徐梓馨 廖紅雨 李慧一 徐銘益

肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖及凋亡等情況的變化對非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)進(jìn)展至關(guān)重要[1-4]。miRNA是一種在不同物種中高度保守的非編碼小RNA[5]。miRNA-122、miRNA-223、miRNA-34、miRNA-29、miRNA-194等在肝臟疾病中，發(fā)揮重要作用[6-9]。文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA-219(miR-219)在四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型中可抑制肝星狀細(xì)胞膠原沉積，進(jìn)而抑制肝纖維化的進(jìn)展；在肝癌小鼠模型中，miR-219可調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移，發(fā)揮保護(hù)作用[10，11]。本研究通過構(gòu)建脂肪肝小鼠和脂肪肝細(xì)胞模型，了解miR-219在脂毒性環(huán)境下對肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝、細(xì)胞活性與凋亡的影響。

材料與方法

一、材料與試劑

實(shí)驗(yàn)小鼠購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，小鼠低脂飼料及高脂飼料均購于南通特洛菲實(shí)驗(yàn)飼料有限公司，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司，1%青霉素/鏈霉素雙抗溶液、棕櫚酸(palmitic acid，PA)、Lipo3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，EDU試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒，HE染色、油紅染色試劑盒均購于上海翊圣生物科技有限公司。

二、方法

(一)動物模型構(gòu)建 共有10只8周齡雄性SPF級C57BL/6J小鼠用于脂肪肝小鼠模型的構(gòu)建。小鼠體質(zhì)量為25～30 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心提供，飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心。10只小鼠隨機(jī)分為低脂組(low fatty diet，LFD)與高脂組(high fatty diet，HFD)，每組5只，LFD組小鼠喂養(yǎng)普通飼料(即低脂飼料)，HFD組小鼠喂養(yǎng)高脂飼料。喂養(yǎng)16周后處死小鼠，取部分肝組織經(jīng)脫水、石蠟包埋或OCT凝膠包埋用于病理學(xué)檢測。取適當(dāng)組織進(jìn)行q-PCR檢測，余組織凍存于液氮中。

(二)肝組織病理檢查 建模小鼠處死后，取適當(dāng)大小的新鮮組織塊置于4%甲醛溶液中固定48 h，脫水處理、石蠟包埋。蠟塊以4 μm 切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其病理改變。新鮮肝組織經(jīng)過4%甲醛中固定48 h，依次經(jīng)過20%、10%蔗糖溶液梯度各24 h脫水后，用OCT溶膠包埋。以10 μm厚度進(jìn)行冰凍組織切片，用于油紅染色，光學(xué)顯微鏡下檢測其病理程度并拍照。

(三)原代肝細(xì)胞(primary hepatocytes，PHC)提取、培養(yǎng)及處理 使用兩步膠原酶消化法分離8周齡雄性C57BL/6J 野生型小鼠的PHC[12]。分離得到的PHC用含10% FBS、50 mg/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞分為陰性對照組(mi-NC)和miR-219過表達(dá)組(mi-miR-219)，按照說明，用miR-219模擬物(miR-219 mimic)或陰性對照(mi-NC)轉(zhuǎn)染PHC，轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/mL，轉(zhuǎn)染完成24 h后，再以200 μmol PA處理PHC細(xì)胞24 h。

(四)原代肝細(xì)胞油紅染色 在PHCs細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成培養(yǎng)24 h后更換含有200 μmol PA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照試劑盒說明進(jìn)行細(xì)胞油紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞脂質(zhì)沉積情況。

(五)生化檢測 全自動生化分析儀檢測對照組和PA處理組細(xì)胞上清液中AST、ALT水平。操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

(六)EDU檢測 原代肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染完成且PA處理之后，按照EDU試劑盒說明書進(jìn)行EDU孵育、細(xì)胞固定化以及ApolloR染色，在熒光顯微鏡下觀察。

(七)QRT-PCR法檢測miRNA、mRNA相對表達(dá)量 采用TRIzol法提取總RNA并純化，進(jìn)一步測定RNA樣品的濃度和純度，判斷樣品純度是否符合實(shí)驗(yàn)要求。按照試劑說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后行RT-PCR。本研究主要檢測PA處理的肝細(xì)胞內(nèi)miR-219的表達(dá)，以及脂質(zhì)代謝相關(guān)因子硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1，SCD1)和脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FAS)[13]，細(xì)胞增殖關(guān)鍵分子增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen ，PCNA)和細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)[14,15]，以及凋亡相關(guān)分子半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)和B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)的mRNA表達(dá)。對應(yīng)的引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)過程中以U6、β-actin分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)參對照，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換得到各樣本的拷貝數(shù)(Ct值)，樣品目的基因的相對表達(dá)率(relative expression，RQ)=2-△△CT。每個(gè)樣品的內(nèi)參基因和靶基因各設(shè)3個(gè)重復(fù)試驗(yàn)。

結(jié) 果

一、非酒精性脂肪性肝小鼠模型的建立

為了構(gòu)建非酒精性脂肪性肝病小鼠模型，將小鼠隨機(jī)分為HFD組和LFD組，分別喂養(yǎng)高脂飼料和普通飼料。HE染色顯示LFD組小鼠肝組織小葉結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈細(xì)胞排列有序，未見明顯脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤(圖1A)，HFD組可見明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，出現(xiàn)明顯的脂肪泡及氣球樣變，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤(圖1B)。油紅染色顯示，LFD組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核居中，僅存在少量脂質(zhì)沉積(圖1C)，HFD組小鼠肝組織可見大量明顯的脂質(zhì)沉積于匯管區(qū)周圍(圖1D)。HE染色和油紅染色結(jié)果表明非酒精性脂肪性肝病小鼠模型構(gòu)建成功。

表1 qRT-PCR相關(guān)引物序列

A、B:HE染色；C、D:油紅染色(×100)

二、非酒精性脂肪性PHC細(xì)胞模型建立

油紅染色顯示，對照組PHC中紅色脂滴較少，經(jīng)過PA處理的PHC內(nèi)紅色脂肪顆粒明顯增加(圖2)。PA處理組PHC細(xì)胞上清液AST、ALT水平分別為12.743 U/L和7.410 U/L，高于對照組7.427 U/L和3.577 U/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.650、7.828，P=0.001、0.0014)。這些結(jié)果表明非酒精性脂肪肝細(xì)胞造模成功。

A:對照組; B: PA處理組

三、脂肪肝小鼠肝組織和脂毒性PHC中miR-219表達(dá)

在非酒精性脂肪性肝病小鼠模型中，HFD組小鼠肝組織miR-219表達(dá)水平為0.455±0.028，LFD組為1.000±0.125(P<0.05)。從野生型小鼠分離提取PHC，PA處理以模擬高脂環(huán)境，發(fā)現(xiàn)PA處理組PHC中miR-219的表達(dá)水平為0.676±0.064，對照組為1.000±0.190(P<0.05); miR-219的表達(dá)在高脂小鼠和PA刺激的PHC中均明顯下降，說明在非酒精性脂肪性肝病時(shí)，肝細(xì)胞中miR-219的表達(dá)受到明顯抑制，肝細(xì)胞功能也可能會受到影響。

四、在高脂環(huán)境下，過表達(dá)miR-219緩解PHC內(nèi)脂質(zhì)沉積

為進(jìn)一步探究miR-219對脂毒性環(huán)境下肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝的影響，在PA處理的PHC中過表達(dá)miR-219。結(jié)果顯示miR-219在PHC內(nèi)升高1000倍，過表達(dá)miR-219的PHC細(xì)胞模型成功構(gòu)建。油紅染色發(fā)現(xiàn)mi-miR219組PHC內(nèi)紅色脂肪顆粒明顯變少(圖3)。進(jìn)一步檢測脂質(zhì)代謝相關(guān)因子SCD1和FAS的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)mi-R219的PHC細(xì)胞內(nèi)，SCD1(mi-miR219+PA：0.539±0.048，miR-NC+PA：1.000±0.033，P<0.01)和FAS(mi-miR219+PA：0.722±0.036，miR-NC+PA：1.000±0.051，P<0.05)的mRNA表達(dá)均明顯下降。這些結(jié)果表明在高脂環(huán)境下，miR-219可緩解肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂。

A: miR-NC+PA；B: mi-miR219+PA

五、在高脂環(huán)境下，過表達(dá)miR-219促進(jìn)PHC細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡

為進(jìn)一步探索過表達(dá)miR-219對高脂環(huán)境下肝細(xì)胞的增殖及細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步檢測了增殖相關(guān)因子(PCNA、CyclinD1)的表達(dá)。與miR-NC+PA組相比，mi-miR219+PA組的PHC中PCNA(mi-miR219+PA:1.652±0.185，miR-NC+PA:1.000±0.203，P<0.05)和CyclinD1(mi-miR219+PA:1.791±0.154, miR-NC+PA:1.000±0.135，P<0.05)的mRNA表達(dá)均出現(xiàn)明顯上升。EDU檢測提示過表達(dá)miR-219后，細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)(圖4)，說明在高脂環(huán)境下，miR-219可提高PHC的活性，促進(jìn)PHC增殖。

A: miR-NC+PA；B: mi-miR219+PA

此外，與對照組相比，過表達(dá)miR-219后，PHC細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)明顯下降(mi-miR219+PA:0.574±0.054，miR-NC+PA:1.000±0.35，P<0.05)，Bcl-2基因表達(dá)明顯上升(mi-miR291:1.535±0.109，miR-NC:1.000±0.208,P<0.05)；說明在高脂環(huán)境下，過表達(dá)miR-219可明顯促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，抑制肝細(xì)胞凋亡，提示mi-R219可能緩解脂毒性環(huán)境下肝細(xì)胞受到的損傷。

討 論

Zhang等[16]發(fā)現(xiàn)在脂肪肝小鼠模型中，miR-103可通過靶向FAS和SCD1抑制肝臟新生脂肪生成，進(jìn)而緩解NAFLD。miR-219可以通過抑制膠原沉積、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡等作用，在肝纖維化、肝癌中發(fā)揮作用[9-10]。

在本研究中，HE和油紅染色證實(shí)成功構(gòu)建了NAFLD小鼠模型。在HFD組小鼠肝組織中，發(fā)現(xiàn)miR-219表達(dá)水平明顯下降。一些脂質(zhì)(如PA)具有脂毒性，可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂、活性受損、細(xì)胞凋亡增多乃至死亡[17.18]。從野生型小鼠分離提取原代肝細(xì)胞，用PA處理以模擬脂毒性環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在PA處理的PHC中miR-219的表達(dá)水平也出現(xiàn)明顯下降，這說明miR-219在高脂環(huán)境下表達(dá)受到顯著抑制。

在PHC中過表達(dá)miR-219后，進(jìn)一步檢測肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝、細(xì)胞增殖及凋亡等情況。SCD1和FAS能夠促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)的合成，促進(jìn)脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)沉積，是反映脂質(zhì)代謝水平的關(guān)鍵因子。相比對照組，過表達(dá)miR-219組PHC脂質(zhì)代謝因子SCD1、FAS的表達(dá)水平出現(xiàn)下降，脂質(zhì)沉積也明顯減輕。提示miR-219可能對改善肝細(xì)胞的脂質(zhì)代謝紊亂，緩解脂質(zhì)沉積起關(guān)鍵作用。PCNA和CyclinD1是細(xì)胞DNA合成過程中的重要因子，其表達(dá)水平可反映細(xì)胞活性或細(xì)胞增殖的情況[14,15]。Q-PCR檢測過表達(dá)miR-219后PHC中這兩個(gè)基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PCNA和Cyclin D1的表達(dá)均出現(xiàn)明顯上升，EDU檢測也提示細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)。此外，凋亡相關(guān)因子Caspase-3與細(xì)胞凋亡成正相關(guān)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19],而Bcl-2負(fù)調(diào)控細(xì)胞凋亡[20]，過表達(dá)miR-219可明顯抑制Casepase-3的表達(dá)，而促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)。這些表明過表達(dá)miR-219可緩解高脂對肝細(xì)胞活性的影響，促進(jìn)增殖并抑制凋亡。

綜上所述，在高脂環(huán)境下，miR-219不僅可顯著緩解肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝紊亂，減輕脂質(zhì)沉積，也能夠減輕脂毒性對細(xì)胞活性的影響，促進(jìn)細(xì)胞增殖抑制凋亡，發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用。但是miR-219在脂肪肝進(jìn)程中起保護(hù)作用的具體機(jī)制及其下游靶基因仍需要進(jìn)一步的探索。