石笑弋，易必新*，李昌亮，2，李帥，2，劉雁鳴，2，蘭文，2，李健和（.湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 4000；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室，長沙 4000；.中南大學湘雅二醫(yī)院藥學部，長沙 400）

阿卡波糖是德國拜耳公司于20 世紀80年代從一種游離放線菌發(fā)酵分離得到的產(chǎn)物，由4 個單糖構成的寡糖，是世界上第一個

α

-葡萄糖糖苷酶抑制劑類的口服降糖藥，主要用于2 型糖尿病的治療，可通過抑制淀粉酶來減少葡萄糖的吸收，更適合于降低以碳水化合物為主食的亞洲糖尿病患者的血糖。阿卡波糖口服固體制劑自1994年在中國批準上市以來，不良反應相對較小，市場占有率較高，應用前景較廣。

目前，國內(nèi)現(xiàn)有阿卡波糖及其制劑質(zhì)量標準收載于《中國藥典》2020年版二部，其他相關質(zhì)量標準及文獻中阿卡波糖含量測定的分析方法多采用HPLC 法，檢測器普遍應用紫外或示差折光檢測器，亦有利用電噴霧檢測器等新型檢測器檢測，色譜柱大多使用氨基柱，流動相均采用大量有機試劑。現(xiàn)有方法大多存在受環(huán)境影響基線波動較大、靈敏度降低、柱效下降快或普及率不高等問題。因此，對阿卡波糖片及膠囊的含量測定方法進行改進十分必要。本文采用SCX 色譜柱，優(yōu)化了阿卡波糖口服固體制劑中阿卡波糖含量測定的方法，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

賽默飛Dionex UltiMate 3000 高效液相色譜儀、PDA 紫外檢測器；十萬分之一XP205 電子分析天平（Mettler Toledo）。阿卡波糖對照品（批號：100808-201905，含量：99.4%，中國食品藥品檢定研究院，水分：3.45%）。阿卡波糖原料藥（杭州中美華東制藥有限公司，批號：1909156AK）。1個廠家的阿卡波糖膠囊及6 個廠家的阿卡波糖片共165 批次樣品。磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、鹽酸等試劑為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；純水（Thermo Scientific GenPure 超純水機制備）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Welch Ultimate XB-SCX 柱（4.6 mm×250 mm，3 μm），流動相0.02 mol·L磷酸二氫鉀溶液，流速1.0 mL·min，柱溫40℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 供試品溶液的配制 取本品20 片（或20粒內(nèi)容物），精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于阿卡波糖50 mg），置50 mL 量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的配制 取阿卡波糖對照品適量，加水制成每1 mL 中約含1 mg 的溶液作為對照品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的配制 按處方比例及制備工藝，制備缺阿卡波糖的樣品，按“2.2.1”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液的配制 取阿卡波糖原料藥約200 mg，置10 mL 量瓶中，加少量水使溶解，加0.1 mol·L氫氧化鈉溶液1 mL，混勻，室溫放置1 h，加0.1 mol·L鹽酸溶液1 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

精密量取“2.2”項下陰性樣品溶液、系統(tǒng)適用性溶液及供試品溶液各10 μL，進樣測定，結果主峰與相鄰雜質(zhì)峰均有效分離，以阿卡波糖色譜峰計，拖尾因子小于1.2，理論板數(shù)大于5000。溶劑、輔料對測定均無干擾，見圖1。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗HPLC 圖Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 線性范圍、檢測限與定量限

精密稱取阿卡波糖對照品215.19 mg，置50 mL 量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液①，取該線性溶液6、3、2.5、2、0.5、0.2 mL，分別置10 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為2.478、1.239、1.032、0.8260、0.2065、0.082 60 mg·mL的線性溶液②～⑦。進樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（

X

）為橫坐標和峰面積（

Y

）為縱坐標進行線性回歸，得阿卡波糖回歸方程為

Y

＝2.529×10

X

－244.2，相關系數(shù)為1.000，線性范圍為0.082 60 ～4.130 mg·mL；并根據(jù)信噪比

S/N

≈ 3 確定檢測限（LOD），

S/N

≈ 10 確定定量限（LOQ），結果檢測限為6.8 μg·mL，定量限為22 μg·mL。

2.5 精密度試驗

取“2.4”項下質(zhì)量濃度約為1.0 mg·mL的對照品溶液，連續(xù)進樣6 次，記錄保留時間與峰面積。結果阿卡波糖峰面積的

RSD

＜1.5%，保留時間的

RSD

均＜1.0%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品（阿卡波糖片，批號：210301，規(guī)格：50 mg）6 份，按“2.2.1”項下方法制備并測定，結果含量平均值為100.11%，

RSD

為0.70%，表明方法重復性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性試驗

取“2.5”項下溶液室溫避光放置，分別于0、2、4、8、12、16、20 及24 h 進樣考察，阿卡波糖的峰面積

RSD

均＜2.0%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收試驗

取陰性樣品，精密加入阿卡波糖對照品，制成濃度相當于阿卡波糖含量100%水平的供試溶液共6 份，進樣分析，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算阿卡波糖的含量，結果平均回收率為99.41%，

RSD

為0.32%（

n

＝6）。

2.9 耐用性試驗

通過調(diào)節(jié)流速及柱溫，考察阿卡波糖峰的變化情況。結果阿卡波糖峰的理論板數(shù)均大于5000，拖尾因子均小于1.2，與相鄰雜質(zhì)峰均能有效分離。

2.10 樣品測定

取165 批次樣品，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，按外標法以峰面積計算，并將含量測定結果與《中國藥典》2020年版二部收載的采用氨基柱測定的結果進行比較，采用SPSS 統(tǒng)計軟件對兩種方法含量測定測結果進行配對樣品

t

檢驗。結果相關系數(shù)

r

＝0.542，

P

＜0.001，認為兩配對變量有相關關系；

t

＝－3.263，

d

＝164，雙尾檢驗概率

P

＝0.001，表明兩種檢驗方法所測結果具有顯著性差異，結果見表1。

表1 樣品中阿卡波糖的含量結果( ＝165)
Tab 1 Content of acarbose in the sample ( ＝165)

含量均值的標準差/%藥典（采用NH2 色譜柱）98.811.12640.0877本文（采用SCX 色譜柱）99.091.21600.0946測定方法含量均值/%標準差/%

3 討論

《中國藥典》2020年版二部是采用HPLC 法測定阿卡波糖的含量。采用氨基色譜柱，以乙腈-磷酸鹽緩沖液（75∶25）為流動相，流速2 mL·min，柱溫35℃，檢測波長 210 nm。該方法存在很多缺點，嚴重影響了方法的重現(xiàn)，并造成應用困難：① 相鄰降解雜質(zhì)Ⅰ峰與主峰的分離效果不佳，只有系統(tǒng)適用性中規(guī)定雜質(zhì)Ⅰ的峰高（Hp）與雜質(zhì)Ⅰ和阿卡波糖兩峰之間的峰谷（Hv）之比Hp/Hv不得低于2.0 的要求；② 氨基柱耐用性較差，鍵合相容易流失，最多使用150 次左右，柱效嚴重降低，色譜峰峰形變差，影響準確定量；③ 流動相中有機試劑毒性大，流速大，檢測成本高。因此，有必要優(yōu)化阿卡波糖含量測定的分析方法，改善方法的重現(xiàn)性和可應用性，提高藥品質(zhì)量控制水平。目前尚未見采用SCX 色譜柱HPLC 法測定阿卡波糖含量的報道。

3.1 流動相的選擇

阿卡波糖在水中極易溶解，在乙腈中不溶。本文采用水為溶劑，0.02 mol·L磷酸二氫鉀溶液為流動相，能解決《中國藥典》2020年版二部方法中因溶劑與流動相中有機相比例差異對靈敏度、出峰時間及峰形等的影響。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

本文以0.02 mol·L磷酸二氫鉀溶液為流動相，流速1.0 mL·min，柱溫40℃的色譜條件，采用SCX 色譜柱（4.6 mm×250 mm，3 μm），系統(tǒng)適用性要求均能達到。SCX 色譜柱是一種典型的陽離子交換柱，以磺酸基強陽離子硅膠為鍵合相，用于堿性、水溶的化合物的分離。SCX 色譜柱較氨基色譜柱的固定相穩(wěn)定，不易產(chǎn)生柱流失，在使用約300 次后，組分仍然能保持良好的峰形，對稱性好，拖尾因子小，分離度與理論板數(shù)能滿足系統(tǒng)適用性要求。

3.3 小結

本文采用SCX 色譜柱的HPLC 法測得的阿卡波糖口服固體制劑含量結果準確、方法可靠，與《中國藥典》2020年版收載的方法相比，該方法毒性小、成本低、專屬性強、色譜柱耐用性好，具備一定的實用性。