蔡瑩，都曉輝，張愛華，王喜軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學藥學院，國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學研究中心，黑龍江 哈爾濱 150040)

健康模式及疾病譜的變化給現(xiàn)代醫(yī)學研究提出眾多新的命題，單靶點單一降脂藥物的簡單治療模式難以解決脂代謝紊亂引發(fā)的多靶點復(fù)雜性疾病的治療問題[1]。脂代謝異?？蓪е露喾N疾病的發(fā)生和發(fā)展，例如:動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥、非酒精性脂肪肝炎、肥胖及阿茲海默癥等[2-7]。血脂異常經(jīng)常出現(xiàn)在代謝綜合征和2型糖尿病病程中[8-9]，通常表現(xiàn)為總膽固醇、低密度脂蛋白，甘油三酯水平升高，高密度脂蛋白水平下降[10-11]。疾病脂質(zhì)異常代謝特征為其治療研究提供了新策略[12]。中藥復(fù)方制劑是由多種藥物按君臣佐使配伍規(guī)則組成的“有制之師”，針對疾病實施多成分、多靶點、多層次的整體作用，調(diào)脂療效明確，作用溫和，相比單獨的他汀類藥物治療，降脂干預(yù)風險更低，安全性更好，對疾病的預(yù)防與治療意義重大[13-15]。因此，以機體脂代謝為靶向特征的方劑與針對單一靶點開發(fā)的藥物相比，具有獨特的治療優(yōu)勢。但目前中藥調(diào)脂效應(yīng)研究還停留在幾個血脂指標的簡單重復(fù)，缺乏現(xiàn)代語言的科學闡釋，其療效靶點、作用機制不清晰、不明確，這極大地限制了中藥調(diào)脂的應(yīng)用及調(diào)脂作用有效性的科學闡釋[16]。

脂質(zhì)的重要生物功能及其與疾病的關(guān)系，催生了脂質(zhì)組學這一新的研究領(lǐng)域。脂質(zhì)組學采用分析化學方法對生物體脂質(zhì)組進行有目的分析，可有效分析不同生理病理狀態(tài)下脂質(zhì)水平、脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)的變化，從而有效識別新的信號分子，揭示不同生理病理狀況的潛在機制，發(fā)現(xiàn)用于疾病早期診斷和預(yù)后的潛在脂質(zhì)生物標志物，篩選藥物靶點及評價藥物功效，為疾病的防治開辟新的思路[17]。脂代謝研究正在經(jīng)歷從分子水平向網(wǎng)絡(luò)互作集成、從靜態(tài)到動態(tài)等方面的縱深發(fā)展，已經(jīng)在疾病早期診斷、藥物靶點發(fā)現(xiàn)及疾病機理研究等方面取得重大進展。因此，本文系統(tǒng)綜述脂質(zhì)組學分析的關(guān)鍵技術(shù)以及脂質(zhì)組學在生命科學研究中的最新進展，為中藥調(diào)脂作用機制研究提供方法參考。

1 脂質(zhì)組學研究方法

研究不同生理病理狀態(tài)下的脂質(zhì)水平，可有效評估機體生理狀態(tài)，從脂質(zhì)分子層面闡釋進行疾病機制的研究[18]。脂質(zhì)組學研究方法有以下優(yōu)勢：只研究脂類物質(zhì)及其代謝共同物，脂類物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的共同特點決定了樣品前處理及分析技術(shù)平臺的搭建較為容易，而且可以借鑒代謝組學的研究方法；脂質(zhì)組學數(shù)據(jù)庫的建立和完善速度較快，并能建立與其他組學的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系；脂質(zhì)組學分析的技術(shù)平臺可用于代謝組學的研究，促進代謝組學發(fā)展。

完整的脂質(zhì)組學研究流程主要包括脂質(zhì)的提取、分離，數(shù)據(jù)采集以及數(shù)據(jù)分析。根據(jù)分析目的不同又可分為靶向脂質(zhì)組學、非靶向脂質(zhì)組學以及將兩種分析策略相結(jié)合的擬靶向脂質(zhì)組學。由于脂質(zhì)不是以游離形式存在于基質(zhì)中，待分析的生物樣本通常需要進行適當?shù)那疤幚硪越档蜆O性代謝物對脂質(zhì)分析的干擾。現(xiàn)有研究中多采用不同比例氯仿/甲醇溶液進行液液萃取從而提取分離脂質(zhì)，即較為經(jīng)典的Folth萃取法、Bligh-Dyer萃取法等，適用于從各種樣品基質(zhì)中非選擇性和可重復(fù)地提取各種類別的脂質(zhì)[19-20]。

包括薄層色譜(TLC)、液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)、親水相互作用(HILIC)等在內(nèi)的各種色譜儀具有強大的分離能力,可以對復(fù)雜樣品中的脂質(zhì)化合物進行分離，現(xiàn)已成為全面脂質(zhì)分析必不可少的有效工具。色譜質(zhì)譜聯(lián)用法可以為脂質(zhì)輪廓分析提供更詳盡的信息。質(zhì)譜由于其出色的準確度、靈敏度以及分析效率成為脂質(zhì)分析的有力工具[17,21]，質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展極大地推動了脂質(zhì)組學的發(fā)展。在脂質(zhì)組學的相關(guān)研究中，電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)已成為脂質(zhì)組織分析的主流電離方法[22]。此外，大氣壓化學電離(APCI)也常見于脂質(zhì)組學的研究中，可大幅提升檢測靈敏度[23]?；谫|(zhì)譜的脂質(zhì)組學可以分為：樣品直接注入色譜儀的鳥槍脂質(zhì)組學，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)的脂質(zhì)組學，基于離子遷移質(zhì)譜技術(shù)(IM-MS)的脂質(zhì)組學，質(zhì)譜成像(MSI)等。脂質(zhì)組學常用的儀器分析方法及應(yīng)用總結(jié)見表1。

表1 脂質(zhì)組學的儀器分析方法及應(yīng)用

此外，二維液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，超臨界流體色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，拉曼光譜、核磁共振(NMR)光譜等儀器技術(shù)也廣泛應(yīng)用于脂質(zhì)分析[50-54]。多種儀器聯(lián)用進行脂質(zhì)分析可顯著提高峰容量，適用于分離復(fù)雜樣品中的多種脂質(zhì)，能夠獲得全面的脂質(zhì)信息，在脂質(zhì)組學研究中具有較大的發(fā)展?jié)摿53,55]。

2 脂質(zhì)組學在中藥治療效應(yīng)中應(yīng)用

脂質(zhì)組學方法為中藥調(diào)脂研究提供了新的研究途徑，近年來，通過脂質(zhì)組學方法分析潛在作用機制的研究越來越多。大量的研究結(jié)果顯示，相比西藥降脂，中藥治療血脂異常具有良好的療效和安全性，中藥也逐漸成為探索開發(fā)新藥的主要研究目標載體[56]。

2.1 鳥槍脂質(zhì)組學方法

研究人員對高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型給予人參皂苷compound K(CK)，通過鳥槍脂質(zhì)組學方法分析了小鼠血清脂質(zhì)代謝物。研究發(fā)現(xiàn)差異脂質(zhì)分別為甘油三酯(TG)、膽固醇酯(CE)、磷脂酰膽堿(PC)和溶血磷脂酰膽堿(LPC)，人參皂苷CK可顯著回調(diào)小鼠血清中LPC和CE的水平[57]。

2.2 LC-MS方法

2.2.1 非靶向LC-MS

非靶向液質(zhì)聯(lián)用脂質(zhì)組學方法可對樣品中的脂質(zhì)進行全面的分析及描繪，獲得豐富的脂質(zhì)種類及脂質(zhì)代謝信息，可供構(gòu)建完整的脂質(zhì)代謝網(wǎng)絡(luò)[58]。紅景天在中醫(yī)藥中具有悠久的使用歷史，研究人員為明確紅景天低聚原花青素(OPCRR)的作用，采用HPLC-ESI-MS對口服紅景天低聚原花青素的大鼠血清脂質(zhì)譜進行非靶向分析，結(jié)果表明OPCRR治療顯著降低總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和ox-LDL等血脂譜，升高高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，可有效調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[59]。以高血脂為主要特征的高脂血癥可逐步發(fā)展成為動脈粥樣硬化等心血管疾病，嚴重影響人們的健康與生活質(zhì)量[60]。研究人員采用高脂飲食誘導的大鼠模型，給予茯苓并使用UPLC-HDMS非靶向分析大鼠血漿樣品[61]。研究發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)茯苓治療組的大鼠血漿相比，茯苓治療組血漿中甘油三酯、總膽固醇和低密度脂蛋白(LDL)膽固醇濃度的顯著下降，證明茯苓可顯著改善高脂血癥和相關(guān)的脂質(zhì)代謝物異常。

2.2.2 靶向LC-MS

靶向脂質(zhì)組學分析憑借其高靈敏度和高特異性的特點，常用于關(guān)鍵脂質(zhì)代謝通路或靶標脂質(zhì)的分析或驗證。多反映監(jiān)測模式(MRM)最為常用，可以提高分析靈敏度、選擇性以及線性范圍[62]。已有研究表明，苦丁茶中的三萜皂苷類可有效預(yù)防高脂血癥，溶血甘油磷脂(Lyso-GPL)與高脂血癥、動脈粥樣硬化等脂代謝異常類疾病有關(guān)。研究人員采用基于多反應(yīng)監(jiān)測模式的靶向分析策略對小鼠血清中Lyso-GPL進行脂質(zhì)組學分析[63]。該實驗在小鼠血清中共鑒定出6類153種Lyso-GPL異構(gòu)體，與對照組相比，高脂血癥小鼠血清內(nèi)總Lyso-GPLs含量減少，并且給予苦丁茶中的三萜皂苷類可回調(diào)血清中總Lyso-GPLs的含量。澤瀉具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)的藥理作用，通常用于治療高脂血癥。而溶血磷脂酰膽堿(Lyso PC)在脂質(zhì)代謝紊亂中起關(guān)鍵作用。因此，研究人員通過UHPLC-QTRAP-MS/MS定量分析高脂飲食誘導的高脂血癥小鼠模型中Lyso PC的變化，以評估澤瀉三萜類提取物的降脂活性[64]。研究表明澤瀉提取物中的三萜可以下調(diào)小鼠血清中27個Lyso PCs，上調(diào)19個Lyso PCs,Lyso PCs的代謝變化有助于對澤瀉降脂作用潛在機制的解讀。

3 脂質(zhì)組學在中藥調(diào)脂作用機制研究實踐

采用脂質(zhì)組學方法獲得的數(shù)據(jù)拓展了我們對脂代謝紊亂疾病生理病理學的認識，許多研究證實，不同的脂質(zhì)異常代謝通過不同的途徑發(fā)揮特定的致病作用。脂質(zhì)組學研究方法有效展現(xiàn)了中藥多靶點多途徑調(diào)節(jié)脂代謝紊亂的治療特點，可通過探索新的治療靶點為我們提供全新的中藥調(diào)脂策略[65]。

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是由于肝臟中脂肪過度積累[66]引起的慢性肝病之一，大量研究表明，NAFLD與肥胖，高血脂等代謝綜合征密切相關(guān)[67]。DENG等[68]采用基于超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)的非靶向脂質(zhì)組學方法，分析參苓白術(shù)散對高脂飲食誘導的NAFLD大鼠模型的保護作用機制。非靶向脂質(zhì)組學方法分析大鼠肝脂質(zhì)的結(jié)果表明，參苓白術(shù)散對NAFLD大鼠模型的30種脂質(zhì)均有回調(diào)作用。代謝通路分析結(jié)果表明，參苓白術(shù)散通過干預(yù)甘油磷脂代謝及甘油酯代謝途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)脂質(zhì)作用。二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，由陳皮、姜半夏、茯苓、炙甘草組成。有研究表明二陳湯對肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、高脂血癥、動脈粥樣硬化等脂代謝紊亂相關(guān)疾病有一定的治療效果[69-70]。研究人員采用高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)C57BL/6 J小鼠，采用UPLC-Q-TOF MS對小鼠血漿進行脂質(zhì)組學分析、多變量分析和脂質(zhì)通路富集分析[71]。研究結(jié)果表明，二陳湯顯著改變小鼠體內(nèi)神經(jīng)酰胺和甘油三酯代謝水平，并通過神經(jīng)酰胺和甘油三酯代謝通路發(fā)揮脂質(zhì)調(diào)節(jié)作用。中藥復(fù)方開心散由遠志、人參、茯苓和石菖蒲4味中藥組成,具有防治阿爾茲海默病的功效。研究人員利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對小鼠血清提取物進行脂質(zhì)組學分析,發(fā)現(xiàn)阿爾茲海默病模型組小鼠血清中的亞油酸、花生四烯酸和鞘脂代謝途徑發(fā)生紊亂,而開心散能夠回調(diào)這些通路從而緩解阿爾茲海默病模型小鼠的癥狀[72]。

4 展望

體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂可引發(fā)多種疾病，通過脂質(zhì)組學手段可以快速找到差異脂質(zhì)代謝物，但目前的中藥調(diào)脂研究中，脂質(zhì)組學技術(shù)的應(yīng)用大多局限于鑒定脂質(zhì)的種類和結(jié)構(gòu)，對潛在的作用機制還缺乏深入的挖掘和解讀。質(zhì)譜成像技術(shù)等新興的脂質(zhì)組學技術(shù)可從空間等多個維度探尋中藥藥效作用的靶點，豐富對高脂血癥的病理學認識，還可以深入中藥調(diào)脂機制的闡釋，在中藥調(diào)脂機制的研究中具有廣闊的應(yīng)用空間。

目前，中藥調(diào)脂研究中，對生物體內(nèi)脂質(zhì)組的研究多為非靶向的廣譜脂質(zhì)檢測，靶向檢測特定脂質(zhì)的研究較少。擬靶向脂質(zhì)組學策略結(jié)合了靶向分析策略和非靶向分析策略的優(yōu)點，通過高分辨質(zhì)譜綜合可獲取脂質(zhì)代謝物的一級和二級質(zhì)譜信息，再從二級質(zhì)譜中選擇特征脂質(zhì)離子對，然后以MRM模式在串聯(lián)質(zhì)譜儀器上進行離子對采集。擬靶向分析策略在中藥調(diào)脂中的應(yīng)用有希望提高分析結(jié)果的覆蓋率，發(fā)現(xiàn)更多的潛在脂質(zhì)標記物，獲取更準確的定量分析結(jié)果。針對脂質(zhì)分離困難的問題，可用離子遷移質(zhì)譜增強復(fù)合脂質(zhì)的分離效果，增強同分異構(gòu)體的分離程度，從而增強脂質(zhì)的鑒定能力及脂質(zhì)分析的準確性。

脂質(zhì)的鑒定和量化對深入了解脂質(zhì)在疾病發(fā)展中的功能具有重要意義。借助脂質(zhì)組學方法，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用等脂質(zhì)組學方法可以在相對較短的分析時間內(nèi)從總脂質(zhì)提取物中直接鑒定和準確定量數(shù)百種脂質(zhì)，有利于對中藥降脂作用機制進行闡釋，也可為中醫(yī)藥現(xiàn)代化提供全新的見解。