丁增南 安 靜

河南省許昌市中心醫(yī)院兒童重癥監(jiān)護室 461000

顱內(nèi)感染為兒科常見病，常由兒童囟門未完全解剖愈合、免疫抵抗力較差等原因?qū)е耓1]。根據(jù)病原體不同，可以將顱內(nèi)感染分為化膿性腦膜炎、病毒性腦膜炎、寄生蟲腦病、新型隱球菌腦膜炎等[2]，其中以化膿性腦膜炎和病毒性腦膜炎最為常見。腦膜炎具有較高的致死率和致殘率，對兒童的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅[3]。在腦膜炎發(fā)病早期針對不同病原體選擇對應(yīng)的治療方案，可降低患兒死亡率及后遺癥的發(fā)生風(fēng)險[4]。因此，對顱內(nèi)感染患兒而言，早期診斷對患兒的治療具有重要意義。由于抗生素的治療等原因，導(dǎo)致腦脊液的培養(yǎng)及涂片陽性率較低，且腦脊液常規(guī)、腦脊液生化檢查診斷率不高[5]。因此，在患兒血清中找出檢驗效能強的檢測指標(biāo)，用于顱內(nèi)感染的鑒別診斷，對指導(dǎo)臨床治療具有積極意義。

有研究報道化膿性腦膜炎患兒的血清基質(zhì)金屬蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、β2微球蛋白(β2microglobulin，β2MG)水平常有異常改變，而病毒性腦膜炎患兒的血清巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)通常存在異常[6]。因此，本研究試圖通過分析不同顱內(nèi)感染的患兒血清MMP-2、β2MG、MIF水平變化，探討血清MMP-2、β2MG及MIF在腦膜炎診斷及鑒別診斷中的作用，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年5月—2019年1月我院兒童重癥監(jiān)護室收治的80例腦膜炎患兒，將診斷為化膿性腦膜炎和病毒性腦膜炎的患兒分為細(xì)菌性組和病毒性組，各40例。本研究方案經(jīng)過院內(nèi)倫理委員會審核批準(zhǔn)，且患兒家屬簽署知情同意書。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合化膿性腦膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，即(1)臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、驚厥、嘔吐、意識障礙等癥狀以及顱壓高的體征如：前囟飽滿、張力高、頭圍增大；(2)腦膜刺激征：頸項強直、Kerning征和Brudzinski征陽性；(3)腦脊液檢查：白細(xì)胞(WBC)計數(shù)≥100×106/L，蛋白含量>1 000mg/L，糖含量<2.5mmol/L；(4)抗生素治療有效；(5)腦脊液培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)致病菌。滿足(1)(2)(3)(4)或單獨滿足(5)可確診化膿性腦膜炎[7]。符合病毒性腦膜炎確診標(biāo)準(zhǔn)：(1)癥狀：發(fā)熱、驚厥、頭痛、眩暈、抽搐；(2)腦脊液檢查：WBC計數(shù)正常，單核細(xì)胞為主，蛋白及糖含量正常；(3)腦電圖異常；(4)病毒性腦膜炎特異性抗體陽性(如IgM和IgG)，或者病毒分離找到病原體；(5)排除其他顱內(nèi)感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)其他顱內(nèi)感染類型如真菌、結(jié)核桿菌、支原體及寄生蟲等；(2)其他小兒神經(jīng)常見病如熱性驚厥；(3)有腦部外傷史或其他疾病史如腦腫瘤等；(4)免疫缺陷患者等。其中，細(xì)菌性組患兒男24例，女16例，年齡2.5～5.5歲，平均年齡(4.33±1.29)歲；病毒性組患兒男27例，女13例，年齡3～6歲，平均年齡(4.58±1.24)歲。兩組患者性別、年齡等一般情況無顯著差異(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 差異性基因表達(dá)。GSE80496陣列的基因表達(dá)譜和相關(guān)臨床數(shù)據(jù)可從Gene Expression Omnibus(GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載。從細(xì)菌腦膜炎的患兒(n=21) 和病毒腦膜炎患兒(n=24) 中篩選候選因子，使用 Illumina HumanRef-8 v3.0微陣列測量基因表達(dá)，篩選差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)：| logFC |>1和adj.P<0.000 1。

1.2.2 血清學(xué)檢查。收集患兒血液樣本后，3 000r/min離心5min，離心半徑20cm，分離出血清進行檢測，檢測方法：(1)血清MMP-2檢測：儀器使用MMP-2免疫熒光定量檢測儀(濟南久天生物工程公司)，醫(yī)用離心機和旋渦混合器。檢測步驟：①MMP-2定量檢測儀器儀器定標(biāo)、質(zhì)控；②取出MMP-2試劑復(fù)溫，將離心分離好的上層血清(約0.3ml)滴入MMP-2試劑條；③MMP-2試劑條和固相管放入分析儀試劑條槽和SPR管倉，關(guān)閉倉門開始檢測，由儀器自動完成。(2)血清β2MG檢測：采用全程β2微球蛋白檢測儀檢測血清β2MG水平，按試劑盒(基蛋生物科技股份有限公司)說明書操作。(3)血清MIF檢測：以酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測，按試劑盒(蘇州艾萊薩生物科技有限公司)說明書進行操作。

1.3 評價指標(biāo) 由不參與此次臨床研究的護士對患兒血清MMP-2、β2MG、MIF指標(biāo)進行采集。(1)評價MMP-2、β2MG、MIF異常指標(biāo)，當(dāng)指標(biāo)不在以下范圍內(nèi)為異常：MMP-2：0～0.5μg/L，β2MG：0～10mg/L，MIF：15.7～17.01μg/L；(2)分別采集患兒急性期(入院時)和恢復(fù)期(治療3周后)的血液樣本檢測血清MMP-2、β2MG、MIF水平；(3)診斷效能采用受試者工作特征(ROC)曲線分析[8]，ROC曲線用于選擇最佳診斷界限值，曲線越靠近左上角，準(zhǔn)確性越高。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)譜篩選候選因子 從GSE80496數(shù)據(jù)集中，進行細(xì)菌性腦膜炎和病毒性腦膜炎患兒的差異性基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性腦膜炎中MMP-2、β2MG上調(diào)，而病毒性腦膜炎MIF上調(diào)，見圖1。

圖1 基因表達(dá)譜篩選候選因子

2.2 兩組患兒血清MMP-2、β2MG、MIF異常率情況比較 細(xì)菌性組患兒MMP-2、β2MG水平異常率顯著高于病毒性組，而細(xì)菌性組患兒MIF水平異常率顯著低于病毒性組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 兩組患兒血清MMP-2、β2MG、MIF異常率情況[n(%)]

2.3 不同時期腦膜炎患兒血清MMP-2、β2MG、MIF水平 組內(nèi)比較，各組腦膜炎患兒血清MMP-2、β2MG、MIF水平在恢復(fù)期較急性期均顯著改善(P<0.05)；組間比較，細(xì)菌性組患兒急性期和恢復(fù)期的血清MMP-2、β2MG水平均顯著高于病毒性組，而細(xì)菌性組患兒不同時期血清MIF水平均顯著低于病毒性組(P<0.05)，見表2。

表2 不同時期腦膜炎患兒血清MMP-2、β2MG、MIF水平

2.4 各檢測指標(biāo)鑒別細(xì)菌性腦炎和病毒性腦炎診斷性能 細(xì)菌性組患兒的血清MMP-2、β2MG水平和病毒性組患兒的血清MIF水平分別具有良好的診斷性能(AUC值>0.7)，見表3和圖2。

表3 各檢測指標(biāo)鑒別細(xì)菌性腦炎和病毒性腦炎診斷性能

圖2 各檢測指標(biāo)ROC曲線

3 討論

根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，化膿性腦膜炎的全球發(fā)病率約為1.2/10萬，但是其病死率在發(fā)展中國家較高，為4%～27%[9]，因此兒童腦膜炎疾病的診療成為重大臨床課題。相比病毒性腦膜炎，化膿性腦膜炎危險性更強、致死率和致殘率更高。若對化膿性腦膜炎進行早期診斷，并給予及時治療，患兒預(yù)后多良好，后遺癥發(fā)生率較低，而病毒性腦膜炎患兒?？勺杂鶾10]。因而，根據(jù)治療指南，顱內(nèi)感染患兒在未排除化膿性腦膜炎時，均應(yīng)早期給予抗生素經(jīng)驗治療，直至徹底排除化膿性腦膜炎[11]。但同時對非化膿性腦膜炎患兒使用抗生素也可能會產(chǎn)生不必要的不良反應(yīng)。因此顱內(nèi)感染患兒的早期診斷和鑒別診斷對臨床治療和疾病預(yù)后具有重要意義。

MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族(MMPs)成員之一[12]。此前有研究表明，MMPs與中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染密切相關(guān)，可能由MMPs降解血管基底膜的Ⅳ型膠原，破壞血腦屏障，使T細(xì)胞順利通過血腦屏障到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，積極參與炎癥引發(fā)[13]。MMP-2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染中起重要作用，參與血腦屏障損傷和免疫學(xué)發(fā)病機制。而病毒感染后，一般不會出現(xiàn)血清MMP-2水平改變的情況。本研究中細(xì)菌性組患兒血清MMP-2水平異常率顯著升高，且血清MMP-2水平也高于病毒性組患兒。ROC曲線分析結(jié)果顯示，細(xì)菌性組血清MMP-2的AUC值為0.874。提示MMP-2在患兒血清中高表達(dá)，T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞被誘導(dǎo)分泌MMP-2，也許能作為患兒化膿性腦膜炎發(fā)病中的標(biāo)志物。

對感染性疾病患兒，血清β2MG是常規(guī)檢測指標(biāo)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一旦神經(jīng)系統(tǒng)的免疫系統(tǒng)被激活，鞘內(nèi)β2MG合成增多，腦脊液細(xì)胞增多，代謝周期加快，從而大量β2MG從細(xì)胞表面脫落進入腦脊液，外周血液中的β2MG也會隨之增加[14]。而病毒性感染由于缺乏強烈的免疫系統(tǒng)激活，不能誘導(dǎo)β2MG分泌，因而血清β2MG水平呈現(xiàn)正?；蜉p度升高。血清β2MG檢測可作為鑒別細(xì)菌感染和病毒感染的重要依據(jù)。本研究結(jié)果顯示，細(xì)菌性組患兒血清β2MG水平異常率顯著升高，且血清β2MG水平也高于病毒性組患兒，ROC曲線分析結(jié)果顯示細(xì)菌性組血清β2MG的AUC值為0.739，提示在早期診斷化膿性腦膜炎中血清β2MG的診斷效能較強。但血清β2MG的AUC值低于血清MMP-2的AUC值，提示血清β2MG的診斷效能略低于血清MMP-2。

巨噬細(xì)胞移動抑制因子(MIF)是一種天然的細(xì)胞因子，在宿主免疫反應(yīng)中具有多種激活功能。高表達(dá)的MIF基因型與腦膜炎之間的潛在關(guān)聯(lián)支持侵襲性肺炎鏈球菌疾病的炎癥發(fā)病機制。MIF可能增加腦膜炎風(fēng)險的一種方式是通過促進腦血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，在不同的炎癥性疾病動物模型中，MIF上調(diào)細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)的表達(dá)，并且MIF被證明可以破壞血腦屏障，導(dǎo)致神經(jīng)侵襲性黃病毒感染[15]。本研究結(jié)果顯示，病毒性組患兒的MIF異常率顯著升高，急性期和恢復(fù)期的MIF水平顯著高于細(xì)菌性組患兒，提示病毒感染會對患兒造成較嚴(yán)重的腦損傷，可能是病毒對神經(jīng)細(xì)胞造成直接侵犯，導(dǎo)致MIF大量釋放。而病毒性組血清MIF的AUC值為0.879，具有良好的診斷效能?；撔阅X膜炎病變在于腦膜，神經(jīng)損傷較低，因而MIF變化程度較低。

本研究結(jié)果顯示，化膿性腦膜炎患兒的血清MMP-2、β2MG水平顯著異常，無論是急性期還是恢復(fù)期都顯著高于病毒性腦膜炎患兒，而血清MIF水平趨勢則相反。最后，AUC值顯示血清MMP-2、β2MG水平的化膿性腦膜炎診斷效能較好，而血清MIF水平對病毒性腦膜炎的診斷效能較好。本研究的局限性在于，沒有進一步探討部分治療過度或者不典型化腦患兒的MMP-2、β2MG水平，這部分患兒極容易產(chǎn)生嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)的并發(fā)癥，因而在未來的研究中將繼續(xù)設(shè)計實驗，驗證上述患兒的相關(guān)指標(biāo)，以期更好地促進臨床診治的發(fā)展。

綜上所述，腦膜炎患兒的血清MMP-2、β2MG及MIF水平可以有效應(yīng)用于臨床診斷，進行化膿性腦膜炎和病毒性腦膜炎的鑒別診斷，有助于指導(dǎo)腦膜炎患兒的臨床診療工作。