■房 崢 王 聰 劉 強

（山西農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，山西太谷 030801）

畜禽飼養(yǎng)使用抗生素，存在病原菌產(chǎn)生耐藥性、破壞動物消化道內(nèi)菌群平衡和畜產(chǎn)品殘留的問題，為此，世界各國相繼禁止使用抗生素，尋找抗生素的替代品刻不容緩[1]。有研究表明[2]，日糧添加1×1011CFU/d的納豆枯草芽孢桿菌，能顯著提高奶牛瘤胃微生物數(shù)量，提高飼料效率，進而提高瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸（TVFA）含量；Beauchemin等[3]發(fā)現(xiàn)日糧添加6×109CFU/d的糞腸球菌能顯著提高肉牛瘤胃丙酸含量，顯著降低乙丙比；姜艷美等[4]發(fā)現(xiàn)在人工瘤胃中添加6.25×106CFU/mL 發(fā)酵液的糞腸球菌能提高發(fā)酵液中氨態(tài)氮（NH3-N）濃度和原蟲數(shù)量；Van Koevering等[5]報道，奶牛日糧中添加嗜酸乳桿菌能降低瘤胃中乳酸濃度，因此奶牛日糧添加嗜酸乳桿菌能預防奶牛產(chǎn)生瘤胃酸中毒的癥狀，有利于維持奶牛瘤胃代謝的正常進行。

綜合前人研究結(jié)果可知，日糧添加益生菌能促進奶牛瘤胃有益菌生長，進而提高飼料效率和瘤胃發(fā)酵水平。但由于受到瘤胃內(nèi)環(huán)境及瘤胃微生物的影響，不同補充方式的益生菌進入奶牛瘤胃后的效果尚不明確。故有必要對外源微生物與瘤胃菌群之間的互作效應以及益生菌的最佳使用方式進行探究。本試驗通過研究益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響，明確外源微生物與瘤胃菌群之間的互作效應，有助于豐富反芻動物瘤胃營養(yǎng)代謝調(diào)控理論，試驗的開展具有一定的理論意義；通過比較不同益生菌補充方式飼喂效果，明確益生菌的最佳使用方式，為生產(chǎn)中科學有效利用益生菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗選用的益生菌原菌粉（其中嗜酸乳桿菌原菌粉的活菌數(shù)為1.0×1011CFU/g；枯草芽孢桿菌原菌粉的活菌數(shù)為1.6×109CFU/g；糞腸球菌原菌粉的活菌數(shù)為1.0×1011CFU/g）均為飼料級，購自山西大禹生物工程股份有限公司。

混合益生菌（MP）的制備：依據(jù)山西省特色奶牛生產(chǎn)重點科技創(chuàng)新團隊之前的研究成果以及嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌的生物學特性，將嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和糞腸球菌原菌粉按4∶15∶1的比例混合均勻后制成。

包被混合益生菌（CMP）的制備：包被混合益生菌由山西省特色奶牛生產(chǎn)重點科技創(chuàng)新團隊自主研制而成，含菌量為50%。

1.2 試驗動物

選用44 頭、體重（632±9.2）kg、泌乳天數(shù)（113.7±15.4）d體況良好的經(jīng)產(chǎn)荷斯坦奶牛。

1.3 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

依據(jù)體重和泌乳天數(shù)，將44 頭健康荷斯坦奶牛按隨機區(qū)組設(shè)計分為4 組：①對照組飼喂基礎(chǔ)日糧；②MP 組飼喂基礎(chǔ)日糧+1 g/kg DM MP；③CMP 組飼喂基礎(chǔ)日糧+2 g/kg DM CMP；④HMP組飼喂基礎(chǔ)日糧+0.5 g/kg DM MP+1 g/kg DM CMP。

試驗期共80 d，包括預試期20 d和正試期60 d。

奶牛全混合日糧（TMR）精粗比為50∶50，依據(jù)NRC（2001）配制[6]，日糧組成和營養(yǎng)水平見表1。試驗牛分為兩個圈舍，單欄飼養(yǎng)，自由采食和飲水。為了保證TMR的新鮮性，每天分兩次（5：00和14：00）投喂TMR。每次飼喂前將添加劑均勻攪拌在少量TMR中，待試驗牛采食完畢后再投喂剩余TMR。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平（DM，%）

1.4 瘤胃液的采集

正式試驗期的第60天，晨飼后3 h，用胃管采集試驗牛瘤胃液100 mL。用PHSJ-4A型酸度計（上海精密科學儀器有限公司，中國上海）測定瘤胃液pH后，將瘤胃液用4層紗布過濾，分成4份，兩份于-20 ℃保存，用于測定NH3-N和揮發(fā)性脂肪酸（VFA），兩份于-80 ℃保存，用于菌群的測定。

1.5 樣品的測定

1.5.1 瘤胃液NH3-N和VFA的測定

瘤胃NH3-N濃度的測定采用比色法，利用紫外可見分光光度計（UV2100，上海優(yōu)尼科儀器有限公司）測定標樣及樣品的吸光度值后，根據(jù)標樣的濃度及吸光度值所構(gòu)建的標準曲線來計算瘤胃液中NH3-N 的濃度[7]。瘤胃液VFA采用氣相色譜儀（GC122，上海精密科學儀器有限公司）測定[7]。

1.5.2 瘤胃液酶活性的測定

瘤胃液中纖維素分解酶、蛋白酶以及淀粉酶活性的測定采用比色法[8]。在40 ℃和pH為7的條件下，瘤胃液中的纖維素酶和淀粉酶能分別將纖維素類底物和可溶性淀粉水解為還原糖，蛋白酶能將酪素底物水解產(chǎn)生含有酚基的氨基酸；還原糖或酚基氨基酸與3,5-二硝基水楊酸或Folin 試劑發(fā)生反應，生成橙色或藍色產(chǎn)物，其顏色深淺與還原糖或酚基氨基酸含量成正比；使用分光光度計（波長540 nm 或680 nm 處）測定樣品的吸光度，繪制標準曲線，再計算還原糖或酚基氨基酸的生成量和酶的活性。漆酶在40 ℃和pH為7的條件下能與2,2-連氮-二（3-乙苯基并噻唑-磺酸）反應生成綠色產(chǎn)物，其顏色深淺與產(chǎn)物濃度成正比，使用分光光度計（波長420 nm 處）測定樣品的吸光度，計算漆酶的活性。

1.5.3 瘤胃液菌群的測定

向瘤胃液中加入研磨珠與溴化十六烷三甲基銨，用研磨珠均質(zhì)器破碎，離心后取上清液，用DNA提取液反復提取，最后加入異戊醇、乙醇進行沉淀，DNA沉淀溶于超純水后測定[7]。

引物購買自北京華大基因科技股份有限公司，信息見表2。按照TaKaRa試劑盒上的說明（由北京寶日醫(yī)生生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)），使用美國ABI Step OnePlus 的儀器進行Real-time PCR，記錄拷貝數(shù)。標品自行制備，反復調(diào)試以使擴增效率達90%～110%，標準曲線中的R2≥0.999，之后進行樣品DNA 的Realtime PCR 測定。PCR 擴增引物和詳細步驟參考武曉旭[7]發(fā)表的方法。

表2 瘤胃菌群RT-PCR檢測引物

1.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

對于瘤胃發(fā)酵、瘤胃酶活、瘤胃菌群各指標采用one-way ANOVA 模型進行統(tǒng)計分析，采用Duncan's法進行多重比較，當P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響（見表3）

表3 混合益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響

由表3 可知，HMP 組瘤胃液pH 顯著低于對照組和CMP 組（P＜0.05）；MP 組和HMP 組TVFA 含量顯著高于對照組和CMP組（P＜0.05）；MP組和HMP組乙酸摩爾比顯著低于對照組和CMP 組（P＜0.05）；MP 組和HMP 組丙酸摩爾比顯著高于對照組（P＜0.05）；MP 組和HMP組戊酸摩爾比最高，CMP組次之，對照組最低（P＜0.05）；MP組、HMP組異丁酸和異戊酸摩爾比顯著高于對照組和CMP組（P＜0.05）；MP組和HMP組乙丙比顯著低于對照組和CMP組（P＜0.05）；丁酸摩爾比和NH3-N濃度，各組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.2 混合益生菌對奶牛瘤胃微生物酶活性的影響（見表4）

表4 混合益生菌對奶牛瘤胃微生物酶活性的影響

由表4 可知，瘤胃液中羧甲基纖維素酶、纖維二糖酶和α-淀粉酶活性，各組間差異不顯著（P＞0.05）；木聚糖酶、果膠酶和蛋白酶活性，MP 組和HMP 組顯著高于對照組和CMP組（P＜0.05）；MP組和HMP組漆酶活性顯著高于對照組（P＜0.05）。

2.3 混合益生菌對奶牛瘤胃菌群的影響（見表5）

表5 混合益生菌對奶牛瘤胃菌群的影響

由表5可知，瘤胃液中總細菌、總厭氧真菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和棲瘤胃普雷沃氏菌的數(shù)量，各組間差異不顯著（P＞0.05）；MP組和HMP組總原蟲的數(shù)量顯著低于對照組和CMP 組（P＜0.05）；MP 組和HMP 組總產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量顯著低于對照組（P＜0.05）；HMP組產(chǎn)琥珀絲狀桿菌的數(shù)量顯著高于MP組（P＜0.05），與對照組和CMP 組間差異不顯著（P＞0.05）；MP 組、HMP 組溶纖維丁酸弧菌的數(shù)量顯著高于對照組和CMP組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 混合益生菌對奶牛瘤胃發(fā)酵的影響

瘤胃pH 作為反映瘤胃內(nèi)環(huán)境的重要指標，影響奶牛的瘤胃發(fā)酵水平。日糧補充HMP，顯著降低了瘤胃pH。Sun 等[9]同樣提出，在奶牛日糧中分別添加0.5×1011CFU/d和1.0×1011CFU/d納豆枯草芽孢桿菌，試驗奶牛瘤胃pH均顯著降低。反芻動物能量的來源主要是日糧中碳水化合物在瘤胃中發(fā)酵所產(chǎn)生的VFA，而瘤胃產(chǎn)生和吸收VFA這一動態(tài)變化過程受到多種因素影響[10]。日糧中補充MP 和HMP，顯著提高了瘤胃中TVFA含量。瘤胃TVFA含量的提高是因為日糧補充MP和HMP顯著提高了瘤胃中B. fibrisolvens和R. amylophilus的數(shù)量。B. fibrisolvens和R. amylophilus能分泌纖維素酶（包括木聚糖酶、果膠酶和漆酶）、蛋白酶和α-淀粉酶，提高了日糧在瘤胃的降解率。孫滿吉等[11]在日糧中添加4.0×1010CFU/d酵母培養(yǎng)物，顯著提高了瘤胃中TVFA 含量，與本研究結(jié)果相同。日糧補充MP 和HMP 顯著降低了瘤胃乙酸摩爾比，顯著提高了丙酸摩爾比，乙酸/丙酸值降低，使瘤胃發(fā)酵模式向產(chǎn)生更多的丙酸轉(zhuǎn)變，有利于反芻動物的生長和生產(chǎn)。劉彩娟等[12]同樣發(fā)現(xiàn)，在奶牛日糧中添加1.2×1011CFU/d 復合益生菌，顯著增加了瘤胃丙酸含量，降低了乙酸/丙酸值。在瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的VFA中，有少量由支鏈氨基酸代謝后產(chǎn)生的支鏈脂肪酸（主要有戊酸、異戊酸和異丁酸等）。戊酸由碳水化合物或脯氨酸等降解產(chǎn)生，異戊酸和異丁酸由支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）經(jīng)氧化脫氨或脫羧基產(chǎn)生[13]。日糧補充MP和HMP，瘤胃中戊酸、異戊酸和異丁酸摩爾比顯著提高，與Lascano 等[14]的研究結(jié)果一致。瘤胃NH3-N 濃度能夠反映瘤胃MCP 合成、日糧CP 降解之間的平衡，反映瘤胃微生物對日糧中氮源的降解和利用情況[15]。日糧補充MP、CMP 和HMP，瘤胃內(nèi)NH3-N 濃度無顯著變化，與瘤胃內(nèi)總細菌數(shù)量無顯著變化的結(jié)果一致。Yang等[16]發(fā)現(xiàn)，日糧中添加1.0×1010CFU/d的丙酸桿菌與糞腸球菌復合制劑，瘤胃NH3-N濃度無顯著變化，與本研究結(jié)果一致。

日糧添加MP 和HMP，瘤胃TVFA 含量和丙酸摩爾比顯著提高。日糧添加CMP，對瘤胃TVFA 含量無顯著影響。因此，MP 直接添加或包被與不包被混合添加均對奶牛瘤胃發(fā)酵有積極的影響。

3.2 混合益生菌對奶牛瘤胃酶活性和菌群的影響

瘤胃內(nèi)酶的活性與瘤胃菌群數(shù)量有關(guān)，二者均可間接反映營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃中被降解的能力[15]。R.albus、R. flavefaciens、B. fibrisolvens和F. succinogenes主要分泌纖維素酶；B.fibrisolvens、R.amylophilus和P.ruminicola主要分泌α-淀粉酶和蛋白酶[17]。在本試驗中，日糧補充MP和HMP顯著提高了瘤胃中纖維素酶（包括木聚糖酶、果膠酶和漆酶）和蛋白酶的活性，與Kubo等[18]的研究結(jié)果一致。日糧補充MP和HMP顯著提高了瘤胃中木聚糖酶、果膠酶和漆酶的活性，與B. fibrisolvens數(shù)量增加的結(jié)果相一致。馮偉業(yè)等[19]的試驗同樣發(fā)現(xiàn)，添加益生酵母培養(yǎng)物，瘤胃木聚糖酶和果膠酶活性增加。日糧補充MP和HMP顯著提高了蛋白酶的活性，與B.fibrisolvens和R.amylophilus的數(shù)量提高的結(jié)果一致。

日糧補充MP 和HMP 顯著降低了產(chǎn)甲烷菌和總原蟲數(shù)量。產(chǎn)甲烷菌數(shù)量的降低與補充MP 和HMP后丙酸含量的提高和總原蟲數(shù)的減少有關(guān)。丙酸含量的提高，競爭性地消耗了瘤胃中的氫，減少了產(chǎn)甲烷菌生長增殖所需的底物[20]，導致其數(shù)量減少。日糧補充MP、CMP和HMP，奶牛瘤胃R. albus和R. flavefaciens數(shù)量無顯著變化。但是，鄧璐芳[2]的研究發(fā)現(xiàn)，奶牛日糧中添加1.0×1011CFU/d 納豆枯草芽孢桿菌，瘤胃R. albus和R. flavefaciens數(shù)量顯著增加。研究結(jié)果不一致的原因，可能是兩個試驗奶牛瘤胃pH 的不同所造成的。鄧璐芳[2]的試驗中，處理組pH 為6.66，本試驗MP 組、CMP 組和HMP 組pH 分別為5.87、6.12 和5.61。R. albus和R. flavefaciens屬于纖維分解菌，較低的瘤胃pH（低于6.2）則會抑制纖維分解菌增長[21]。日糧補充MP和HMP顯著提高了瘤胃內(nèi)B. fibrisolvens和R. amylophilus的數(shù)量。鄧璐芳[2]研究表明，奶牛日糧中添加1.0×1011CFU/d 納豆枯草芽孢桿菌，瘤胃B. fibrisolvens和R. amylophilus的數(shù)量顯著提高，P. ruminicola的數(shù)量未發(fā)生顯著變化，與本研究結(jié)果相同。

日糧補充MP 顯著提高了瘤胃中木聚糖酶、果膠酶、蛋白酶和漆酶的活性，以及瘤胃內(nèi)B. fibrisolvens和R. amylophilus的數(shù)量。日糧補充CMP，因采用過瘤胃技術(shù)處理益生菌，對消化酶活性及瘤胃菌群數(shù)量無顯著影響。日糧補充HMP顯著提高了瘤胃中木聚糖酶、果膠酶、蛋白酶和漆酶的活性，同時顯著提高了瘤胃內(nèi)B. fibrisolvens和R. amylophilus數(shù)量。但是HMP組中F. succinogenes的數(shù)量顯著高于MP 組。綜合比較，HMP為益生菌的最佳補充方式。

4 結(jié)論

混合益生菌能促進瘤胃發(fā)酵功能，奶牛日糧中混合益生菌的最佳補充方式為包被和不包被等比例混合添加。