周曉玲,姚 迪

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院:1.檢驗科；2.呼吸與危重醫(yī)學科,湖北恩施 445000

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，導(dǎo)致肺癌發(fā)生的原因較多，其中與生活方式有關(guān)的主要有吸煙、長期應(yīng)激壓力以及遺傳等因素[1]。然而吸煙史并不是肺癌發(fā)生的決定性因素，且不同的個體對吸煙所產(chǎn)生的尼古丁等致癌物質(zhì)代謝能力存在差異，這種個體差異影響了肺癌的發(fā)生率[2]。目前關(guān)于吸煙人群體內(nèi)的多種化合物代謝酶類基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展是否存在聯(lián)系尚缺乏系統(tǒng)性研究。細胞色素酶P450(CYP450)是一類在人體內(nèi)廣泛分布的氧化還原酶，參與體內(nèi)多種關(guān)鍵物質(zhì)的代謝。CYP450家族中的細胞色素酶P4502E1(CYP2E1)被報道參與煙草中亞硝酸胺和苯胺的代謝[3]。除CYP450外，有研究報道稱谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)的多態(tài)性與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[4]。在GST家族中，由谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶M1(GSTM1)表達水平及基因型被報道與胃癌、肺癌等癌癥的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)性[5]。流行病學調(diào)查顯示，GSTM1的基因多態(tài)性可分為存在活性的GST(+)和無活性的GST(-)兩種，且在不同人種間GSTM1的基因頻率存在較大差異。本研究擬通過聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)測序的方式了解CYP2E1和GSTM1基因型在吸煙人群中的分布及兩者與吸煙人群非小細胞肺癌發(fā)生之間的關(guān)系，旨在為肺癌預(yù)防提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年1月至2020年1月間在本院就診并確診為非小細胞肺癌患者70例作為肺癌組，其中男42例，女28例；平均年齡(57.6±10.7)歲；鱗癌26例，腺癌31例，腺鱗癌13例。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理檢查確診，且有10年以上吸煙史，每日吸煙10支及以上。另選取同期住院的肺良性疾病患者70例作為對照組，其中男50例，女20例；平均年齡(53.4±9.2)歲；均無肺癌家族史和職業(yè)性致癌接觸史，且有10年以上吸煙史，每日吸煙10支及以上。排除標準：并發(fā)有其他癌癥或具有癌癥史；年齡>80歲。兩組患者在年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(P>0.05)，具有可比性。

1.2標本采集和DNA提取 于清晨空腹采集所有研究對象靜脈血2 mL，將標本置于抗凝管中擬用于DNA提取。使用上海生工生物責任有限公司提供的血液基因組提取試劑盒，操作步驟嚴格依據(jù)說明書進行，提取的DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳測試驗證質(zhì)量和濃度。質(zhì)量和濃度合格的標本保存于-20 ℃冰箱待后續(xù)PCR擴增和測序。

1.3主要儀器和試劑 通用電泳儀(美國伯樂責任有限公司)、凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂責任有限公司)、基因鏈式反應(yīng)擴增儀(美國賽默飛責任有限公司)。主要試劑：PCR合成試劑盒(大連寶生物工程有限公司)、瓊脂糖凝膠(西班牙Biowest責任有限公司)、TAE緩沖液(上海生工生物責任有限公司)。

1.4基因PCR擴增和測試 本文所用引物如下，CYP2E1基因使用引物：CYP450上游引物為5'-TTC ATT CTG TCT TCT AAC TGG- 3',CYP450下游引物為5'-CCA GTC GAG TCT ACA TTG TCA-3'；GSTM1基因使用引物：GST上游引物為5'-GAA CTC CCT GAA AAG CTA AAGC-3',GST下游引物為5'-GTT GGG CTC AAA TAT ACG GTG G-3'。采用三步法PCR，95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸 15 s。反應(yīng)35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳確認條帶正確后回收，并測序。CYP450目的片段長度為410 bp，GST目的片段長度為216 bp。均采用測序的方式確定CYP450基因型為 c1型或c2型及GST的基因型為GST(+)或GST(-)。測序服務(wù)由北京擎科生物科技責任有限公司負責。

2 結(jié) 果

2.1CYP450基因型分布及與非小細胞肺癌風險相關(guān)性 對肺癌患者和對照組患者CYP2E1基因的多態(tài)性進行檢測和比較發(fā)現(xiàn)，肺癌組和對照組c1/c1、c1/c2、c2/c2基因型的檢出率分別為40.0%(28/70)、35.7%(25/70)、24.3%(17/70)和27.1%(19/70)、41.4%(29/70)、31.4%(22/70)，以c2/c2基因型個體OR值為1，c1/c1基因型個體肺癌OR為1.907(95%CI=0.413～8.209,P<0.05)，見表1。

表1 CYP450基因型分布及與非小細胞肺癌風險相關(guān)性[n(%)]

2.2GST基因型分布及與非小細胞肺癌風險相關(guān)性 對肺癌組和對照組患者GSTM1基因的多態(tài)性進行檢測和比較發(fā)現(xiàn)，肺癌組和對照組GST(+)和GST(-)基因型的檢出率分別為40.0%(26/70)、35.7%(44/70)和51.4%(36/70)、48.5%(34/70)，以GST(-)基因型個體OR值為1，GST(+)基因型個體肺癌OR為0.546(95%CI=0.109～1.104,P<0.05)，見表2。

表2 GST基因型分布及與非小細胞肺癌風險相關(guān)性[n(%)]

2.3CYP450基因型與GST基因型共同分布對非小細胞肺癌風險的影響 進一步考察兩基因是否存在協(xié)同效應(yīng)，本研究以c1/c2+c2/c2/GST(+)肺癌OR值為1，c1/c2+c2/c2/GST(-)、c1/c1/GST(-)、c1/c1/GST(-)基因型個體肺癌的OR值分別為2.315，2.412，4.878，其中c1/c1/GST(-)基因型個體肺癌的OR值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 CYP450基因型與GST基因型共同分布對與非小細胞肺癌風險影響[n(%)]

3 討 論

近年來的流行病學統(tǒng)計顯示，肺癌仍然是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，尤其是在男性中，是因癌癥死亡的最主要癌癥類型[1,6]。在肺癌中，以非小細胞肺癌為主要發(fā)病類型。雖然非小細胞肺癌患者預(yù)后優(yōu)于小細胞肺癌患者，但仍是因癌癥死亡的主要病因之一。流行病學顯示，非小細胞肺癌的發(fā)生除與如吸煙史有關(guān)外，還與遺傳因素有關(guān)如抑癌基因功能缺失或原癌基因突變等。吸煙史是肺癌發(fā)生最重要的危險因素，然而并非所有的吸煙者最終都會發(fā)展為非小細胞肺癌[7]。本研究擬探討人體參與致癌分子解毒代謝的兩類主要酶類：Ⅰ相代謝酶CYP450和Ⅱ相代謝酶谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因型與吸煙人群癌癥發(fā)生率之間的相關(guān)性。

CYP450屬于細胞解毒超家族之一，是人體內(nèi)重要的Ⅰ相代謝酶，負責致癌物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化中的氧化還原。將具有毒性或致癌化合物代謝為無毒性的代謝產(chǎn)物。人體內(nèi)負責合成CYPP450的基因有十余種，可大致分為CYP1、CYP2和CYP3三個家族，三者在肝臟中P450總量的70.0%以上并負責多數(shù)內(nèi)源性和外源性化合物的代謝。其中，CYP2E1被報道參與癌癥相關(guān)化合物的代謝。CYP2E1基因的多態(tài)性，可以大體分為c1和c2兩個基因型。其中c2基因型表達的CYP2E1具有催化功能和代謝香煙煙霧中亞硝酸胺的活性，而c1基因型表達的CYP2E代謝亞硝酸胺的活性則較弱[8]。在對人群中c1和c2基因型分布的研究中發(fā)現(xiàn)，不同人群中c1和c2的分布差異較大。在肺癌組和對照組CYP450基因多態(tài)性的比較中發(fā)現(xiàn)，兩組患者中c1/c1、c1/c2、c2/c2基因型的檢出率分別為40.0%(28/70)、35.7% (25/70)、24.3% (17/70)和27.1% (19/70)、41.4% (29/70)、31.4% (22/70)。在對照組人群中c1和c2等位基因的比例大致為1∶1，c2等位基因頻率相較于其他國內(nèi)研究更高[9]，而在肺癌組中，這一比例與國內(nèi)其他研究相當[10]。以c2/c2基因型個體肺癌OR值為1，c1/c1個體肺癌OR為1.907，經(jīng)年齡、性別等因素校正后c1/c1和c2/c2純合子之間的差異具有統(tǒng)計學意義。這提示，在吸煙人群中攜帶c1純合體基因的個體發(fā)生非小細胞肺癌的概率會增加，進一步證實CYP450參與了尼古丁等吸煙相關(guān)致癌物質(zhì)的氧化代謝，而轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點存在突變的c1純合子降低了CYP450的表達水平從而影響了對致癌物質(zhì)的代謝。WU等[11]研究發(fā)現(xiàn)在臺灣人群中，c2純合子的頻率僅為0.24%，而這一比例在日本人群中則高達24.00%～27.00%。有研究報道，c1純合子與肺腺癌的發(fā)生存在顯著相關(guān)性[12]。因此，是影響吸煙人群非小細胞肺癌發(fā)生的遺傳因素之一。

GST與P450類似也是細胞解毒蛋白超家族之一，大致包括GSTA、GSTK、GSTM、GSTP1、GSTS、GSTT、GSTZ1和GSTO等8個家族。與P450屬于Ⅰ相代謝酶不同，GST屬于Ⅱ相代謝酶。Ⅱ相代謝酶以與特定毒性物質(zhì)不可逆結(jié)合的方式參與機體內(nèi)毒性物質(zhì)清除的過程。8種主要的GST蛋白在不同組織中分布存在明顯差異，且特異性結(jié)合的毒性物質(zhì)也存在區(qū)別。GSTA主要表達于肝臟參與類固醇代謝途徑調(diào)節(jié)；GSTO則參與砷類毒性化合物的代謝；GSTZ1參與毒性化合物二氯醋酸的代謝；GSTM則是與癌癥發(fā)生最為密切，據(jù)報道，GSTM基因多態(tài)性和表達水平與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展存在相關(guān)性[13]。依據(jù)是否能表達具有活性的GSTM蛋白，GSTM的基因多態(tài)性可分為GSTM(-)和GSTM(+)兩類，其中GSTM(-)基因編碼的GSTM蛋白因缺乏管教的氨基酸殘基而缺乏活性，因此GSTM(-)純合子個體缺乏GSTM蛋白催化功能。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組和對照組GST(+)和GST(-)基因型的檢出率分別為37.1% (26/70)、62.9% (44/70)和51.4% (36/70)、48.6% (34/70)。在對照組中GST(-)基因型的檢出率與已有報道相近[14]，而在非小細胞肺癌患者中GST(-)基因型的檢出率相對較高。以GST(-)基因型個體肺癌OR值為1，GST(+)個體肺癌OR為0.546，經(jīng)年齡、性別等因素校正后GST(-)和GST(+)純合子及雜合子之間的差異具有統(tǒng)計學意義。提示GST同樣參與吸煙致癌物質(zhì)的代謝。因此，在存在GST功能缺失的GST(-)純合子個體中肺癌的發(fā)生概率顯著高于存在GST功能的人群。對不同人群中，GST基因多態(tài)性的調(diào)查顯示，GSTM(-)純合子個體在澳大利亞人中約為67.0%、高加索人中約為50.0%、尼日利亞人中約為20.0%[15]。同時，GSTM(-)純合子與結(jié)腸癌、肺癌和膀胱癌的發(fā)生存在相關(guān)性[13]。且還與急性髓性白血病患者的化療的療效相關(guān)[16]。因此，有理由相信，CYP450和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的基因多態(tài)性會影響吸煙人群的非小細胞肺癌靈敏度。

最后本研究進一步考察了兩者單獨和共同作用的影響，發(fā)現(xiàn)c1/c1純合同時GST(-)純合子個體肺癌靈敏度是c1/c2+c2/c2雜合以及GST(+)人群的4.8倍，提示兩者參與不同吸煙相關(guān)致癌物質(zhì)的分解代謝，因此當兩個基因都失效時，個體肺癌風險顯著增加效果較單一基因失效更為顯著。然而，本研究存在納入的樣本量限制，后期需擴大樣本量，進一步分析吸煙人群P450和GST基因多態(tài)性與肺癌易感性關(guān)系；并深入探究P450和GST基因多態(tài)性導(dǎo)致肺癌的可能機制。

綜上所述，CYP2E1和GSTM1可能參與了吸煙相關(guān)致癌物質(zhì)的解毒過程。攜帶功能缺失的GSTM1(-)和CYP450 c1/c1基因型人群非小細胞肺癌的風險顯著增高，同時攜帶兩個危險基因型的吸煙人群非小細胞肺癌發(fā)生風險提高約5倍。