

用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，將提取的2.5 μg pcDNA3.1-NSP1-eGFP、pcDNA3.1-eGFP（陽性對照）及pcDNA3.1（陰性對照）質(zhì)粒分別于6孔板中轉(zhuǎn)染RD細胞（細胞密度60%～70%），轉(zhuǎn)染5 h后更換維持液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，觀察到明顯熒光，即NSP1-eGFP融合蛋白正確表達。用SDS-裂解液裂解轉(zhuǎn)染細胞，離心收集裂解上清，變性后按1.7.1項方法進行Western blot分析，顯色后用加強型膜再生液室溫洗滌5 min，用鼠抗eGFP單抗（1∶5 000稀釋）作為一抗，HRP標記的兔抗鼠IgG（1∶10 000稀釋）作為二抗，重新進行Western blot分析。

1.8 滅活疫苗細胞裂解液及純化病毒顆粒的鑒定取SARS-CoV-2滅活疫苗生產(chǎn)過程1～4 d的細胞裂解液及純化后的病毒顆粒樣品，變性后按1.7.1項方法，以SARS-CoV-2 S、N、M、E蛋白的兔抗血清作為一抗（1∶2 000稀釋），HRP標記的羊抗兔IgG作為二抗（1∶10 000稀釋），進行Western blot分析，以未感染SARS-CoV-2的Vero細胞為對照。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-GST-NSP1的鑒定GSTNSP1基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 221 bp的特異性條帶，大小與預(yù)期相符，見圖1，測序后與模板序列一致。表明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 GST-NSP1基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic profile of PCR product of GST-NSP1 gene

2.2 重組蛋白的鑒定 表達的重組GST-NSP1蛋白經(jīng)8% SDS-PAGE分析，相對分子質(zhì)量約45 300，對照組未見此條帶，表明質(zhì)粒pGEX-6p-1-GST-NSP1在E.coli BL21（DE3）中成功表達；超聲破碎后上清及沉淀經(jīng)8% SDS-PAGE分析，沉淀中目的蛋白含量明顯高于上清，主要以包涵體形式存在。見圖2。

圖2 表達（A）及純化的重組GST-NSP1蛋白（B）的SDSPAGE分析Fig.2 SDS-PAGE profile of expressed（A）and purifed（B）recombinant GST-NSP1

2.3 兔抗血清的鑒定

2.3.1 純度Western blot分析顯示，在相對分子質(zhì)量約45 300處可見特異性反應(yīng)條帶，且無雜帶，見圖3。表明兔抗血清純度良好。

圖3 兔抗血清純度的Western blot分析Fig.3 Western blotting of purity of rabbit antiserum

2.3.2 特異性

2.3.2.1 pcDNA3.1-NSP1-eGFP質(zhì)粒的鑒定NSP1-eGFP基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見1 840 bp的目的條帶，見圖4，表明目的基因已正確插入至目標位點。測序結(jié)果與質(zhì)粒圖譜一致，證明質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖4 NSP1-eGFP基因PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.4 Electrophoretic profile of PCR product of NSP1-eGFP gene

2.3.2.2 NSP1-eGFP融合蛋白的鑒定 熒光顯微鏡下觀察可見，質(zhì)粒pcDNA3.1-NSP1-eGFP轉(zhuǎn)染RD細胞24 h后，肉眼可見熒光，陽性對照組也可見明顯熒光，而陰性對照組未見熒光，見圖5。表明融合蛋白NSP1-eGFP成功表達。

圖5 NSP1-eGFP融合蛋白在RD細胞中表達的熒光顯微鏡觀察（×40）Fig.5 Fluorescence microscopy of expression of NSP1-eGFP fusion protein in RD cells（×40）

2.3.2.3 兔抗血清的特異性Western blot分析顯示，NSP1兔抗血清與鼠抗eGFP單抗均可識別相應(yīng)的NSP-eGFP融合蛋白，見圖6。表明制備的NSP1兔抗血清可正確識別帶有真核細胞內(nèi)修飾的NSP1蛋白。

圖6 兔抗血清特異性的Western blot分析Fig.6 Western blotting of specificity of rabbit antiserum

2.4 滅活疫苗細胞裂解液及純化病毒顆粒的鑒定與未感染SARS-CoV-2的Vero細胞對照組相比，SARS-CoV-2感染的Vero細胞2～4 d裂解液出現(xiàn)明顯的4種結(jié)構(gòu)蛋白和NSP1。第1天僅N、E蛋白出現(xiàn)較淺條帶，呈現(xiàn)早期高表達特性，且E蛋白除出現(xiàn)相對分子質(zhì)量預(yù)測大小的8 400的條帶外，在相分子質(zhì)量15 000附近出現(xiàn)1條同樣趨勢的條帶，與SARS-CoV E蛋白N-Link糖蛋白大小相符；第2天開始產(chǎn)生大量的NSP1蛋白及4種主要結(jié)構(gòu)蛋白；至第4天，伴隨感染細胞裂解，活細胞數(shù)減少，結(jié)構(gòu)蛋白S、M、N和NSP1濃度達到病毒收獲期峰值，而E蛋白濃度在檢測水平線下。見圖7。

圖7 細胞裂解液及純化后病毒顆粒的Western blot分析Fig.7 Western blotting of cell lysates and purified virus particles

3 討論

SARS-CoV-2的廣泛傳播給人類生命健康造成巨大威脅［15-16］。而應(yīng)對疫情最有效的措施是廣泛的疫苗接種［17］，建立群體免疫屏障，阻斷病毒在人群中的傳播。據(jù)WHO統(tǒng)計，截至目前為止，進入臨床的SARS-CoV-2疫苗共13種，其中滅活疫苗21種，占15%，進一步證明了滅活疫苗在SARS-CoV-2防治過程中的重要作用［18-19］。滅活疫苗效力的關(guān)鍵在于毒種分離培養(yǎng)、高滴度毒種選擇以及病毒顆粒的滅活和純化工藝的質(zhì)量控制。高效價、特異性的抗SARS-CoV-2抗體的制備和應(yīng)用，對SARS-CoV-2結(jié)構(gòu)、功能和致病機理研究，以及滅活疫苗的質(zhì)量監(jiān)控具有重要的意義。

本研究選取具有遺傳背景清晰、操作簡單、生長周期短、成本低廉、便于大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點的E.coli BL21（DE3）蛋白表達系統(tǒng)［20］，以帶有GST標簽的pGEX-6p-1作為表達載體，成功誘導(dǎo)表達了帶有GST標簽的SARS-CoV-2 NSP1蛋白，純化后經(jīng)6次免疫日本大耳白兔，獲得NSP1兔抗血清，Western blot分析顯示，制備的兔抗血清具有良好的特異性。隨后構(gòu)建了NSP1-eGFP融合蛋白，對制備的兔抗血清進行了檢測，結(jié)果顯示，兔抗血清能夠較好地識別帶有真核修飾的相應(yīng)NSP。證明制備的兔抗血清能夠用于SARS-CoV-2 NSP1功能的研究。與此同時，對SARS-CoV-2滅活疫苗生產(chǎn)過程中細胞裂解液以及純化后的病毒顆粒樣品的Western blot分析顯示，NSP1抗原與3個主要結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染細胞第2天后同時穩(wěn)定表達，制備的兔抗血清能夠應(yīng)用于病毒顆粒純化前后樣品相應(yīng)蛋白的檢測。滅活疫苗僅含結(jié)構(gòu)蛋白，不含NSP。E蛋白與M蛋白是SARSCoV-2和SARS-CoV-2病毒顆粒裝配的主要蛋白，二者的瞬時細胞轉(zhuǎn)染即可形成病毒樣顆粒。病毒顆粒中M蛋白的分子數(shù)最高，而E蛋白的分子數(shù)最少。本研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 E蛋白可能與SARS-CoV E蛋白均為N-linked的糖蛋白。E蛋白在病毒感染的Vero細胞中早期表達的生物學(xué)意義、在病毒顆粒裝配中的機理以及是否存在糖基化形式均值得進一步研究。而純化后的滅活疫苗樣品中主要包含S、M、N蛋白，未檢測到NSP1、E蛋白。NSP1不裝配于病毒顆粒，驗證了純化滅活疫苗的純度。加樣量對照中，SARS-CoV-2的細胞裂解液及Vero細胞對照中均出現(xiàn)管家蛋白β-actin條帶，而純化樣品中則僅出現(xiàn)極微弱條帶，鑒于Western blot分析的敏感型，也間接證明純化滅活疫苗具有較高純度。

綜上所述，宿主細胞富含NSP1，可作為標志殘留蛋白檢測純化滅活病毒純度。本研究制備的NSP1兔抗血清，為后續(xù)滅活疫苗純度及質(zhì)量評估方法的建立奠定了基礎(chǔ)，也為NSP1的功能及抗病毒藥物靶點的研究提供了工具抗體。