薛 雪,王曉林,王新穎,呂淑蘭
(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,陜西 西安 710061)
絕經(jīng)的機制在于卵巢內(nèi)分泌功能衰竭、性激素分泌缺乏、排卵停止,進而子宮內(nèi)膜停止增殖、分泌及周期性月經(jīng)來潮,性激素水平的下降可引發(fā)絕經(jīng)相關(guān)癥狀甚至疾病,其嚴重影響了患者的生活與工作[1]。目前,絕經(jīng)激素治療(menopausal hormone therapy,MHT)是“窗口期”預(yù)防心血管疾病、緩解絕經(jīng)相關(guān)癥狀、防治骨質(zhì)疏松及阿爾茲海默病等最有效的方法[2]。但目前廣泛應(yīng)用的MHT方案尚不完善,在藥物安全性方面仍存爭議,使得受益人群局限。研究發(fā)現(xiàn)MHT中的孕激素可能是諸多副反應(yīng)的主要刺激因素。將孕激素成份替換為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor modulators,SERMs)是MHT的最新策略,雌激素與SERMs所共同組成的組織選擇性雌激素復(fù)合物(tissue selective estrogen complex,TSEC)使藥物在有效的前提下進一步提高了安全性[3]。值得注意的是,子宮平滑肌瘤是女性最為常見的生殖系統(tǒng)良性腫瘤,有高達70%的發(fā)病率[4],其中48.6%的女性在子宮平滑肌瘤伴隨下進入絕經(jīng)期[5]。在子宮平滑肌瘤如此高發(fā)病率的情況下,對其顧慮將影響較多人群的MHT決策。迄今為止,TSEC對子宮平滑肌瘤的影響尚未見研究報道。本實驗通過研究TSEC對子宮平滑肌瘤細胞增殖及凋亡能力的影響,探討TSEC作為MHT的新方案,對圍絕經(jīng)期子宮平滑肌瘤患者的安全性和有效性,為TSEC在MHT中的應(yīng)用提供新的依據(jù)。
選取2021年6月至8月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院因子宮平滑肌瘤行核除術(shù)患者,對手術(shù)切除的子宮平滑肌瘤組織通過酶消化法進行子宮平滑肌瘤細胞的原代培養(yǎng)。本研究通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(2021-14)。
細胞培養(yǎng)所用的F12培養(yǎng)基、胎牛血清均采用Gibco相應(yīng)產(chǎn)品,二甲基亞砜(dimethylsulfoxide,DMSO)和四甲基偶氮唑鹽[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]試劑使用Sigma相應(yīng)產(chǎn)品,抗雌激素受體-α(antiestrogen receptor-α,ER-α)兔抗人、抗雌激素受體-β(antiestrogen receptor-β,ER-β)兔抗人抗體、抗α-肌動蛋白(α-Actin)兔抗人、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記二抗及熒光標記二抗購自Abcam。
實驗共設(shè)立4個組:雌孕激素連續(xù)聯(lián)合組(10-7M 17-β雌二醇+3.3×10-8M安宮黃體酮,E+P組)、TSEC組(10-7M 17-β雌二醇+10-9M雷洛昔芬)、單獨雌激素組(10-7M 17-β雌二醇,E組)及對照組(Control組,無藥物刺激干預(yù)),觀察不同組藥物對子宮平滑肌瘤細胞增殖及凋亡的影響,每項實驗均獨立重復(fù)完成3次。
取經(jīng)手術(shù)切除的新鮮子宮平滑肌瘤組織,經(jīng)4%多聚甲醛固定,脫水后制蠟塊,連續(xù)切片,制成厚度為5μm的組織玻片,依次經(jīng)過脫蠟、水化處理后進行后續(xù)染色:對于蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,依次加入伊紅、蘇木素進行染色;對于免疫組織化學(xué)染色及免疫熒光染色,組織玻片經(jīng)3%H2O2處理、血清封閉孵育,相應(yīng)一抗孵育(抗體稀釋比例為1:100)、洗片、依據(jù)實驗?zāi)康氖褂肏RP標記/熒光標記的二抗孵育,洗片后以二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色及蘇木素細胞核染色,或經(jīng)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)細胞核染色,封片后放置于正置顯微鏡或熒光顯微鏡下進行拍照存儲、分析。
子宮平滑肌瘤細胞原代培養(yǎng)所使用的組織與免疫組化來源相同,將獲取的標本組織塊放置于含100IU/mL雙抗的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)中浸泡、清洗,使用眼科手術(shù)器械對組織進行預(yù)處理,剔除標本中的脂肪組織、血凝塊及壞死組織。配置含20μL/mL脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease I,DNase I)的Ⅱ型膠原酶溶液(1mg/mL),將預(yù)處理后的組織塊放置入該溶液內(nèi),同時將組織塊剪碎至1mm3左右,將溶液及組織塊一并置入37℃恒溫箱中消化4h,以稀釋方法終止消化,將溶液倒入70μm篩網(wǎng)過濾,以800r/min離心所獲溶液5min,此時取離心后沉淀物,加入培養(yǎng)液重新混懸細胞,并將其接種于5cm培養(yǎng)皿中,置入含5%CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng),接種6~8h后觀察細胞,在觀察到有較多細胞貼壁現(xiàn)象出現(xiàn)后,隨即進行首次細胞換液,以棄去未貼壁細胞,隨后按常規(guī)方法進行細胞的培養(yǎng)、傳代。
收集對數(shù)期生長的細胞,按(5×10)/孔接種至96孔板內(nèi),根據(jù)分組情況加入相應(yīng)藥物處理,培養(yǎng)24h、48h,于檢測孔內(nèi)加入50μL MTT溶液(5mg/mL)后,將孔板繼續(xù)培養(yǎng)4h,棄去孔板內(nèi)上清液后,于相應(yīng)檢測孔中加入DMSO溶液(150μL),將孔板充分搖勻,轉(zhuǎn)運至酶聯(lián)免疫檢測儀,用490nm波長檢測相應(yīng)研究孔內(nèi)液體的吸光度值(optical density,OD)。
收集細胞并使用70%乙醇固定,PBS洗滌,隨后用染色緩沖液洗滌,將1×106個細胞重新懸浮在0.5mL的碘化丙啶(含核糖核酸酶,PI/RNase)染色緩沖液中,并將細胞在室溫下避光孵育15min。使用FACSCantoⅡ流式細胞儀(BD biosciences)分析細胞周期的分布。
使用PE Annexin V Apoptosis Detection Kit Ⅰ檢測試劑盒(BD biosciences)進行細胞凋亡檢測,收集細胞并用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌2次,向每個樣品中加入5μL PE-Annexin V溶液和5μL 7-氨基放線菌素D(7-AAD)溶液,將細胞在室溫下孵育15min,使用FACSCantoⅡ流式細胞儀進行檢測。
收集不同分組的細胞,使用放射免疫沉淀法裂解緩沖液(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)離心提取蛋白,經(jīng)制膠、相應(yīng)細胞提取蛋白上樣、電泳、濕式轉(zhuǎn)膜,加入需檢測蛋白的相應(yīng)一抗,4℃孵育12h,清洗后加入相應(yīng)二抗孵育,清洗后發(fā)光拍照、儲存結(jié)果,測量PCNA/β-Actin、Bcl-2/β-Actin相對蛋白表達量。α-Actin為平滑肌細胞的標志物之一;β-Actin為人體細胞內(nèi)恒定表達的一種蛋白,其表達量在細胞中穩(wěn)定,因此免疫印跡法實驗是檢測目標蛋白與β-Actin的比值來確定目標蛋白的變化趨勢。
獲取手術(shù)切除的子宮平滑肌瘤組織,進行HE染色及α-Actin染色、ER染色,確定該組織可用于原代培養(yǎng),見圖1a~圖1c;其中HE染色中蘇木素將細胞核染色為紫色,伊紅將胞漿染色為紅色,進而可以通過觀察細胞胞漿及細胞核的形態(tài)來確定細胞類型,此處HE染色的目的是明確原代培養(yǎng)的組織來源確定為子宮肌瘤組織,而非結(jié)締組織、脂肪或其他組織,見圖1a;免疫組化實驗原理為通過一抗、二抗及DAB染色將目標蛋白標記,如出現(xiàn)棕色染色,則提示該區(qū)域有目標蛋白的表達;α-Actin、ER均為子宮平滑肌瘤的標記蛋白,免疫組化染色結(jié)果證實提示培養(yǎng)所得細胞表達這兩種標記蛋白,結(jié)合細胞形態(tài)可以證實原代培養(yǎng)所得細胞即為子宮平滑肌瘤細胞,見圖1b。使用酶消化法提取子宮平滑肌瘤原代細胞,經(jīng)首次換液3d后,可見所提取細胞已完全伸展,細胞形態(tài)上呈長梭形,繼續(xù)培養(yǎng)7~8d時,原代細胞生長活躍,呈平行排列,大小一致,細胞胞漿豐富;于光鏡下觀察,可見細胞輪廓清楚,細胞核清晰,多呈桿狀或類圓形,見圖1d。行細胞免疫組化染色,α-Actin、ER均為陽性,見圖1e、圖1f。行細胞免疫熒光檢測,免疫熒光根據(jù)使用的二抗類型不同,陽性結(jié)果可呈現(xiàn)出綠色熒光或紅色熒光,DAPI染色細胞核呈藍色,因此如細胞內(nèi)可見紅色/綠色熒光,則提示目標蛋白在該細胞中表達,此處免疫熒光檢測目的為進一步證實原代培養(yǎng)所得細胞表達子宮平滑肌瘤細胞的標記蛋白,可見α-Actin(+)、ER-α(+)及ER-β(+),與組織染色結(jié)果一致,原代培養(yǎng)成功,見圖1g~圖1i。
應(yīng)用MTT實驗檢測TSEC組、E+P組、E組和對照組的細胞分別于24h、48h的OD值。在24h時間點,TSEC組與對照組OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.984,P=0.071),而E+P組(t=-30.113,P<0.001)、E組(t=-16.148,P<0.001)分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;在48h時間點,TSEC組與對照組OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.997,P=0.069),而E+P組(t=-23.553,P<0.001)、E組(t=-16.432,P<0.001)分別與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,見表1、圖2a。
常規(guī)培養(yǎng)子宮平滑肌瘤原代細胞,應(yīng)用免疫印跡法技術(shù)檢測各組細胞中PCNA蛋白表達情況,結(jié)果顯示,對照組細胞中PCNA蛋白表達水平低于E+P組(1.04±0.03 vs.1.23±0.04,t=-23.267,P<0.001),對照組同樣低于E組(1.04±0.03 vs.1.15±0.01,t=-13.472,P<0.001),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;對照組細胞中PCNA蛋白表達水平與TSEC組比較(1.04±0.03 vs.1.02±0.05,t=-2.449,P=0.627),差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖2b。
應(yīng)用流式細胞儀檢測TSEC組、E+P組、E組及對照組的細胞周期變化,結(jié)果顯示,與對照組相比,E+P組、E組細胞G1/S時相轉(zhuǎn)換減弱,而TSEC組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(E+P組 vs.對照組,t=-17.642,P<0.001;E組 vs.對照組,t=-21.367,P<0.001;TSEC組 vs.對照組,t=-2.039,P=0.097,見圖2c。
表1 MTT實驗結(jié)果Table 1 MTT experiment results
常規(guī)培養(yǎng)子宮平滑肌瘤原代細胞,使用免疫印跡法技術(shù)檢測各組干預(yù)后細胞中Bcl-2蛋白表達情況,結(jié)果顯示,對照組細胞中Bcl-2蛋白表達水平低于E+P組(0.63±0.04 vs.1.17±0.01,t=-66.136,P<0.001),對照組同樣低于E組(0.63±0.04 vs.1.04±0.02,t=-50.215,P<0.001),差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;而對照組細胞中Bcl-2蛋白表達水平與TSEC組比較(0.63±0.04 vs.0.62±0.01,t=1.225,P=0.289),差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見圖3a、圖3b。
應(yīng)用流式細胞儀檢測TSEC組、E+P組、E組及對照組的細胞凋亡情況,結(jié)果顯示,與對照組相比,E+P組、E組細胞凋亡減少,而TSEC組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(E+P組 vs.對照組,t=23.097,P<0.001;E組 vs.對照組,t=20.972,P<0.001;TSEC組 vs.對照組,t=0.202,P=0.850),見圖3c。
將SERMs與雌激素配伍,可能對MHT的有效性和安全性都更加有益[6]。婦女健康研究組織(Women′s Health Initiative,WHI)于2011年在MHT指南中提出了TSEC方案,與傳統(tǒng)的由雌孕激素形成的MHT方案相比較,TSEC將孕激素成份替換為SERMs,避免了孕激素可能帶來乳腺癌發(fā)病增高的風(fēng)險,減輕了治療過程中患者對MHT副作用的恐慌,還保持了雌激素的有益作用,彌補了SERMs類藥物因雌激素撤退而導(dǎo)致的潮熱等副反應(yīng),提高了機體耐受性。子宮平滑肌瘤為性激素依賴性腫瘤,長期的雌激素暴露將導(dǎo)致子宮平滑肌瘤體積增加。MHT為外源性添加雌孕激素,因此對患有子宮平滑肌瘤的圍絕經(jīng)期婦女可能存在導(dǎo)致肌瘤體積增長的風(fēng)險。研究表明,SERMs可通過調(diào)節(jié)子宮平滑肌瘤細胞的增殖及凋亡,抑制肌瘤的生長,甚至減小肌瘤的體積[7]。而SERMs與雌激素配伍組成TSEC作為MHT的策略,對圍絕經(jīng)期女性子宮平滑肌瘤的影響尚未見相關(guān)報道。
本研究顯示,TSEC組對子宮平滑肌瘤細胞增殖能力無明顯影響,而E+P組、E組則促進了子宮平滑肌瘤細胞的增殖。TSEC對子宮平滑肌瘤細胞增殖能力無明顯影響的機制可能與該用藥方案中SERMs的抗雌激素活性相關(guān)。SERMs存在組織特異性,在骨骼血管系統(tǒng)中表現(xiàn)為雌激素受體激動劑,而在子宮、乳房中表現(xiàn)為雌激素受體拮抗劑[8]。作為二代SERMs的雷洛昔芬在體內(nèi)實驗中均顯示出對子宮平滑肌瘤細胞的一致抑制作用[9],Chung等[10]的體外研究提示,雷洛昔芬顯示出比米非司酮更顯著的肌瘤細胞活性和增殖抑制能力。而新一代的SERMs,如巴多昔芬[11]、歐派米芬[12]同樣可能對肌瘤細胞具有拮抗性活動,但仍然需要大規(guī)模的隨機臨床試驗來確定其安全性。TSEC方案是在SERMs的基礎(chǔ)上同時添加雌激素,人類雌激素受體包含α和β兩種不同亞型,分別由兩組獨立的基因編碼,其中雌激素受體α為高親和力受體,但容量低;相反,雌激素受體β為低親和力、高容量,二者的轉(zhuǎn)錄、激活與抑制分別由不同的信號通路介導(dǎo)。子宮平滑肌瘤的雌激素受體比例失調(diào)是其發(fā)病機制之一。在子宮平滑肌瘤組織中,ER-α和ER-β的信使RNA(messenger RNA,mRNA)均呈高表達狀態(tài),但ER-α的蛋白表達并未升高,這可能是由于轉(zhuǎn)錄后修飾作用使得ER-α的雌二醇結(jié)合位點缺失,或者ER-α的mRNA錯誤翻譯,肌瘤組織中ER-β的表達升高2~3倍,因此α和β受體基因的差異表達可能在肌瘤組織的生長中起到了關(guān)鍵作用。有文獻報道,SERMs對ER-α的抑制作用較強,而對ER-β只有較弱的抑制作用[13]。TSEC方案中的雌激素可能通過與ER-β相互作用,誘導(dǎo)肌瘤細胞的生長,從而拮抗了SERMs的抗增殖效應(yīng)。本研究中TSEC組表現(xiàn)出對子宮平滑肌瘤細胞無明顯促增殖的作用。
本研究中可見E+P組細胞增殖活躍,其原因除了雌激素促進細胞的生長作用外,孕激素的作用也占有重要地位。子宮平滑肌瘤的生長與孕激素水平密切相關(guān),其機制為孕激素具有促進肌瘤細胞的有絲分裂及生長的功能。Moro等[14]的臨床研究表明,應(yīng)用雌激素+孕激素存在導(dǎo)致子宮平滑肌瘤體積增大的風(fēng)險;本研究結(jié)果與其結(jié)論一致,雌孕激素連續(xù)聯(lián)合對子宮平滑肌瘤有促進作用,而據(jù)本研究中TSEC組與對照組的MTT及細胞周期測定等實驗結(jié)果顯示,TSEC對肌瘤細胞的增殖無明顯影響,提示TSEC對肌瘤患者可能具有更好的安全性。
Bcl-2蛋白屬于凋亡抑制基因,相應(yīng)蛋白的表達增高提示細胞凋亡能力的減弱[15]。本研究顯示,TSEC組Bcl-2蛋白表達水平與對照組相比無明顯變化,且TSEC組Bcl-2蛋白表達明顯低于E+P組及E組;提示TSEC組對子宮平滑肌瘤細胞凋亡能力無明顯抑制作用,這可能同樣與TSEC中SERMs的作用相關(guān)。Jin等[16]的體外實驗表明,SERMs對子宮平滑肌瘤細胞促凋亡的調(diào)節(jié)作用為濃度依賴性,低濃度的SERMs可抑制Bcl-2蛋白的表達。本研究中免疫印跡法及凋亡實驗結(jié)果均提示,E+P組、E組對肌瘤細胞具有抑制凋亡作用,對子宮平滑肌瘤具有潛在的促進風(fēng)險。
綜上,本研究結(jié)果顯示,TSEC對子宮平滑肌瘤細胞的增殖及凋亡無明顯影響,TSEC較E+P等MHT方案在對子宮平滑肌瘤細胞的影響中可能具有更好的安全性。在未來的研究中將通過改變TSEC中兩種藥物的濃度及比例,在安全有效治療絕經(jīng)綜合征的同時,爭取達到治療子宮平滑肌瘤的目的。