■杜海東 韋玥瑞 李科南 張曉東 娜梅拉 娜仁花

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

中國(guó)是世界上最大的絨山羊生產(chǎn)、加工以及銷售國(guó)[1]。內(nèi)蒙古白絨山羊作為我國(guó)著名的絨山羊品種，具有耐粗飼、適應(yīng)性強(qiáng)、絨質(zhì)好等優(yōu)點(diǎn)，在內(nèi)蒙古中西部荒漠、半荒漠地區(qū)被廣泛養(yǎng)殖[2]。隨著國(guó)家封山禁牧政策的實(shí)施，絨山羊的飼養(yǎng)方式已逐漸由放牧轉(zhuǎn)為舍飼或半舍飼飼養(yǎng)。而在人工飼喂過程中，不同的飼料組成對(duì)絨山羊的生長(zhǎng)、健康和產(chǎn)品質(zhì)量有顯著影響。

瘤胃是反芻動(dòng)物飼料發(fā)酵、消化的重要場(chǎng)所，飼料中70%～85%的可消化物和50%的粗纖維在瘤胃內(nèi)消化，定居于瘤胃的復(fù)雜微生物區(qū)系是瘤胃發(fā)揮發(fā)酵、消化功能的主要因素[3-4]。瘤胃微生物主要由細(xì)菌、古生菌、真菌和原蟲共同組成，這些微生物通過將瘤胃內(nèi)的飼料作為發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生代謝物包括揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）、菌體蛋白、脂肪酸、二氧化碳和甲烷等[5-6]。其中VFA、菌體蛋白和脂肪酸等代謝產(chǎn)物不僅對(duì)瘤胃微生物的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，還能夠被宿主所吸收，對(duì)瘤胃的健康和動(dòng)物的生長(zhǎng)起到積極的作用，而二氧化碳和甲烷的產(chǎn)生降低了飼料能量的利用率，且兩者作為溫室氣體排放到空氣中，對(duì)環(huán)境也造成了消極影響[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，不同的飼料類型、組成形式、物理特性等對(duì)瘤胃微生物數(shù)量和發(fā)酵代謝產(chǎn)物有極大影響[9-10]。因此，本試驗(yàn)研究了不同飼糧類型對(duì)絨山羊瘤胃微生物數(shù)量的影響，從而篩選出最佳的飼糧類型，為優(yōu)化絨山羊飼料配方提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用24只體重相近的8月齡絨山羊母羊，隨機(jī)分成4 個(gè)處理組，每組6 只母羊。經(jīng)驅(qū)蟲后進(jìn)行試驗(yàn)，預(yù)試期20 d，正試期20 d。試驗(yàn)期間確保補(bǔ)飼時(shí)間、飼喂量、飼養(yǎng)條件相同，并保證自由飲水。4個(gè)處理組分別飼喂4種不同組成的飼糧，分別為苜蓿青干草（AH 組）、苜蓿青干草加補(bǔ)飼精料（AC 組）、玉米秸稈（CS組）和玉米秸稈加補(bǔ)飼精料（CC組）。試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 瘤胃液的采集

在正試期的第5 天，試驗(yàn)羊空腹12 h 后，利用體外抽取法采集24 只母羊瘤胃液，采集的瘤胃液一部分經(jīng)四層紗布過濾后分裝于凍存管中放入液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱中保存，用于微生物數(shù)量的測(cè)定。另取部分瘤胃液用雙層紗布過濾，取濾液1 mL，加入甲基綠福爾馬林染色液（由35%的福爾馬林溶液100 mL，NaCl 8.0 g，甲基綠0.6 g 和純化水900 mL 配制）2 mL，用于原蟲數(shù)量的測(cè)定。

1.3 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.3.1 瘤胃微生物的提取和PCR擴(kuò)增

參照韋玥瑞等[12]的方法提取瘤胃液中總DNA，將提取的DNA 在0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品DNA濃度和OD值，采用PCR技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒（天根生化科技有限公司）將沒有雜帶的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收，然后將回收的DNA參照pMD19-T Simple Vector（TaKaRa）的克隆試劑盒說明書進(jìn)行操作，挑選陽性克隆子測(cè)序鑒定，并在BLAST基因庫進(jìn)行在線對(duì)比，相似性達(dá)到90%以上的質(zhì)粒用作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

對(duì)已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品以10 倍梯度稀釋，稀釋的濃度梯度為4～6個(gè)，每個(gè)濃度梯度重復(fù)3次，進(jìn)行PCR 反應(yīng)制作相應(yīng)微生物定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)產(chǎn)甲烷菌、纖維分解菌和真菌進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。絕對(duì)定量前將待測(cè)樣品統(tǒng)一稀釋到10 ng/μL，絕對(duì)定量后將測(cè)定樣品的Ct值代入各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中，計(jì)算得到細(xì)菌拷貝數(shù)。實(shí)時(shí)定量PCR引物信息見表2。

表2 基因引物序列

1.3.4 原蟲數(shù)量的測(cè)定

取瘤胃液后染色30 min，在光學(xué)顯微鏡下采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)算。

原蟲數(shù)（個(gè)/mL）=X/S×D×1 000

式中：X——所觀察的所有方格中原蟲的總數(shù)（個(gè)）；

S—計(jì)數(shù)的方格數(shù)；

D—稀釋倍數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel整理后，采用SAS 9.2軟件GLM模型進(jìn)行單因素方差分析，組間均值進(jìn)行Duncan's法多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果（見表3）

由表3 可知，5 種瘤胃微生物標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)值均大于0.99，且斜率為-3.8～-3.4。由以上數(shù)據(jù)得知，未知樣均落于標(biāo)準(zhǔn)曲線上，各稀釋梯度拷貝數(shù)與Ct值之間均存在良好線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、相關(guān)系數(shù)與擴(kuò)增效率均符合要求，可用于試驗(yàn)。

表3 瘤胃微生物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同飼糧對(duì)絨山羊瘤胃微生物數(shù)量的影響

2.2.1 不同飼糧對(duì)絨山羊瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響（見表4）

由表4可知，飼喂不同飼糧瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量表現(xiàn)為CS 組＞CC 組＞AH 組＞AC 組，其中AC 組最少，為0.22×109拷貝數(shù)/g；CS 組最多，為3.30×109拷貝數(shù)/g。AC組產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著低于CS組與CC組（P＜0.05），顯著低于AH 組（P＜0.05）。AH 組產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著低于CS與CC組（P＜0.05）。CS組和CC組產(chǎn)甲烷菌數(shù)量無顯著差異（P＞0.05）。

表4 不同飼糧對(duì)產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響（×109 拷貝數(shù)/g）

2.2.2 不同飼糧對(duì)絨山羊瘤胃內(nèi)纖維分解菌數(shù)量的影響（見表5）

由表5可知，飼喂不同飼糧所產(chǎn)生的產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量表現(xiàn)為CS組＞CC組＞AH組＞AC組，其中AC組最少，為15.00×108拷貝數(shù)/g；CS組最多，為20.90×108拷貝數(shù)/g；AC組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌顯著低于AH組、CS組和CC組（P＜0.05）。AH組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量顯著低于CS組與CC組（P＜0.05）。CS組和CC組產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量無顯著差異。不同飼糧處理對(duì)絨山羊白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌無顯著影響（P＞0.05）。

表5 不同飼糧對(duì)纖維分解菌數(shù)量的影響（×108 拷貝數(shù)/g）

2.2.3 不同飼糧對(duì)絨山羊瘤胃內(nèi)真菌數(shù)量的影響（見表6）

表6 不同飼糧對(duì)真菌數(shù)量的影響(×106 拷貝數(shù)/g)

由表6得知，飼喂不同飼糧所產(chǎn)生的真菌數(shù)量表現(xiàn)為CS 組＞AH 組＞CC 組＞AC 組，其中AC 組最少，為1.17×106拷貝數(shù)/g；CS 組最多，為6.35×106拷貝數(shù)/g；AC 組真菌數(shù)量低于AH 組、CC 組和CS 組，但差異不顯著（P＞0.05）。

2.2.4 不同飼糧對(duì)絨山羊瘤胃原蟲數(shù)量的影響（見表7）

由表7可知，飼喂不同飼糧所產(chǎn)生的原蟲數(shù)量表現(xiàn)為CS 組＞CC 組＞AH 組＞AC 組，其中AC 組最少，為0.66×104個(gè)/mL；CS組最多，為4.02×104個(gè)/mL；AC組瘤胃原蟲數(shù)量顯著低于CS 組和CC 組（P＜0.05），但AC組原蟲數(shù)量與AH組無顯著差異（P＞0.05）。

表7 不同飼糧瘤胃原蟲數(shù)量的比較（×104個(gè)/mL）

2.2.5 絨山羊瘤胃微生物相關(guān)性分析（見表8）

由表8 可知，顯著性水平P＜0.05，說明本次分析數(shù)據(jù)可靠，即研究樣本可推廣到整體。各研究變量之間的相關(guān)系數(shù)大部分都大于0.5，說明相關(guān)性較好。其中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、產(chǎn)甲烷菌相關(guān)性最高，說明了這兩個(gè)變量間的互相促進(jìn)作用最強(qiáng)。

表8 不同微生物數(shù)量的相關(guān)性分析

3 討論

3.1 飼糧類型對(duì)絨山羊瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的影響

不同種類飼料的營(yíng)養(yǎng)和生化特性能夠影響瘤胃微生物種群和代謝，從而調(diào)控反芻動(dòng)物優(yōu)勢(shì)菌群比例[13]。瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌、纖維素分解菌、真菌和原蟲的數(shù)量不僅可以反映機(jī)體對(duì)于粗飼料纖維消化水平的高低，同時(shí)也能間接反映機(jī)體對(duì)此類飼料的利用效率[14]。產(chǎn)甲烷菌利用瘤胃內(nèi)的飼料作為發(fā)酵底物生成甲烷，這不僅降低了飼料的利用率，造成了能量的浪費(fèi)，甲烷氣體排放到空氣中也造成了環(huán)境的污染。因此調(diào)控瘤胃產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量是解決飼料能量浪費(fèi)、降低甲烷排放的有效手段。侯路釗等[15]研究發(fā)現(xiàn)，荷斯坦公牛飼糧中的中性洗滌纖維/淀粉值降低能夠減少甲烷排放量，降低瘤胃古菌豐富度指數(shù)和甲烷菌的數(shù)量。本研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，苜蓿組與玉米秸稈組相比瘤胃甲烷菌的數(shù)量顯著減少，而補(bǔ)飼精料進(jìn)一步降低了瘤胃甲烷菌的數(shù)量，這可能是由于不同的飼糧組合能夠通過影響瘤胃的發(fā)酵模式，進(jìn)一步影響到瘤胃微生物的數(shù)量[16-17]。瘤胃產(chǎn)甲烷菌主要利用二氧化碳和氫氣生成甲烷提供能量，高纖維結(jié)構(gòu)性碳水化合物促使瘤胃乙酸生成量上升，乙酸生成過程會(huì)產(chǎn)生二氧化碳和氫氣，為甲烷菌提供充足底物，而可消化碳水化合物促使瘤胃丙酸生成量上升，此過程消耗氫氣[18]。本試驗(yàn)中，絨山羊飼喂玉米秸稈瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量顯著提高說明相對(duì)于優(yōu)質(zhì)干草和精料，玉米秸稈中木質(zhì)素、纖維素含量高，其作為瘤胃甲烷菌發(fā)酵底物發(fā)酵程度更大。綜上可知，甲烷菌數(shù)量的差異取決于飼料的類型與組成及其在瘤胃中的可用性，合理的飼料組成可減少產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量。

3.2 飼糧類型對(duì)絨山羊瘤胃內(nèi)纖維分解菌數(shù)量的影響

在反芻動(dòng)物飼糧中纖維素是最普遍存在的，在瘤胃微生物中主要分解纖維素的菌包括產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌、白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌。各類纖維分解菌分泌的纖維二糖酶、木聚糖酶羧甲基、纖維素酶和果膠酶在纖維素降解過程中發(fā)揮重要作用[19]。纖維素分解菌的數(shù)量受飼糧結(jié)構(gòu)的影響。并且，纖維素分解菌對(duì)不同物質(zhì)的纖維素降解能力也存在差異[20]。董春曉等[21]研究不同飼料來源對(duì)胡羊瘤胃微生物組成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于葵花籽殼和油菜秸稈組，玉米秸稈組胡羊瘤胃纖維素分解菌的數(shù)量顯著提高。在本試驗(yàn)中飼喂玉米秸稈的絨山羊瘤胃中纖維分解菌數(shù)量大于飼喂苜蓿青干草的絨山羊，這與前人的研究結(jié)果一致。以上結(jié)果可能是因?yàn)楦吆坷w維飼料為細(xì)菌繁殖提供了充足的底物，從而增加了微生物的數(shù)量。此外，本研究中，絨山羊補(bǔ)飼精料瘤胃產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌數(shù)量有所降低。Fernando 等[22]報(bào)道，瘤胃微生物群落的變化與飼糧的精粗比有關(guān)，當(dāng)飼糧的精粗比從40∶60提高到60∶40時(shí)瘤胃微生物的組成也隨之變換，并且，在以粗料為主的飼糧中纖維素分解菌的數(shù)量更多。楊碩等[23]也發(fā)現(xiàn)相較于放牧組山羊，放牧加補(bǔ)飼組山羊瘤胃纖維素分解菌數(shù)量顯著降低。這可能是由于瘤胃微生物在分解精料中碳水化合物過程中，有機(jī)酸含量顯著升高，降低瘤胃的pH并形成酸性環(huán)境抑制瘤胃纖維分解菌的生長(zhǎng)[24]。

3.3 飼糧類型對(duì)絨山羊瘤胃內(nèi)真菌數(shù)量的影響

瘤胃中的真菌占瘤胃微生物總量的5%～20%，在纖維消化中起著重要作用，由于其復(fù)雜而豐富的酶活性在消化結(jié)構(gòu)性碳水化合物方面可能比細(xì)菌具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。真菌能分泌產(chǎn)生纖維素酶，對(duì)植物纖維（纖維素、木質(zhì)素和半纖維素）具有很強(qiáng)的消化能力，此外，真菌的穿透生長(zhǎng)同時(shí)可以使植物組織纖維內(nèi)部張力減小變得疏松而易于降解[19]。在本試驗(yàn)中，玉米秸稈組絨山羊瘤胃真菌的數(shù)量大于苜蓿青干草組和補(bǔ)飼精料組，且補(bǔ)飼精料組真菌數(shù)量在數(shù)值上明顯下降。付子琳等[25]研究發(fā)現(xiàn)放牧組與舍飼組的成年灘羊瘤胃真菌多樣性差異不顯著，但兩組間瘤胃菌群結(jié)構(gòu)存在一定差異，相較于舍飼組，放牧組灘羊瘤胃真菌豐富度顯著提高。楊宏波等[26]也發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料飼料的犢牛瘤胃厭氧真菌的活性和數(shù)量會(huì)下降。孫云章等[27]發(fā)現(xiàn)，隨著體外發(fā)酵時(shí)間的增加，精粗比低的組瘤胃真菌的數(shù)量有大幅度的上升，而隨著精料的提高真菌數(shù)量顯著下降甚至消失。以上結(jié)果表明，瘤胃中的厭氧真菌對(duì)底物的選擇具有偏好性，真菌更偏好于附著在纖維素上，含較高纖維素的飼料更有利于厭氧真菌生長(zhǎng)[28]。

3.4 飼糧類型對(duì)絨山羊瘤胃內(nèi)原蟲數(shù)量的影響

原蟲在瘤胃大量存在，據(jù)估計(jì)每克瘤胃液原蟲數(shù)量為105～106個(gè)，占瘤胃微生物總量的30%以上[29]。瘤胃中大約62%的纖維素降解與原蟲有關(guān)。原蟲的種群平衡對(duì)維持良好的瘤胃環(huán)境和其他微生物發(fā)酵功能至關(guān)重要。瘤胃原蟲能夠?qū)⒖扇苄蕴呛偷矸酆铣蓛?chǔ)備碳水化合物，且原蟲對(duì)碳水化合物發(fā)酵的速度低于細(xì)菌，這預(yù)防了其他微生物快速發(fā)酵生成短鏈脂肪酸（SCFAs），從而避免了瘤胃pH 的下降，降低了動(dòng)物酸中毒的風(fēng)險(xiǎn)，增加了飼料在瘤胃的留存時(shí)間[30]。此外，瘤胃原蟲還是重要的氫生產(chǎn)者，瘤胃9%～25%的甲烷產(chǎn)生與其有關(guān)[31]。因此，合理調(diào)控瘤胃原蟲的數(shù)量對(duì)反芻動(dòng)物的健康和能量消耗具有重大意義。在本研究中，苜蓿組和玉米秸稈組絨山羊在補(bǔ)充精料后瘤胃中原蟲數(shù)量均不同程度減少。Franzolin等[32]研究發(fā)現(xiàn)，相較于飼料喂養(yǎng)水牛，放牧組水牛瘤胃的原蟲組成有顯著變化，并且放牧組纖毛蟲群落總量顯著高于飼料組。楊碩等[23]研究發(fā)現(xiàn)對(duì)放牧絨山羊補(bǔ)飼精料后瘤胃中原蟲數(shù)量顯著下降。這與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果表明，原蟲的數(shù)量受飼糧類型和組成的影響。因此，在生產(chǎn)中充分利用飼料組合技術(shù)可以有效地調(diào)節(jié)瘤胃微生物的數(shù)量。此外，本試驗(yàn)中飼喂苜蓿的絨山羊瘤胃中原蟲數(shù)量低于飼喂玉米秸稈的絨山羊，這可能是因?yàn)檐俎Ｖ泻胸S富的皂苷對(duì)原蟲的生長(zhǎng)具有抑制作用[33]。

在瘤胃中，產(chǎn)甲烷菌、纖維素分解菌、真菌、原蟲等各類微生物互相作用，相互影響，共同構(gòu)成一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的瘤胃微生物系統(tǒng)。纖維素分解菌、真菌、原蟲等在利用瘤胃飼料的同時(shí)產(chǎn)生氫和二氧化碳，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氫和二氧化碳的產(chǎn)量逐漸積累增加發(fā)生負(fù)反饋調(diào)節(jié)，對(duì)纖維素的降解發(fā)揮抑制作用，而產(chǎn)甲烷菌利用氫和二氧化碳生成甲烷，提高纖維素利用率[34]。有研究表明，甲烷產(chǎn)量與纖維的降解率呈正相關(guān)，并且反芻動(dòng)物瘤胃中產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量和纖維降解菌的數(shù)量也呈正相關(guān)關(guān)系[35]。Wei等[36]研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃甲烷菌和真菌體外共同培養(yǎng)對(duì)纖維素的降解能力優(yōu)于僅真菌培養(yǎng)組。趙小蓉等[20]將纖維素分解菌體外培養(yǎng)研究其對(duì)纖維素物質(zhì)的分解能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)真菌和纖維素分解菌共同接種時(shí)，對(duì)纖維素的降解速度優(yōu)于單一菌株。本試驗(yàn)通過數(shù)據(jù)分析各變量之間的相關(guān)系數(shù)大部分都大于0.50，說明了不同微生物之間相關(guān)性較好，這與前人的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明，不同種類的瘤胃微生物在對(duì)纖維素的分解利用過程中存在互作作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼喂苜蓿青干草的絨山羊，瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌和原蟲的數(shù)量顯著降低，因此，優(yōu)質(zhì)牧草有利于減少甲烷菌和原蟲數(shù)量，并且補(bǔ)飼精料后會(huì)進(jìn)一步降低甲烷菌和原蟲的數(shù)量，本試驗(yàn)結(jié)果可為生產(chǎn)中的飼料組合技術(shù)提供科學(xué)合理的數(shù)據(jù)，同時(shí)也能為下一步優(yōu)化反芻動(dòng)物飼料結(jié)構(gòu)提供參考。