劉榕孜 綜述，劉 峰 審校

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，廣西南寧 530021

胎兒及新生兒溶血病(HDFN)是指因母嬰血型不合，母體天然存在或經(jīng)輸血、妊娠等后天免疫刺激產(chǎn)生的針對(duì)胎兒紅細(xì)胞血型抗原的抗體，經(jīng)胎盤進(jìn)入胎兒血液循環(huán)，導(dǎo)致胎兒或新生兒同種免疫性溶血[1-2]，輕者可出現(xiàn)貧血、水腫、肝脾腫大，重者可能導(dǎo)致胎兒早期流產(chǎn)、胎兒發(fā)育停止和死亡，出生后的新生兒亦可以出現(xiàn)嚴(yán)重的核黃疸甚至死亡[1]?？紤]到HDFN的發(fā)病會(huì)貫穿整個(gè)妊娠過(guò)程，因此，如何盡早且精準(zhǔn)地篩查出具有高風(fēng)險(xiǎn)的HDFN妊娠事件，實(shí)施科學(xué)有效的妊娠監(jiān)管以保護(hù)胎兒順利生長(zhǎng)發(fā)育，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育，仍是當(dāng)前該領(lǐng)域研究的主流和熱點(diǎn)。

1 HDFN的分類

臨床上依據(jù)致病性血型抗體的不同，通?？煞譃锳BO-HDFN和非ABO-HDFN：(1)ABO-HDFN 多發(fā)生于血型為O型的母親，因其體內(nèi)天然存在IgG抗A及抗B，而胎兒遺傳了父系的A或B基因后可表達(dá)出相應(yīng)的A或B型抗原，母體IgG抗A和/或抗B透過(guò)胎盤后攻擊表達(dá)A/B抗原的胎兒紅細(xì)胞以及組織細(xì)胞，導(dǎo)致ABO-HDFN發(fā)病。目前國(guó)內(nèi)以ABO血型不合引起的HDFN多見(jiàn)。ABO-HDFN在母親首次懷孕即可發(fā)生。(2)非ABO-HDFN 除了輸血導(dǎo)致孕婦產(chǎn)生相應(yīng)的非抗A/B即意外抗體產(chǎn)生外，孕婦在妊娠期會(huì)出現(xiàn)胎兒母體出血(FMH)現(xiàn)象，胎兒紅細(xì)胞可進(jìn)入母體血液循環(huán)后，引發(fā)母體非ABO血型抗原同種免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的意外抗體，最常見(jiàn)于抗Rh抗體[3]，臨床上非ABO-HDFN以Rh-HDFN常見(jiàn)。Rh陰性女性首次懷孕Rh陽(yáng)性胎兒時(shí)，通常產(chǎn)生IgM抗體，不能穿過(guò)胎盤導(dǎo)致胎兒溶血；而再次懷孕Rh陽(yáng)性胎兒時(shí)，母體則會(huì)迅速產(chǎn)生IgG 抗體，其能有效穿過(guò)胎盤導(dǎo)致胎兒溶血反應(yīng)[3]。MNS、Kell、Kidd及 Duffy等其他血型系統(tǒng)不合亦可引起HDFN[4-5]。

2 紅細(xì)胞同種抗體特異性與HDFN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)、嚴(yán)重程度的相關(guān)性

發(fā)生HDFN的風(fēng)險(xiǎn)取決于幾個(gè)因素：紅細(xì)胞同種異體抗體的特異性、所涉及的血型抗原在胎兒紅細(xì)胞的表達(dá)水平等[2]。ABO血型系統(tǒng)中，抗A/B抗體是臨床上常見(jiàn)導(dǎo)致HDFN發(fā)病的原因，疾病多為輕度[6]。Rh血型系統(tǒng)中，抗D/C/c/E/e/G/CW/hrS/hrB/Ew/Goa/Rh32/Bea/Evans/Tark等抗體與HDFN發(fā)病相關(guān)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致胎兒死亡[6-7]。MNS血型系統(tǒng)中，抗M/S/s/U/Ena/Mia/Mur/Vw抗體與HDFN發(fā)病相關(guān)，其中抗M/Mia/Mur/Vw抗體可導(dǎo)致嚴(yán)重HDFN[6]。P1PK血型系統(tǒng)HDFN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)低，但抗PP1PK抗體(特別是抗P成分)與早期自然流產(chǎn)有關(guān)[6-8]。Kell血型系統(tǒng)中，所有的抗Kell抗體都可能導(dǎo)致HDFN，如抗K/k/Kpa/Kpb/Jsa/Jsb/Ula/KEL5/KEL11/KEL18/KEL22/KEL28抗體等，同時(shí)該抗體可通過(guò)抑制胎兒紅細(xì)胞生成導(dǎo)致胎兒貧血[6]。Duffy血型系統(tǒng)中，抗Fya/Fyb抗體與HDFN發(fā)病相關(guān)[6]。Kidd血型系統(tǒng)中，抗Jka/Jkb抗體與HDFN發(fā)病相關(guān)[6]。Diego血型系統(tǒng)中，抗Dia/Dib/Wra/ELO抗體與HDFN發(fā)病相關(guān)，其中抗Dia/Wra/ELO抗體可導(dǎo)致嚴(yán)重HDFN[6]。JR血型系統(tǒng)中，抗Jra抗體與嚴(yán)重的HDFN有關(guān)[9]。LAN血型系統(tǒng)中，抗LAN抗體多導(dǎo)致輕度HDFN[11]。國(guó)際輸血學(xué)會(huì)(ISBT) 200系列，抗i抗體可引起輕度HDFN，其機(jī)制是母體自身抗i抗體可穿過(guò)胎盤，從而導(dǎo)致新生兒輕度黃疸[10]。ISBT 700系列，抗Bi/Rea/Lia/Kg/JONES/HJK/HOFM/REIT抗體與HDFN發(fā)病相關(guān)[10]。ISBT 901系列，抗MAM抗體與HDFN發(fā)病相關(guān)[10]。考慮到眾多的致病性血型抗體均可導(dǎo)致HDFN，臨床上如何提高抗體檢出率和準(zhǔn)確性，對(duì)于明確HDFN的診斷及后續(xù)的治療至關(guān)重要。

3 妊娠期紅細(xì)胞同種抗體的診斷策略

3.1ABO-HDFN的診斷策略 當(dāng)前常規(guī)的試驗(yàn)診斷策略是依據(jù)孕婦及配偶ABO血型組合及相應(yīng)妊娠期IgG抗A/B的效價(jià)測(cè)定。IgG抗A/B是衡量ABO-HDFN發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)高低的重要因素，但其是否能成為致病性抗體，必須要以真實(shí)存在母嬰血型不合即胎兒及新生兒上表達(dá)對(duì)應(yīng)陽(yáng)性ABO抗原作為發(fā)病基礎(chǔ)。2021年國(guó)內(nèi)專家共識(shí)針對(duì)ABO-HDFN產(chǎn)前監(jiān)測(cè)仍以親代血型表型不合結(jié)合IgG抗A/B的效價(jià)為主要臨床風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的技術(shù)手段[1]。

3.2非ABO-HDFN的診斷策略 國(guó)內(nèi)有研究報(bào)道關(guān)于抗D效價(jià)與HDFN發(fā)病率的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示：IgG抗D效價(jià)<16，發(fā)病率5.40%(低風(fēng)險(xiǎn))；16≤IgG抗D效價(jià)<32，發(fā)病率33.33%(中等風(fēng)險(xiǎn))；32≤IgG抗D效價(jià)<64，發(fā)病率81.81%(高風(fēng)險(xiǎn))；64≤IgG抗D效價(jià)<128，發(fā)病率92.11%(高風(fēng)險(xiǎn))；128≤IgG抗D效價(jià)<256，發(fā)病率95.65%(高風(fēng)險(xiǎn))；IgG抗D效價(jià)≥256，發(fā)病率100.00%(高風(fēng)險(xiǎn))[11]。值得說(shuō)明的是，部分臨床醫(yī)生在妊娠管理時(shí)比對(duì)過(guò)孕婦及配偶雙方血型結(jié)果后會(huì)直接開(kāi)具檢測(cè)某一稀有血型抗體效價(jià)測(cè)定，這其實(shí)是不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，科學(xué)的診斷策略是首先通過(guò)意外抗體篩查和鑒定試驗(yàn)明確診斷出血型抗體類型后后方能對(duì)其進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。因此，血型意外抗體的實(shí)際檢出率成為制約致病性抗體診斷及非ABO-HDFN診斷的重要因素。一方面，當(dāng)前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用8～16人份不等的商品化的抗體鑒定譜細(xì)胞，然而不同廠家的譜細(xì)胞覆蓋血型抗原的種類和純雜合子特征差異非常大，同時(shí)復(fù)雜的抗體鑒定過(guò)程中通常還需要聯(lián)合復(fù)雜的血型血清學(xué)技術(shù)，甚至血型基因分型才能做到精準(zhǔn)的抗體鑒定，因此對(duì)鑒定人員的理論知識(shí)和技術(shù)水平要求非常高。另一方面，許多稀有血型表型診斷的抗體試劑因?yàn)閮r(jià)格昂貴、極難甚至無(wú)法獲得商品化的試劑，因此，很多文獻(xiàn)報(bào)道的非ABO-HDFN的血型診斷都需要對(duì)孕婦、配偶和新生兒進(jìn)行基因分型鑒定，這也導(dǎo)致這些非ABO-HDFN在常規(guī)和基層醫(yī)院的實(shí)驗(yàn)室無(wú)法開(kāi)展，客觀上也弱化了基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)非ABO-HDFN的認(rèn)識(shí)、有效妊娠管理和精確診斷。

4 妊娠期無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)研究進(jìn)展

針對(duì)高危孕婦，早期的產(chǎn)前診斷為有創(chuàng)診斷，即通過(guò)羊膜腔穿刺術(shù)、絨毛膜絨毛穿刺術(shù)和經(jīng)陰道灌洗術(shù)等獲取到胎兒標(biāo)本進(jìn)行血型基因分型。羊膜腔穿刺術(shù)可導(dǎo)致自發(fā)性流產(chǎn)和羊水滲漏[14]。侵入性操作都會(huì)增加FMH的風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致同種免疫發(fā)生并產(chǎn)生抗體[15]。因此，非侵入性檢測(cè)技術(shù)成為目前研究熱點(diǎn)。

4.1胎兒游離DNA(cff-DNA)

4.1.1cff-DNA在預(yù)測(cè)胎兒血型中的運(yùn)用 妊娠期母體血漿中可檢測(cè)到cff-DNA，cff-DNA來(lái)源于滋養(yǎng)細(xì)胞，滋養(yǎng)細(xì)胞通過(guò)胎盤轉(zhuǎn)移，發(fā)生凋亡，釋放DNA進(jìn)入母體[16]。cff-DNA在妊娠早期占母體血漿DNA水平約為3.40%，在孕晚期約占6.20%[17]。目前胎兒基因分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于胎兒ABO、Rh血型篩查、性別連鎖疾病和染色體非整倍體診斷等[18]。我國(guó)已有使用cff-DNA技術(shù)報(bào)道，馬紅麗等[19]報(bào)道利用PCR-RFLP技術(shù)建立從O型孕婦外周血中提取DNA檢測(cè)胎兒血型的實(shí)驗(yàn)方法，39例新生兒出生前后血型檢測(cè)符合率為94.24%，孕中期血型檢測(cè)符合率為91.95%，孕晚期的血型檢測(cè)符合率為98.00%。于洋等[20]使用從孕婦外周血中分離胎兒ABO血型基因DNA，運(yùn)用PCR-SSP技術(shù)進(jìn)行胎兒血型基因型鑒定，預(yù)測(cè)胎兒的ABO血型表型，符合率為100.00%。馬玲等[21]使用用Y染色體相關(guān)基因(SRY)及甲基化表觀遺傳標(biāo)志RASSF1A作為胎兒DNA內(nèi)參基因，運(yùn)用PCR-SSP及實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在O型孕婦外周血漿中檢測(cè)胎兒ABO基因型，其預(yù)測(cè)胎兒血型與胎兒出生后ABO血型表型一致。對(duì)于存在抗D的RhD陰性母親，采用RhD雜合子檢測(cè)和cff-DNA技術(shù)檢測(cè)胎兒RhD基因型，對(duì)高風(fēng)險(xiǎn)的Rh血型不合的HDFN進(jìn)行早期干預(yù)，如注射抗-D免疫球蛋白[22]。

4.1.2運(yùn)用血型基因檢測(cè)技術(shù)應(yīng)注意的問(wèn)題 目前確認(rèn)了43個(gè)血型系統(tǒng)，抗原數(shù)345個(gè)，繼PCR檢測(cè)血型技術(shù)以來(lái)，二代測(cè)序成為新型檢測(cè)手段，具有高通量、自動(dòng)化的顯著特征，但二代測(cè)序存在假陽(yáng)性的問(wèn)題。由于血型抗原基因多態(tài)性，基因檢測(cè)技術(shù)仍面臨特異性引物設(shè)計(jì)困難。如MNS血型系統(tǒng)糖蛋白A、B和E(分別為GPA、GPB和GPE)的基因包含跨越前四個(gè)外顯子9～15的高度同源區(qū)域[23]。外顯子堿基互換、內(nèi)含子堿基互換、單堿基突變、不同血型糖蛋白基因在序列各個(gè)部分之間的交換等都可導(dǎo)致新抗原的出現(xiàn)。同時(shí)，基因重排可能會(huì)影響引物序列，使引物不表達(dá)，導(dǎo)致假陰性。胎兒遺傳的部分D或弱D表型可導(dǎo)致RhD假陰性[17]，RhD陰性男性胎兒的Y染色體基因序列(SRY、DBY和TTTY2)、短串聯(lián)重復(fù)序列和低甲基化啟動(dòng)子序列等內(nèi)參基因可有效地用作胎兒內(nèi)部標(biāo)記[17]。有觀點(diǎn)認(rèn)為，基于RT-PCR的胎兒RhD檢測(cè)分析應(yīng)重復(fù)多次，至少兩個(gè)RhD特異性外顯子引物(最常見(jiàn)的外顯子5、7和/或10)進(jìn)行3次重復(fù)，可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性[17]。另一方面，cff-DNA在母體循環(huán)中數(shù)量低，且標(biāo)本采集、運(yùn)輸、儲(chǔ)存和處理過(guò)程中，母體血細(xì)胞裂解、釋放的DNA不斷增加，使循環(huán)中胎兒DNA被稀釋。血漿DNA酶降解胎兒DNA，使胎兒血漿DNA高度碎片化。另外，標(biāo)本中大量的母體DNA使胎兒DNA分析更加困難。低水平的cff-DNA可導(dǎo)致RhD假陰性[17]，因此，取樣后6 h內(nèi)處理標(biāo)本，可有效提高檢出效率。

4.1.3血型表型與基因型可能存在的差異 HDFN發(fā)病前提是以表型的抗原抗體為基礎(chǔ)。ABO血型與H血型有密切關(guān)系，孟買血型是H基因突變的結(jié)果，因其上位效應(yīng)影響ABO基因產(chǎn)物，造成了ABO血型異常表現(xiàn)[24]。因此，進(jìn)行ABO血型基因分型時(shí)，應(yīng)加做H基因檢測(cè)以提高表型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率。RhAG 蛋白雖然自身不產(chǎn)生抗原，但是它可以輔助RhD及RhCE 蛋白錨定在紅細(xì)胞膜上，形成Rh蛋白復(fù)合體，并且參與RhD抗原的缺失和表達(dá)[25]。因此，在進(jìn)行RhD/RhCE基因檢測(cè)時(shí)，也要進(jìn)行RhAG基因檢測(cè)。

4.2大腦中動(dòng)脈收縮期峰值流速(MCA-PSV) 其他非侵入性診斷技術(shù)如胎兒MCA-PSV，通過(guò)MCA-PSV測(cè)量更準(zhǔn)確評(píng)估胎兒貧血。2021年專家共識(shí)提出[1]：IgG抗體效價(jià)明顯升高時(shí)，采用多普勒超聲技術(shù)進(jìn)行胎兒MCA-PSV測(cè)定，根據(jù)胎兒貧血的病理生理改變，包括胎兒形態(tài)學(xué)及血流動(dòng)力學(xué)變化有效監(jiān)測(cè)胎兒貧血程度，當(dāng)MCA-PSV>1.5 MoM(中位數(shù))時(shí)，即需要進(jìn)行臨床干預(yù)。

5 小 結(jié)

綜上所述，HDFN是一種多層面疾病，不能簡(jiǎn)單依賴抗體為主的當(dāng)前診斷策略，一方面需要提高致病性抗體鑒定的技術(shù)條件和水平，另一方面還是需要擴(kuò)大孕婦及配偶的血型鑒定，尤其是當(dāng)稀有血型表型診斷存在困難時(shí)，可以充分利用血型基因分型技術(shù)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，對(duì)于存在高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦則可以利用母體血漿cff-DNA實(shí)現(xiàn)早期診斷母嬰血型不合是否存在及類型，同時(shí)動(dòng)態(tài)評(píng)估致病性抗體的效價(jià)及危害程度，才能在真實(shí)意義上實(shí)現(xiàn)血型不合HDFN的早期診斷和精準(zhǔn)的妊娠管理。