趙新，吳勇杰，閆抗抗，龍強

西北大學(xué)附屬醫(yī)院·西安市第三醫(yī)院1藥劑科，3泌尿外科，西安 710018 2蘭州大學(xué)藥理研究所，蘭州 730000

膀胱癌是男性常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，患者主要表現(xiàn)為血尿、尿頻、排尿困難等癥狀，明顯影響患者的生活質(zhì)量[1]。經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）是目前治療非肌層浸潤性膀胱癌的主要方法，臨床一般與化療聯(lián)合應(yīng)用，以降低腫瘤復(fù)發(fā)率，但化療可導(dǎo)致明顯的不良反應(yīng)，部分患者的耐受性較差[2]。因此，研制出膀胱癌治療效果好、不良反應(yīng)小、價格低廉的化療藥物有重要意義。蛇葡萄素（ampelopsin，AMP）屬于黃酮類化合物，具有抑制細(xì)菌生長、降低血糖、提高疼痛閾值、抗氧化等作用[3-4]。近年來，關(guān)于AMP抗腫瘤的研究逐漸增多，有研究表明AMP可以抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移、下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）的表達(dá)、激活caspase 3通路，且對人肺癌GLC-82裸鼠移植瘤及人肝癌Bel-7402細(xì)胞均有明顯的抑制作用[5-8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，對小鼠注射AMP鈉鹽（AMP-Na）后，AMP-Na在小鼠前列腺、膀胱組織及尿液中的藥物濃度均較高，且持續(xù)時間長，主要以有活性的原型藥物形式進行排泄[9]。據(jù)此推斷AMP可能對膀胱腫瘤有治療優(yōu)勢，因此本研究選擇人膀胱癌J82細(xì)胞株進行研究，旨在探討AMP對人膀胱癌J82細(xì)胞增殖和凋亡的影響及相關(guān)作用機制，為AMP的臨床應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器

人膀胱癌細(xì)胞株J82購自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫。AMP凍干劑購自廣東泰禾醫(yī)藥科技有限公司，順鉑購自齊魯制藥有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl terazolium，MTT）購自美國Sigma公司，p-Bcl-2（Ser70）購自美國 Santa公司，p-Bad（Ser136）、人抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）-連接抗體均購自美國Cell Sign Technology公司。CO2培養(yǎng)箱購自美國Shellab公司，ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Tek公司，Epics XL型流式細(xì)胞儀購自美國Beckman-Coulter公司，JY-SCZ2+型垂直電泳槽購自北京君意東方有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的人膀胱癌J82細(xì)胞，置于RPMI1640培養(yǎng)液中充分混勻后，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察，每2～3天傳代1次。

1.2.2 MTT比色法檢測細(xì)胞抑制情況 取對數(shù)生長期的人膀胱癌J82細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至8×104/L，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔90μl，將96孔培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中，37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h。向細(xì)胞懸液中加入10 μl不同濃度（分別為40.00、44.74、50.04、55.96、62.59、70.00 μg/ml）的AMP，以細(xì)胞懸液+藥物溶媒為陰性對照、完全培養(yǎng)液+藥物溶媒為空白對照、完全培養(yǎng)液+不同濃度的AMP為顏色對照，每個濃度和對照組均設(shè)置3個復(fù)孔。AMP作用48、72 h后，每孔加入10 μl的MTT（濃度為5 mg/ml）繼續(xù)孵育4 h，加入10%的十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS），終止培養(yǎng)。微量振蕩器振蕩使結(jié)晶物充分溶解，使用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm處的光密度（optical density，OD）值。計算抑制率（inhibition rate，IR），IR=（陰性對照OD均值-受試藥OD均值）/陰性對照OD均值×100%，其中陰性對照OD均值=陰性對照OD均值-空白對照OD均值，受試藥OD均值=受試藥OD均值-顏色對照OD均值。采用Curve Expert 1.3軟件計算半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的人膀胱癌J82細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至8×104/L，每100 ml培養(yǎng)瓶加入9 ml細(xì)胞懸液后移入培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使其貼壁。分別向細(xì)胞懸液中加入 1 ml 40.00、50.04、62.59 μg/ml的 AMP，分別作為 40.00 μg/ml AMP 組、50.04 μg/ml AMP 組、62.59 μg/ml AMP組，向細(xì)胞懸液中加入1 ml 2.00 μg/ml的順鉑，作為陽性對照組，以細(xì)胞懸液+1 ml藥物溶媒為陰性對照組。將培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)箱中，加入膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘 化 丙 啶（propidium iodide，PI）繼續(xù)培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 取對數(shù)生長期的人膀胱癌J82細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104/L，每100 ml培養(yǎng)瓶加入9 ml細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h使其貼壁。向細(xì)胞懸液中加入 1 ml濃 度 為 40.00 μg/ml的 AMP，作為40.00 μg/ml AMP組，向細(xì)胞懸液中加入1 ml濃度為2.00 μg/ml的順鉑，作為陽性對照組，以細(xì)胞懸液+藥物溶媒為陰性對照組。將培養(yǎng)瓶移至培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后離心收集細(xì)胞后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）沖洗2次，3%戊二醛固定過夜，使用透射電鏡觀察細(xì)胞。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞Bcl-2、Bad蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的人膀胱癌J82細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為8×104/L。每500 ml培養(yǎng)瓶中加入細(xì)胞懸液36 ml，培養(yǎng)24 h，使其貼壁。隨后分別加入 4 ml濃度為 0、40.00、50.04、62.59、70.00 μg/ml的AMP，然后將濃度為0、40.00、50.04、62.59 μg/ml的細(xì)胞移入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，濃度為70.00 μg/ml的細(xì)胞移入培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、48 h。用預(yù)冷的PBS沖洗培養(yǎng)瓶底的貼壁細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀將培養(yǎng)瓶底的貼壁細(xì)胞輕輕刮下，離心收集細(xì)胞，并將其與培養(yǎng)基里收集的細(xì)胞合并。冰上裂解30 min，離心吸取上清，即為所提取的蛋白。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離蛋白樣品，脫脂奶粉封閉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜1 h。加入p-Bcl-2、p-Bad一抗，加入HRP標(biāo)記的二抗，取出PVDF膜，洗滌3次，每次5 min。洗膜后電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）法顯色并曝光，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的AMP對人膀胱癌J82細(xì)胞增殖能

力的影響

不同濃度AMP處理人膀胱癌J82細(xì)胞48、72 h，IR隨AMP濃度升高、作用時間的延長而升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），具有明顯的濃度依賴性和時間依賴性（表1）。AMP處理48 h的IC50為（57.16±1.86）μg/ml，明顯高于AMP處理72 h的（45.00±3.54）μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.776，P=0.006）。

表1 不同濃度AMP處理人膀胱癌J82細(xì)胞48、72 h時IR的比較（%，±s）

表1 不同濃度AMP處理人膀胱癌J82細(xì)胞48、72 h時IR的比較（%，±s）

A M P濃度（μ g/m l）4 0.0 0 4 4.7 4 5 0.0 4 5 5.9 6 6 2.5 9 7 0.0 0 F值P值7.9 2±3.3 9 2 0.5 1±5.5 1 3 0.3 5±5.1 7 4 7.7 6±1.4 1 6 4.9 6±1 0.4 1 7 9.3 5±1 0.3 8 4 6.7 6 6 0.0 0 0 3 7.8 4±3.2 4 5 0.3 3±8.5 5 5 9.0 2±1 1.6 5 7 4.9 7±1 1.6 1 7 9.5 9±1 0.2 9 8 8.1 7±2.3 7 1 4.2 0 6 0.0 0 0 4 8 h 7 2 h

2.2 不同濃度的AMP對人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡情況的影響

40.00、5 0.04、62.59 μg/ml AMP 組和陽性對照組人膀胱癌J82細(xì)胞的總凋亡率均高于陰性對照組，40.00、50.04、62.59 μg/ml AMP 組人膀胱癌 J82細(xì)胞的總凋亡率均高于陽性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨著AMP濃度的增加，人膀胱癌J82細(xì)胞存活細(xì)胞率逐漸降低，早期凋亡率先上升后下降，晚期凋亡率和總凋亡率均逐漸升高。（表2、圖1）

表2 不同濃度的AMP處理人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡率的比較（%，±s）

表2 不同濃度的AMP處理人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡率的比較（%，±s）

注：a與陰性對照組比較，P＜0.05；b與陽性對照組比較，P＜0.05

組別陰性對照組4 0.0 0 μ g/m l A M P組5 0.0 4 μ g/m l A M P組6 2.5 9 μ g/m l A M P組陽性對照組F值P值9 8.5 3±1.5 9 4 2.3 7±7.2 5 a 2 6.1 3±1.4 0 a 1 0.2 7±5.9 5 a 6 5.0 0±7.9 9 a 6 2.9 7 2 0.0 0 0 0.0 4±0.0 3 4 8.9 0±1 1.1 2 a 6 3.5 7±2.4 0 a 1 9.5 6±1 6.2 5 3 1.2 7±1 1.5 4 a 1 7.4 9 3 0.0 0 0 0.0 9±0.0 5 8.4 5±2.6 7 a 1 0.0 6±3.2 1 6 8.9 0±3.6 2 a 3.2 6±1.1 3 1 8.6 1 0 0.0 0 0 0.1 1±0.0 2 5 7.3 5±7.2 0 a b 7 3.6 2±1 1.2 5 a b 8 8.4 6±6.2 7 a b 3 4.5 3±8.3 4 a 6 2.8 6 8 0.0 0 0存活細(xì)胞早期凋亡晚期凋亡總凋亡

圖1 不同濃度AMP對人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡情況的影響

2.3 透射電鏡觀察AMP對人膀胱癌J82細(xì)胞形態(tài)的影響

40.00 μg/ml的AMP、2.00 μg/ml的順鉑作用于人膀胱癌J82細(xì)胞48 h后，透射電鏡下可見凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)凋亡小體。（圖2）

圖2 透射電鏡觀察各組J82細(xì)胞形態(tài)（×5000）

2.4 不同濃度的AMP對人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡抑制蛋白p-Bad、p-Bcl-2表達(dá)的影響

作用 48 h，0、40.00、50.04、62.59 μg/ml的 AMP處理的人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡抑制蛋白p-Bad、p-Bcl-2相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。作用12、24、48 h，70 μg/ml的AMP處理的人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡抑制蛋白p-Bad、p-Bcl-2相對表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.750、7.403，P＜0.05）；70 μg/ml的AMP處理的人膀胱癌J82細(xì)胞處理24、48 h后，凋亡抑制蛋白p-Bad、p-Bcl-2的相對表達(dá)量均低于處理12 h時，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 不同時間不同濃度AMP處理的人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡抑制蛋白p-Bad、p-Bcl-2相對表達(dá)量的比較（±s）

表3 不同時間不同濃度AMP處理的人膀胱癌J82細(xì)胞凋亡抑制蛋白p-Bad、p-Bcl-2相對表達(dá)量的比較（±s）

注：*與70.00 μg/ml的AMP處理人膀胱癌J82細(xì)胞12 h比較，P＜0.05

A M P濃度（μ g/m l）0 4 0.0 0 5 0.0 4 6 2.5 9 7 0.0 0 7 0.0 0 7 0.0 0 4 8 4 8 4 8 4 8 1 2 2 4 4 8 0.4 3±0.0 6 0.3 9±0.0 4 0.3 6±0.0 4 0.3 4±0.0 7 0.3 6±0.0 7 0.3 0±0.0 6*0.2 3±0.0 2*0.6 1±0.0 8 0.5 8±0.1 2 0.4 2±0.1 1 0.3 9±0.0 9 0.4 6±0.1 0 0.3 4±0.0 9*0.3 0±0.0 8*作用時間（h）p-B a d p-B c l-2

3 討論

膀胱癌發(fā)病機制復(fù)雜，目前，膀胱癌的發(fā)生主要與遺傳、吸煙、致癌物接觸等有關(guān)，其中氨甲蝶呤、長春新堿、表柔比星等均是常用的膀胱癌術(shù)后灌注藥物，但上述藥物在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時會對正常組織細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，且復(fù)發(fā)率高、容易產(chǎn)生耐藥性，使臨床應(yīng)用受到一定限制[10]。AMP廣泛存在于藤茶等植物中，是具有多種生物活性的黃酮類物質(zhì)，研究認(rèn)為，AMP可對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，但并未對正常細(xì)胞產(chǎn)生明顯的促凋亡效果[11]。研究發(fā)現(xiàn)，AMP能夠通過抑制新生血管生成、抑制細(xì)胞增殖、激活氧化應(yīng)激等生理過程，促進乳腺癌等腫瘤細(xì)胞的凋亡[12]。明確AMP對人膀胱癌J82細(xì)胞增殖、凋亡等的影響，可為臨床膀胱癌的治療提供新的方向。

Zhao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，AMP能夠通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，且僅對腎細(xì)胞癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性。Truong等[14]探討AMP對MDA-MB-231/IR細(xì)胞的抑制作用顯示，AMP可通過腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）/核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路來誘導(dǎo)MDA-MB-231/IR細(xì)胞凋亡，抑制其干細(xì)胞特征，并通過抑制上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制MDA-MB-231/IR細(xì)胞的遷移能力。此外，AMP還可通過降低MDA-MB-231/IR細(xì)胞的耗氧率抑制三磷酸腺苷的產(chǎn)生，以明顯削弱氧化磷酸化作用。Li等[15]通過培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞，探討AMP抗乳腺癌的機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AMP誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡與線粒體功能障礙有關(guān)，包括線粒體膜電位的喪失、大量活性氧的產(chǎn)生等生理機制。

本研究結(jié)果顯示，AMP可明顯抑制人膀胱癌J82細(xì)胞的增殖，且其抑制效果具有濃度依賴性和時間依賴性，其中70 μg/ml的AMP作用72 h后，IR可達(dá)88.17%，提示AMP抗腫瘤效果較好。流式細(xì)胞術(shù)是檢測細(xì)胞凋亡的常用方法，能夠?qū)υ缙诘蛲?、壞死?xì)胞等進行有效區(qū)分。其中J82細(xì)胞經(jīng)過離心等操作后可促使少量的細(xì)胞凋亡和壞死，加入AMP后，可見細(xì)胞凋亡率明顯提高[16]。本研究中，低濃度AMP處理J82細(xì)胞時，細(xì)胞以早期凋亡為主，隨著AMP濃度的增加，J82細(xì)胞的晚期凋亡率逐漸增加。由此可見，隨著AMP濃度的升高，J82細(xì)胞從正常細(xì)胞向凋亡早期，進而向凋亡晚期發(fā)展。表明AMP誘導(dǎo)的人膀胱癌J82細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡均具有濃度依賴性。表明AMP發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一可能是誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并進一步促進細(xì)胞凋亡壞死[17]。

細(xì)胞凋亡下細(xì)胞形態(tài)可發(fā)生明顯變化，包括染色質(zhì)濃縮、凋亡小體形成等。本研究結(jié)果顯示，透射電鏡下可見凋亡小體和細(xì)胞質(zhì)濃縮，進一步表明AMP可誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的發(fā)生機理復(fù)雜，生理狀態(tài)下，p-Bad可與14-3-3蛋白結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，穩(wěn)定存在于細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)。研究顯示，Bad去磷酸化后可發(fā)揮促進細(xì)胞凋亡的效應(yīng)[18-19]，Bcl-2發(fā)生磷酸化會增強其抗凋亡活性[20]，本研究選取的是70位點磷酸化的p-Bcl-2。本研究為探索AMP誘導(dǎo)J82細(xì)胞凋亡的機制，檢測了抗細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-Bcl-2、p-Bad的相對表達(dá)量，結(jié)果顯示，AMP能夠下調(diào)抗細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白p-Bcl-2、p-Bad的相對表達(dá)量。表明AMP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的可能的發(fā)生機制。本研究中，p-Bcl-2、p-Bad的相對表達(dá)量隨AMP濃度升高、給藥時間的延長而逐漸降低。表明AMP可能通過下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白p-Bcl-2、p-Bad的表達(dá)促進人膀胱癌J28細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，AMP可有效抑制人膀胱癌J82細(xì)胞的增殖，促進其凋亡，其誘導(dǎo)機制可能與其能夠下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白p-Bad、p-Bcl-2的表達(dá)有關(guān)，但AMP對膀胱癌細(xì)胞的作用機制復(fù)雜，仍需要深入探討。