楊永玉，姜思怡，葛星成，向大雄*（1.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部，長(zhǎng)沙 10011；2.湖南省轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)與創(chuàng)新藥物工程技術(shù)研究中心，長(zhǎng)沙 10007；.岳陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，湖南 岳陽(yáng) 1000；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)湘杏學(xué)院，長(zhǎng)沙 10208）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是由糖尿病引起的以尿蛋白升高、腎小球?yàn)V過(guò)率下降為特征的慢性腎臟疾病，是糖尿病最常見(jiàn)和最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一，也是目前引起終末期腎病的首要原因。大量證據(jù)表明炎癥和纖維化參與了DN 的發(fā)生、發(fā)展。抑制腎臟炎癥信號(hào)通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子NF-

κ

B（nuclear factorkappa B）以及纖維化信號(hào)通路TGF-

β

/Smad2/3可明顯延緩DN 的進(jìn)展。目前，對(duì)進(jìn)展期的DN 均無(wú)有效的藥物可以逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程，僅能延緩腎病進(jìn)展。

腎復(fù)舒顆粒（Shenfushu granule，SFSG）是由中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院臨床專(zhuān)家針對(duì)腎衰竭自主研發(fā)的醫(yī)院制劑，其由大黃、丹參、甘草、土茯苓、枳殼、牡蠣六味中藥材組成。SFSG 主要用于各種急、慢性腎衰竭及尿毒癥的治療。研究發(fā)現(xiàn)SFSG 可降低5/6 腎切除大鼠的血尿素氮、肌酐和尿蛋白水平，降低腎小球硬化和腎小管間質(zhì)損傷，增加微血管密度。臨床研究顯示SFSG 能降低慢性腎衰患者血液中硫酸吲哚酚濃度。此外，SFSG 也用于DN 患者的治療。本文研究了SFSG 對(duì)DN 進(jìn)展的保護(hù)作用，從抗腎臟炎癥以及纖維化的角度探討可能的作用機(jī)制，為SFSG 的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和臨床使用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

SFSG 提取物（中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院藥學(xué)部自制）。HE、PAS 和Masson’s 染色液（北京索萊寶科技有限公司）。

β

-actin（BM0627）、fibronectin（BA1772）、collagen4A1（BA3585）、IL-6（EK0411）和TNF-

α

（FEK0527）（博士德生物公司）；p-IKK

α

/

β

（ser176）抗體（Santa Cruz 公司，Sc-21661）。NF

κ

B p65（AF-1234）、p-Smad2（Ser250）（AF2545）和TGF-

β

（AF0297）抗體、RIPA 裂解液和BCA 法蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司）。p-NF-

κ

B p65（S536）抗體（abcam 公司，ab76302），IKK

α

/

β

抗體（Affinity 公司，AF6014）。血糖、肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。鏈脲佐菌素（STZ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 SFSG 提取物的制備

取大黃781 g，丹參625 g，土茯苓469 g，牡蠣156 g，枳殼312 g，甘草625 g，加水浸泡8 ～12 h，煎煮兩次，每次1.5 h，合并濾液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.15 ～1.30（60 ℃）的浸膏，噴霧干燥，即得SFSG 提取物。

2.2 動(dòng)物分組及造模

C57BL/6J 小鼠40 只，體質(zhì)量18 ～22 g[湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)及使用許可證：SCXK（湘）2019-0004]。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，自由進(jìn)食與飲水，飼養(yǎng)溫度（25±2）℃，濕度40%～60%。將小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和模型組。禁食過(guò)夜后，模型組小鼠連續(xù)腹腔注射STZ [60 mg·kg，0.1 mol·L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH 4.0）配制]5 d，正常對(duì)照組小鼠注射相同體積的0.1 mol·L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。48 h 后測(cè)定血糖，血糖濃度≥16.7 mmol·L認(rèn)為1 型糖尿病小鼠模型構(gòu)建成功。一周后，將模型組建模成功小鼠分為模型對(duì)照組、SFSG 組以及陽(yáng)性藥物組，每組10 只。SFSG 組小鼠灌胃給予2.08 g/（kg·d）的SFSG 提取物[0.5%的羧甲基纖維素鈉（0.5%CMC-Na）混懸]。小鼠給藥劑量換算依據(jù)為：人用最大劑量為16 g 提取物·d，按照體表面積計(jì)算小鼠使用劑量為2.08 g/（kg·d）。陽(yáng)性藥物組給予纈沙坦40 mg/（kg·d），給藥體積為0.20 mL。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組給予0.2 mL0.5%CMC-Na 溶液。給藥12 周后收集尿液，測(cè)定體質(zhì)量。將動(dòng)物處死，收集血樣和腎臟組織，對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

2.3 血糖、血尿素氮和血肌酐的測(cè)定

采集血液樣本，室溫下放置30 min，自然凝固。4℃、3000 r·min離心15 min，收集上清液。分別使用相應(yīng)的生化試劑盒測(cè)定血清中血糖、肌酐和血尿素氮（BUN）的含量。

2.4 尿微量白蛋白的測(cè)定

收集各組小鼠24 h 的尿液，采用尿微量白蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定24 h 尿白蛋白含量。

2.5 組織染色

腎臟組織用4%的多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，切片后，脫蠟。分別按照HE、PAS 或Masson’s 染色試劑盒染色，在光鏡下觀察、拍照。

2.6 組織炎癥因子指標(biāo)檢測(cè)

取腎臟組織約100 mg，加入試劑盒中勻漿液后用勻漿機(jī)打碎。12 000 r·min、4℃離心15 min，取上清液。測(cè)定上清液中IL-6 和TNF-

α

的濃度。

2.7 Western blot 分析

取適量腎組織，按照每 100 mg 組織加入1 mL RIPA 蛋白裂解液、10 μL 絲氨酸蛋白酶及巰基蛋白酶抑制劑。在冰浴條件下充分研磨，裂解30 min，4℃、12 000 r·min離心15 min。取上清液，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。配制10%的SDSPAGE 膠，每個(gè)凝膠孔中加入30 μg 的蛋白樣品。電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上。5%脫脂奶粉室溫下封閉非特異性抗原1 h，加入一抗[

β

-actin、fibronectin、collagen4A1、p-IKK

α

/

β

（ser176）、IKK

α

/

β

、NF-

κ

B p65、TGF-

β

、p-Smad2（Ser250）以及p-NF-

κ

B p65（S536），1∶500 稀釋]抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。用TBS-T 洗膜3 次，每次5 min。然后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000 稀釋?zhuān)?7℃孵育1 h。TBS-T 洗膜3次，每次5 min。ECL 發(fā)光液顯影成像。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用

x

±

s

表示。兩組數(shù)據(jù)用

t

檢驗(yàn)分析，多組間比較用Student-Newman-Keuls’t（SNK）分析以及Tukey’s 檢驗(yàn)，

P

＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SFSG 延緩DN 的進(jìn)展

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠血糖、血尿素氮、血肌酐、24 h 尿微量白蛋白以及尿微量白蛋白與肌酐比（ACR）升高，而體質(zhì)量降低。與模型對(duì)照組相比，SFSG 對(duì)血糖和體質(zhì)量沒(méi)有影響；SFSG 降低DN 小鼠血尿素氮、血肌酐、尿微量白蛋白和ACR 水平（見(jiàn)圖1）。

圖1 腎復(fù)舒顆粒對(duì)DN 進(jìn)展的影響Fig 1 Effect of SFSG on the development of DN

3.2 SFSG 改善DN 小鼠腎臟損傷

HE 染色結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠腎小球體積明顯增加；相比于模型對(duì)照組，SFSG 組小鼠的腎小球面積明顯降低（見(jiàn)圖2A 和2B）。PAS 染色結(jié)果顯示模型對(duì)照組小鼠腎小球系膜基質(zhì)含量增加，SFSG 可明顯降低系膜基質(zhì)的含量（見(jiàn)圖3C 和3D），這些結(jié)果說(shuō)明SFSG 對(duì)DN 小鼠腎臟損傷具有保護(hù)作用。

圖2 SFSG 對(duì)DN 小鼠腎臟損傷的影響Fig 2 Effect of SFSG on kidney tissue damage of DN mice

3.3 SFSG 改善DN 小鼠腎組織的炎癥水平

與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠腎臟組織中IL-6 和TNF-

α

的水平顯著升高。與模型對(duì)照組相比，SFSG 給藥組IL-6 和TNF-

α

的水平顯著降低（見(jiàn)圖3A 和3B）。NF-

κ

B 的磷酸化影響其轉(zhuǎn)錄活性，而IKK 復(fù)合物是NF-

κ

B 信號(hào)通路的主要調(diào)節(jié)蛋白。與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠腎臟組織中p-NF-

κ

B p65（S536）/NF-

κ

B p65 以及p-IKK

α

/

β

（ser176）/ IKK

α

/

β

的水平明顯增加，而SFSG 可抑制p-NF-

κ

B p65（S536）/NF-

κ

B p65 以及p-IKK

α

/

β

（ser176）/ IKK

α

/

β

水平的增加。這些結(jié)果表明SFSG 改善DN 小鼠腎組織的炎癥水平。

圖3 SFSG 對(duì)DN 小鼠腎臟炎癥水平的影響Fig 3 Effect of SFSG on the inflammatory levels of kidney of DN mice

3.4 SFSG 降低DN 小鼠腎臟纖維化

Masson’s 染色結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠腎小球和腎小管中膠原纖維的含量顯著升高；而相比于模型對(duì)照組，SFSG可抑制腎臟組織中膠原纖維的升高（見(jiàn)圖4A）。TGF-

β

1/Smads 信號(hào)通路在腎臟纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。相比于正常對(duì)照組，模型對(duì)照組小鼠腎臟組織中p-smad2（ser250）、TGF-

β

、fibronectin 以及collagen4A1 的表達(dá)明顯升高，而SFSG 可顯著抑制這種改變（見(jiàn)圖4B）。

圖4 SFSG 對(duì)DN 小鼠腎臟纖維化的影響Fig 4 Effect of SFSG on the renal fibrosis of DN mice

4 討論

長(zhǎng)期高血糖與DN 的進(jìn)展密切相關(guān)，高血糖使腎臟血流動(dòng)力學(xué)和代謝途徑改變，引起致腎損傷的不同信號(hào)通路的激活。通過(guò)控制患者的血糖水平，可延遲DN 的進(jìn)展。DN 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種因素參與了其發(fā)病機(jī)制，包括晚期糖基化終產(chǎn)物的積聚、血流動(dòng)力學(xué)變化、炎癥反應(yīng)、自噬、細(xì)胞死亡和表觀遺傳調(diào)控等。DN最具特征性的病理改變是腎小球肥大、基底膜增厚、腎小球系膜和腎小管間質(zhì)基質(zhì)擴(kuò)張。目前仍然缺乏針對(duì)DN 的特異性治療方法。深入研究DN 的發(fā)病機(jī)制，開(kāi)發(fā)有效的治療藥物，對(duì)DN的防治極為重要。臨床應(yīng)用證明SFSG 是一種安全、有效的治療慢性腎衰的藥物。本研究發(fā)現(xiàn)SFSG 可降低DN 小鼠血肌酐、血尿素氮以及尿微量白蛋白的水平，說(shuō)明SFSG 可延緩DN 的進(jìn)展。

目前，大量證據(jù)表明炎癥在DN 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用?；罨腘F-

κ

B 經(jīng)核轉(zhuǎn)位后調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生各種趨化因子和炎癥因子。在正常狀態(tài)，NF-

κ

B 與I

κ

B 形成復(fù)合物存在于胞質(zhì)中，應(yīng)激狀態(tài)下，活化的IKK

α

/

β

使I

κ

B 磷酸化進(jìn)而降解，激活NF-

κ

B。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SFSG 降低DN 小鼠腎臟組織中炎癥因子IL-6 和TNF-

α

的水平，同時(shí)降低NF-

κ

B 和IKK 的磷酸化水平。這些研究表明SFSG 可抑制DN 小鼠腎臟的炎癥水平。在病理學(xué)上，DN 患者的腎臟經(jīng)歷了多種變化，包括細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的沉積、腎小球基底膜增厚和腎小管萎縮，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。纖維化的特征是細(xì)胞外基質(zhì)如fibronectin 和collagen4A1 的沉積增加。高糖及其代謝產(chǎn)物可誘導(dǎo)TGF-

β

1 的表達(dá)增加。TGF-

β

1 通過(guò)與 TGF-

β

受體 2（TGFBR2）結(jié)合后激活TGFBR1，導(dǎo)致 Smad2/3 的募集。激活的Smad2/3 復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)錄下游基因，如fibronectin。阻斷 TGF-

β

/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)可有效防止DN 的進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示SFSG 可降低DN 小鼠腎臟組織的纖維化，以及降低TGF-

β

、p-Smad2（Ser250）、fibronectin 和collagen4A1 的表達(dá)，均說(shuō)明SFSG 對(duì)DN 小鼠腎臟纖維化有抑制作用。

本研究發(fā)現(xiàn)SFSG 可明顯延緩DN 的進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制腎臟炎癥以及纖維化有關(guān)。本研究為SFSG 治療慢性腎衰的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。