丁葵英 許文娟 呂佳寧 郭禮強(qiáng) 田國寧

1.濰坊海關(guān) 山東濰坊 261041 2.濰坊醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院 山東濰坊 261043

為保證農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，但過量農(nóng)藥殘留，會給生物環(huán)境和人體健康帶來危害[1,2]，因此國內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)都對食品中農(nóng)藥殘留量有嚴(yán)格的要求[3,4]。食品中多農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測技術(shù)文獻(xiàn)已有許多報(bào)道[5～7]，但對檢測結(jié)果不確定度的分析評定影響報(bào)道較少。檢測結(jié)果處于最大殘留限量臨界點(diǎn)附近時(shí)，判定較為困難，易引起爭議，因此需要對測定過程中的不確定度進(jìn)行分析和評定[8～10]；不確定度是與測量結(jié)果相關(guān)的表征被測量值的分散性參數(shù)[11]，對測量結(jié)果的可疑程度和非負(fù)參數(shù)的分散性提供重要保障[12,13]。雞肉基質(zhì)較復(fù)雜，對于測定其中的農(nóng)藥殘留含量干擾嚴(yán)重，測定過程中的環(huán)境、儀器和操作步驟等都可能對測定結(jié)果造成誤差[14,15]，所以評定其農(nóng)藥殘留測定過程中的不確定度是非常有必要。

本文對液相色譜-質(zhì)譜法，測定雞肉中亞胺硫磷等26種農(nóng)藥殘留量檢測過程中不確定度的來源和影響，根據(jù)CNAS-CL01-G003：2021《測量不確定度的要求》等[16]相關(guān)指導(dǎo)性文件要求進(jìn)行分析和評定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀安捷倫647，配有電噴霧離子源(ESI)，美國Agilent公司；

碾磨儀GM 200，德國RETSCH公司；

高速分散均質(zhì)器IKA-T25，德國IKA公司；

電子天平XS303S，瑞士Mettler公司；

移液槍，100μL、1 000μL和10mL，皆為德國eppdf公司；

10mL棕色容量瓶。

本文用到的器具按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》(JJG 196-2006)[17]、《移液器檢定規(guī)程》(JJG 646-2006)[18]將各器具引入的相對不確定度列表1。

表1 各器具最大允差和相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度Table 1 the maximum allowance and relative standard ofthe instruments

1.2 藥品與試劑

甲醇、乙腈(色譜純)，美國Fisher公司；

正己烷(色譜純)，德國Merk；

無水硫酸鎂(分析純)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，使用前在500℃馬弗爐內(nèi)烘5h，20℃時(shí)取出冷卻備用；

C18粉、PSA粉，Agela technologies inc公司；

滅蠅胺、乙酰甲胺磷、涕滅威亞砜、涕滅威砜、久效磷、內(nèi)吸磷-S-砜、涕滅威、乙拌磷亞砜、乙拌磷砜、氯吡脲、氯蟲苯甲酰胺、亞胺硫磷、嘧菌酯、乙拌磷、氟甲腈、除蟲脲、氟蟲腈、氟蟲腈硫醚、吡唑醚菌酯、苯醚甲環(huán)唑、丙溴磷、氟啶脲、溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品，(乙腈中1 000μg/mL)，北京壇默有限公司；

內(nèi)吸磷-S-亞砜、氟蟲腈砜和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(乙腈中1 000μg/mL)，阿爾塔科技有限公司；

雞肉樣品來自于報(bào)檢公司的出口樣品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1.1 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制

用100μL移液槍分別準(zhǔn)確移取100μL的1 000μg/mL的滅蠅胺、亞胺硫磷等26種農(nóng)藥液體標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL的容量瓶中，用乙腈稀釋定容，配制成10μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18℃下存放。

1.3.1.2 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)液的配制

用100μL移液槍移取10μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50μL于10mL的棕色容量瓶中，用空白雞肉基質(zhì)提取溶液定容，得0.5μg/mL標(biāo)準(zhǔn)中間液。精密移取標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用空白樣品基質(zhì)溶液配制成系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 樣品提取和測定

稱取10g試樣(精確至0.01g)于50mL離心管中，加入10mL乙腈，用高速組織搗碎機(jī)在15 000r/min，勻漿提取1min，加入4g無水硫酸鎂、1g氯化鈉，再勻漿提取1min，在5 000r/min離心5min，定量吸取上清液2mL至內(nèi)含無水硫酸鎂300mg，50mgPSA、5mg C18組合粉末的塑料離心管中，渦旋混勻1min，5 000r/min離心5min，吸取上清液過0.22μm微孔濾膜后進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，外標(biāo)法定量。

1.4 LC-MS/MS條件

LC條件：色譜柱SB-C18(3.0×100mm，2.7μm)，柱溫40℃，進(jìn)樣量1μL，流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為甲醇。

MS條件：離子源ESI，掃描方式為正負(fù)離子同時(shí)掃描，檢測方式為動態(tài)多反應(yīng)檢測(dMRM)。

1.5 不確定來源分析

1.5.1 數(shù)學(xué)模型

根據(jù)測定方法，雞肉中各農(nóng)藥含量按公式(1)計(jì)算。

(1)

式中：

x—樣品中待測組分殘留量，單位為(μg/kg)；

c—從基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中被測物的質(zhì)量濃度的數(shù)值，單位為(μg/mL)；

A—樣品中待測組分的峰面積；

V—樣品提取液的體積，單位為(mL)；

As—標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中待測組分的峰面積；

m—樣品稱樣量，單位為(g)。

1.5.2 不確定度來源

按規(guī)范方法抽樣和制備樣品均勻性引入的不確定度忽略不計(jì)[19]。從測量過程和數(shù)學(xué)模型分析，本方法測定雞肉中26種農(nóng)藥的不確定度來源見表2。

表2 測定雞肉中各目標(biāo)化合物含量的相對不確定度一覽表Table 2 Relative uncertainty of determination of target compounds in Ginger

2 測量不確定度評定

2.1 重復(fù)性不確定度urel(rep)

制備雞肉空白樣品，添加一定體積的10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使各化合物的添加濃度為20.0μg/kg，按照1.3的方法進(jìn)行前處理和1.4的上機(jī)方法測定，重復(fù)測量8次，外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制采用0.5μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液，吸取不同體積上述標(biāo)準(zhǔn)中間液后，用空白雞肉基質(zhì)提取液定溶，配制成濃度為0.005、0.007、0.010、0.020、0.030、0.040μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，測得的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程y=ax+b(a為截距，b為斜率)和方程的線性相關(guān)系數(shù)R2，然后采用外標(biāo)法定量測定，各化合物的回收濃度值如表3所示。

表3 重復(fù)測定8次的數(shù)據(jù)及線性相關(guān)參數(shù)Table 3 Data and linear correlation parameters of 8 repeated measurements

通過標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算測量重復(fù)性引入的不確定度分量。通過公式(2)計(jì)算8次測量結(jié)果的各化合物的平均值。

(2)

采用貝塞爾公式(3)計(jì)算測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差sc。

(3)

按照相對不確定度公式(4)計(jì)算各化合物的不確定度。

(4)

2.2 前處理過程引入的不確定度urel(q)

26種化合物是同時(shí)加入空白樣品，前處理過程是同時(shí)進(jìn)行，所以各化合的前處理過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度是相同的，其評定過程如下。

2.2.1 稱樣引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(m)

由電子天平(XS303S)的校準(zhǔn)證書得到，0～50g稱量范圍內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)所用天平的最大誤差為±0.01g，服從矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(5)為：

(5)

待測樣品平行稱樣量為8次，其稱樣量為10.01、10.02、10.05、9.99、9.98、10.02、10.03、10.00g：

計(jì)算相對不確定度公式(6)為：

(6)

稱量所帶入的相對不確定度為：1.64×10-3。

2.2.2 加入提取體積引入的不確定度urel(V)

量取體積的不確定度有量取容器決定的，用10mL的移液槍加入提取試劑乙腈移取，10mL的移液槍最大允差為±60μL見表1，按照矩形分布，其相對不確定度公式(7)為：

(7)

2.2.3 前處理過程溫度引入的不確定度urel(temp1)

前處理過程操作均是一般在(20±5)℃下進(jìn)行的，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃，按照矩形分布，其相對不確定度公式(8)為：

(8)

前處理過程引入的相對不確定度urel(q)公式(9)為：

urel(q)=

3.91×10-3

(9)

2.3 目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度c引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)

標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的濃度c的標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c)公式(10)，主要來源于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程。

(10)

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c1)

通過查閱26種化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書知，其標(biāo)準(zhǔn)濃度為值1 000μg/mL，內(nèi)吸磷-S-亞砜、氟蟲腈砜和甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽擴(kuò)展不確定度為5%(k=2)，其他物質(zhì)擴(kuò)展不確定度為：2%(k=2)，各物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(11)與公式(12)為：

(11)

(12)

2.3.2 校準(zhǔn)曲線引入相對不確定度urel(c2)

測試過程中各化合物的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程y=ax+b(a為截距，b為斜率)和方程的線性相關(guān)系數(shù)R2，見表2。對試樣進(jìn)行8次平行測定，由試樣峰面積在標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程求得的平均濃度為如表2所示，則由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線所引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(13)為：

(13)

式中，SR-標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積殘差的標(biāo)準(zhǔn)差公式(14):

(14)

c0—大姜樣品中各化合物濃度的平均值;

ci—繪制曲線標(biāo)準(zhǔn)溶液的各濃度點(diǎn);

Ii—各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度點(diǎn)的峰面積;

n—標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定次數(shù)為6；

p—試樣的測定次數(shù)為8。

最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(15)為：

(15)

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(c3)

購入的乙拌磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為1 000μg/mL液體標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制過程無需稱量，僅使用移液槍和容量瓶，具體見配制過程。

(1)用100μL移液槍吸取1 000μg/mL的26種化合物標(biāo)準(zhǔn)品100μL于10mL的容量瓶中，乙腈定容，配制成10μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，按照矩形分布此過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(16)為：

1.16×10-2

(16)

(2)用1 000μL移液槍吸取10μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液500μL于10mL的容量瓶中采用空白雞肉基質(zhì)提取液定容至刻度，配制成0.5μg/mL的26種混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，此過程的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(17)為：

1.16×10-2

(17)

(3)溫度效應(yīng)?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液操作均一般是在(20±5)℃下進(jìn)行的，乙腈的體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3℃；乙拌磷標(biāo)準(zhǔn)使用液在(20±5)℃條件下進(jìn)行配制，定容基質(zhì)溶液按一級水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4℃，按照矩形分布相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(18)為：

urel(Vtemp2)=

2.00×10-3

(18)

綜上，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程的相對不確定度公式(19)為：

urel(c3)=

1.65×10-2

(19)

urel(c)—標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的質(zhì)量濃度c的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(20)為：

(20)

2.4 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因?yàn)闇y量的重復(fù)性、前處理過程、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度各輸入量均為乘積關(guān)系且之間不相關(guān)，根據(jù)JJF1059.1-2012[20]，實(shí)驗(yàn)實(shí)際測得雞肉樣品中的8次重復(fù)測定其含量濃度的平均值，計(jì)算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式(21)為：

(21)

2.5 擴(kuò)展不確定度UP

取置信水平P=95%，包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度公式(22)為：

Up=k×u(x)

(22)

2.6 結(jié)果報(bào)告

26種化合物的測試結(jié)果報(bào)告公式(23)為：

(23)

各化合物的結(jié)果報(bào)告如表4所示。

表4 各不確定度分量和結(jié)果報(bào)告

3 結(jié)論

本研究對雞肉中26種農(nóng)藥殘留檢測的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的測定過程中，各步驟帶來的不確定度進(jìn)行評定，為動物源性中農(nóng)藥殘留測定不確定度評定提供依據(jù)。結(jié)果表明，對最終測量不確定度貢獻(xiàn)最大的是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度，其次為校準(zhǔn)曲線擬合、測量重復(fù)性、前處理過程的稱樣和提取試劑加入容器，但前處理過程和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配制過程中溫度帶入的不確定度可以忽略。因此，實(shí)際檢測中，為提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，要采用經(jīng)過檢定的容器和購買有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，配制6個點(diǎn)以上的校準(zhǔn)曲線；可通過提高儀器和環(huán)境穩(wěn)定性、提高實(shí)驗(yàn)人員操作技能，減少系統(tǒng)誤差，以降低測定過程重復(fù)性引入的不確定度?？傊?，通過全面評定測量不確定度，可使檢測數(shù)據(jù)更加科學(xué)、合理，使報(bào)告結(jié)果更加可信。