黃博，黃清泉，白桂昌，羅軼，朱雪妍（廣西壯族自治區(qū)藥品檢驗(yàn)所國家藥品監(jiān)督管理局中藥材質(zhì)量監(jiān)測與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530021）

蛇膽汁為眼鏡蛇科、游蛇科或蝰科多種蛇的膽汁，為常用中成藥蛇膽川貝液、蛇連川貝散、牛黃蛇膽川貝液（膠囊、滴丸）等的主要原料。由于蛇膽汁具有獨(dú)特的藥用價值，加上市場需求量大，自然資源遞減，價格昂貴，市場上以雞、鴨、羊、豬、牛等動物膽汁冒充蛇膽汁和摻偽的情況時有發(fā)生，給藥品的正確使用、市場監(jiān)管帶來了一定困難。因此，需要建立蛇膽汁專屬性的鑒別方法。已有研究表明，蛇膽汁主要含有各種膽汁酸，如?；悄懰幔═CA）、?；蛆Z去氧膽酸（TCDCA）、甘氨去氧膽酸等，由于蛇膽汁的功效成分尚不明確，目前多以?；悄懰釣橹笜?biāo)對蛇膽汁進(jìn)行質(zhì)量控制。但文獻(xiàn)顯示，雞、羊、牛等動物膽汁也含有以上膽汁酸類成分，因此，以上述成分為指標(biāo)建立的分析方法無法真正區(qū)分蛇膽汁和其他動物膽汁。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS）可對成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，具有快速、高效、靈敏度高的特點(diǎn)，在中藥研究方面已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。因此，本研究擬采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)結(jié)合主成分分析（PCA）法，從整體上對蛇膽汁和其他動物膽汁的化學(xué)成分進(jìn)行分析比較，找出蛇膽汁區(qū)別于其他動物膽汁的差異性成分，并建立了基于特征離子的HPLC-MS-MS 鑒別方法。

1 儀器與試藥

戴安Ultimate3000 液相系統(tǒng)（美國Thermo公司）；布魯克ImpactII Q-TOF-MS 系統(tǒng)（德國Bruker 公司）；安捷倫1290 超高效液相系統(tǒng)、安捷倫6490 三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜（美國Agilent 公司）；MILLI-PROA 純水處理器（德國默克密理博公司）。Sartorius CP224S 萬分之一電子分析天平、梅特勒-托利多XS205 十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ-600VDB 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇、乙酸銨、乙腈均為色譜純（德國MERCK 公司）。

原蛇膽汁（活蛇取膽，立即用50%乙醇1∶1浸泡，活蛇由廣西梧州制藥集團(tuán)股份有限公司協(xié)助收集，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所主任藥師謝培德鑒定）樣品15 種，生產(chǎn)企業(yè)投料蛇膽汁樣品26 批，其他動物膽汁收集于菜市場，見表1 ～2，所有樣品均經(jīng)50%乙醇1∶1 浸泡處理。蛇膽汁對照藥材（批號：120938-200705，每瓶裝60 mg，相當(dāng)于蛇膽汁5 mg）及?；悄懰徕c對照品（批號：110815-201510，含量87.9%）（中國食品藥品檢定研究院）。41 批蛇膽川貝液樣品來源于廣西專項抽驗(yàn)。

表1 蛇膽汁樣品信息表
Tab 1 Information for snake bile samples

序號品種數(shù)量/條序號品種數(shù)量/條1烏梢蛇3 9 蝮蛇3 2王錦蛇3 10 玉斑錦蛇3 3滑鼠蛇3 11 百花錦蛇3 4金環(huán)蛇3 12 三索錦蛇3 5銀環(huán)蛇3 13 赤練蛇3 6眼鏡蛇3 14 黑眉錦蛇3 7蘄蛇3 15 眼鏡王蛇3 8蝰蛇3

表2 其他動物膽汁樣品信息表
Tab 2 Information for bile samples from other animals

序號品種數(shù)量序號品種數(shù)量1雞4 只4羊4 只2鴨5 只5豬5 只3牛4 頭6狗4 只

2 超高效液相-四極桿-飛行時間質(zhì)譜方法

2.1 UPLC-Q-TOF-MS 條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Thermo AcclaimRSLC 120 C（2.2 μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：甲醇（A）-10 mmol·L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0 ～5 min，30%→50%A；5 ～20 min，50%→90%A；20 ～25 min，90%A；25 ～26 min，90%→30%A；26 ～30 min，30%A）；柱溫35℃，流速0.3 mL·min，進(jìn)樣量1 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：ESI；干燥氣溫度：220 ℃；干燥氣流速：8 L·min；霧化氣壓力：2 bar；毛細(xì)管電壓：3500 V；噴嘴電壓：500 V；校正液：甲酸鈉溶液；掃描范圍：50 ～1000，掃描頻率1 Hz。

2.2 供試品溶液的制備

精密吸取膽汁50 μL，置2 mL 離心管中，精密加入50%甲醇950 μL，搖勻，過0.22 μm 濾膜，即得。

2.3 蛇膽汁成分研究

采用UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)，對蛇膽汁的成分進(jìn)行研究。對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，根據(jù)文獻(xiàn)和獲取的對照品進(jìn)行定位，對色譜峰進(jìn)行歸屬；對其他質(zhì)譜響應(yīng)較高的化合物，則根據(jù)分子量進(jìn)行推測。在負(fù)離子模式下，蛇膽汁共檢測出38個成分，見圖1 和表3。

圖1 蛇膽汁組分疊加圖Fig 1 Superposed graph of snake bile components

結(jié)合文獻(xiàn)報道，從表3 可看出，蛇膽汁中的絕大部分成分為膽酸類成分，?；悄懰釣樯吣懼闹饕煞郑渌麨樵谂；悄懰峤Y(jié)構(gòu)式的基礎(chǔ)上加減-H、-OH、-SOH、-CH等基團(tuán)。

表3 蛇膽汁成分分析
Tab 3 Components of snake bile

注：“/”表示無法分析。
Note：“/”indicates that it cannot be analyzed.

No.保留時間/min化學(xué)式[M-H]－誤差 英文名/化學(xué)名11.10 C4H7NaO4141.01690.3 sodium diacetate/雙乙酸鈉21.29 C6H13NO2341.10900.2 maltose/亮氨酸33.37 /443.1744//43.55 C26H44NO10S2 296.6175（雙電荷）1.9 /54.58 C21H34NO10S2 254.0729（雙電荷）0.5 /65.00 C26H44NO10S2 594.24140.3 /75.22 C26H45NO7S 514.28430.2 /85.46 C26H44NO11S2 304.6150（雙電荷）1.7 /95.73 C19H32O8S2225.0701（雙電荷）1.9 /10 6.19 C26H45NO10S2 296.6175（雙電荷）1.9 /11 6.53 C26H45NO10S2 594.24100.4 sulfate of taurocholate /牛磺膽酸硫酸酯12 6.79 C22H43NO14S 287.6121（雙電荷）3.0 /13 7.00 C26H45NO10S2 296.6174（雙電荷）1.6 14 7.37 C26H45NO9S2 288.6196（雙電荷）0.6 /15 7.90 C26H45NO9S2 288.6197（雙電荷）0.7 /16 8.3C26H45NO7S 514.28371.3 17 8.55 C26H43NO9S2 287.6119（雙電荷）0.6 /18 8.91 C26H45NO9S2 288.6199（雙電荷）1.2 sulfate of taurodeoxycholate /?；侨パ跄懰崃蛩狨?9 9.26 C26H43NO7S 512.26791.7 /20 9.45 C30H51NO10S2 323.6409（雙電荷）1.3 /21 9.73 C26H45NO7S 514.28371.4 22 9.92 C26H43NO8S2 279.6147（雙電荷）1.5 /23 11.00 C26H43NO7S 512.26830.8 /24 11.15 C30H50O11S2 324.1328（雙電荷）1.1 /25 11.26 C28H48O10S2 303.1276（雙電荷）1.5 /26 11.66 C28H46O8S541.28351.1 /27 12.00 C26H45NO7S 514.28470.6 taurocholic acid/?；悄懰?8 13.51 C30H51NO7S 568.33100.5 /29 14.55 C26H45NO6S 498.28881.6 ethanesulfonic acid/?；蛆Z去氧膽酸30 14.72 C27H48O7S515.30440.8 /31 15.01 C26H44O9499.29201.6 /32 17.07 C29H52O7S543.33540.7 /33 20.25 C20H32O2303.23241.7 /34 21.02 C16H32O2255.23251.6 /35 21.14 C17H34O6333.22810.6 /36 21.37 C18H34O2281.22802.1 /37 22.63 C32H64O4255.2325（雙電荷）1.7 /38 22.82 C18H36O2283.26362.2 /

2.4 蛇膽汁特征成分的篩選

為考察蛇膽汁和其他動物膽汁之間的差異，本實(shí)驗(yàn)對蛇膽汁和其他動物膽汁進(jìn)行UPLC-QTOF-MS 分析，每種動物膽汁的基峰離子流圖見圖2。以Profileanalysis 應(yīng)用軟件對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。首先對每一針樣品找出分子特征成分，分子特征成分檢測參數(shù)為：保留時間范圍1 ～30 min，質(zhì)譜范圍為

m/z

50 ～1000，噪音閾值為20，相關(guān)系數(shù)閾值0.7，最小化合物長度10 譜圖，在此參數(shù)基礎(chǔ)上每針樣品均找出200 個以上的分子特征成分，再用PCA 法對全部數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果見圖3。

圖2 烏梢蛇膽汁（A）、雞膽汁（B）、鴨膽汁（C）、牛膽汁（D）、羊膽汁（E）、豬膽汁（F）、狗膽汁（G）的基峰離子流圖Fig 2 Basic peak chromatogram of the bile from Zaocys dhumnades（A），chicken（B），duck（C），bovine（D），sheep（E），pig（F），and dog（G）

圖3A 顯示，不同動物膽汁大致分別落在不同區(qū)域，蛇膽汁主要分布于評分圖的左下方，與其他動物膽汁明顯分離。圖3B 中每個點(diǎn)均代表一個分子特征成分，圖中心的分子特征成分對樣品的區(qū)分沒有貢獻(xiàn)，而距離中心越遠(yuǎn)的數(shù)據(jù)對樣品差異貢獻(xiàn)越大，得分和載荷圖中的方向是相互關(guān)聯(lián)的。從左下方的數(shù)據(jù)群里篩選出兩個代表蛇膽汁專屬性的特征成分，再基于化學(xué)成分的精確質(zhì)量數(shù)（≤2 mDa）和同位素豐度（≤20 mSigma），推斷出兩個特征成分的分子式，結(jié)果見表4。

表4 蛇膽汁特征成分的鑒定
Tab 4 Identification of marker of snake bile

No.保留時間/min實(shí)測值[M-H]－理論值[M-H]－ 誤差同位素豐度分子式S18.94 578.2464 578.2463 0.113.8C26H45NO9S2 S26.51 594.2415 594.2412 0.318.3C26H45NO10S2

圖3 蛇膽汁和其他動物膽汁的PCA 得分圖（A）和載荷圖（B）Fig 3 PCA score（A）and loading plot（B）of the snake bile and bile from other animals

對上述特征成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析：蛇膽汁的主要成分為牛磺膽酸，另含有少量?；蛆Z去氧膽酸，S1 的二級碎片498.288 為?；蛆Z去氧膽酸的[M-H]峰，而480.277 和124.007，則是牛磺鵝去氧膽酸的碎片離子，因此該成分含有?；蛆Z去氧膽酸的母核，而96.960 碎片離子，是HSO的[M-H]峰，故推斷S1 成分為牛磺鵝去氧膽酸3 號位的羥基被硫酸酯化所生成，將其稱為牛磺去氧膽酸-3-硫酸酯（SOTDC），碎片解析見圖4 ～5。同理，S2 二級碎片包含514.283、496.272、124.007 三個碎片離子，分別是?；悄懰岬腫M-H]峰及其豐度較大的兩個碎片離子，因此推測S2 是牛磺膽酸3 號位的羥基被硫酸酯化所生成，將其稱為?；悄懰?3-硫酸酯（SOTC），碎片解析見圖6 ～7。

圖4 蛇膽汁特征成分（S1）選擇離子流色譜圖（A）及其一級（B）、二級（C）質(zhì)譜圖Fig 4 Selected ion chromatogram（A）and MS1（B）and MS2（C）spectra of markers of the snake bile（S1）

圖5 ?；蛆Z去氧膽酸和蛇膽汁特征成分（S1）結(jié)構(gòu)式及其可能的裂解途徑Fig 5 Structural formula of taurodeoxycholic acid and markers of snake bile（S1）and possible fragmentation pathways

圖6 蛇膽汁特征成分（S2）選擇離子流色譜圖（A）及其一級（B）、二級（C）質(zhì)譜圖Fig 6 Selected ion chromatogram（A）and MS1（B）and MS2（C）spectra of markers of the snake bile（S2）

3 基于三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜蛇膽汁特征成分檢測方法的建立

3.1 HPLC-MS-MS 條件

采用三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜來建立多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）的檢測方法。

3.1.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C柱（1.8μm，2.1 mm×100 mm）；流動相：甲醇（A）-10 mmol·L乙酸銨溶液（B），梯度洗脫（0 ～10 min，40%→50%A；10 ～25 min，50%→80%A；25 ～25.5 min，80%→40%A；25.5 ～30 min，40%A）；柱溫35℃，流速0.3 mL·min，進(jìn)樣量1 μL。

3.1.2 質(zhì)譜條件 離子化模式：ESI；干燥氣溫度：200℃；干燥氣流速：12 L·min；霧化氣壓力：20 psi；鞘流氣溫度：350 ℃；鞘流氣流速：11 L·min；離子漏斗參數(shù)：高壓150 V，低壓60 V；毛細(xì)管電壓：3 kV；噴嘴電壓：1000 V。

圖7 ?；悄懰岷蜕吣懼卣鞒煞郑⊿2）結(jié)構(gòu)式及其可能的裂解途徑Fig 7 Structural formula of taurocholic acid and markers of snake bile（S2）and possible fragmentation pathway

根據(jù)每個特征成分的二級碎片，均選取了兩組MRM 離子對信息，并對離子對的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，建立HPLC-MS-MS 方法。牛磺去氧膽酸硫酸酯（SOTDC）檢測離子對為578.2 →498.3（定量）和578.2 →124.0，碎裂電壓均為380 V，碰撞能量分別為30 V、70 V；?；悄懰崃蛩狨ィ⊿OTC）檢測離子對為594.2 →514.3（定量）和594.2 →124.0，碎裂電壓均為380 V，碰撞能量分別為30 V、70 V。

選取雞、鴨、牛、羊、豬、狗等動物膽汁樣品按“2.2”項下方法制備后進(jìn)樣測定，按上述蛇膽汁兩個特征成分離子對進(jìn)行檢測。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確認(rèn)，蛇膽汁樣品中全部有質(zhì)譜信號檢出，而其他動物膽汁樣品均未檢出，見圖8。表明據(jù)此所建立的的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法準(zhǔn)確性良好，且所篩選的蛇膽汁特征成分具有特異性。

圖8 烏梢蛇膽汁（A）、雞膽汁（B）、鴨膽汁（C）、牛膽汁（D）、羊膽汁（E）、豬膽汁（F）、狗膽汁（G）的選擇離子色譜圖Fig 8 Selective ion chromatogram of the bile from Zaocys dhumnades（A），chicken（B），duck（C），bovine（D），sheep（E），pig（F），and dog（G）

3.2 蛇膽汁對照藥材溶液

取蛇膽汁對照藥材約10 mg，精密稱定，加50%甲醇10 mL，超聲處理（功率320 W，頻率40 kHz）10 min，過0.22 μm 濾膜，即得。

3.3 方法學(xué)驗(yàn)證

考察了精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明SOTDC 和SOTC 的精密度（

n

＝6）、重復(fù)性（

n

＝6）、穩(wěn)定性（24 h 內(nèi)，

n

＝6）

RSD

均小于3.0%，符合要求。

4 蛇膽川貝液中蛇膽汁特征成分檢測方法的建立

為了將建立的蛇膽汁鑒別方法應(yīng)用于處方制劑中，筆者以蛇膽川貝液為例，在上述蛇膽汁特征成分檢測方法的基礎(chǔ)上，建立了蛇膽川貝液中蛇膽汁的鑒別方法。

4.1 蛇膽汁對照藥材溶液

蛇膽汁對照藥材溶液的制備同“3.2”。

4.2 供試品溶液

取蛇膽川貝液供試品溶液5 mL，加水5 mL，加冰醋酸0.5 mL，搖勻，以每秒1 ～2 滴的速度過HLB 小柱（200 mg，使用前先用6 mL 甲醇，再用6 mL 水活化），用10 mL 水洗脫，棄去水洗液，抽干，再用20 mL 甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，轉(zhuǎn)移至雞心瓶中，于40℃減壓蒸干或氮?dú)獯蹈桑? mL 甲醇渦旋使溶解，過0.22 μm 濾膜，即得。

4.3 陰性樣品溶液

取缺蛇膽汁的陰性樣品5 mL，按“4.2”項下供試品溶液的制備方法操作，即得。

4.4 專屬性試驗(yàn)

吸取蛇膽汁對照藥材溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各2 μL，分別按“3.1”項下色譜條件和質(zhì)譜條件，進(jìn)樣分析，結(jié)果含蛇膽汁的陽性樣品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的保留時間位置上，呈現(xiàn)上述離子流色譜峰；陰性樣品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的保留時間位置上無相應(yīng)的離子流色譜峰，各藥味對測定無干擾，結(jié)果見圖9。

圖9 蛇膽汁對照藥材（A）、蛇膽川貝液陰性樣品（B）和蛇膽川貝液陽性樣品（C）的選擇離子色譜圖Fig 9 Selected ion chromatogram of snake bile control（A），negative sample of Shedan Chuanbei decoction（B）and positive sample of Shedan Chuanbei decoction samples（C）

4.5 方法學(xué)驗(yàn)證

考察了精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明蛇膽川貝液中SOTDC 和SOTC 的精密度（

n

＝6）、重復(fù)性（

n

＝6）、穩(wěn)定性（24 h 內(nèi)，

n

＝6）

RSD

均小于3.0%，符合方法學(xué)要求。

4.6 樣品測定

以擬訂的方法對監(jiān)督抽樣的41 批蛇膽川貝液樣品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果有一批樣品未檢出蛇膽汁的兩個專屬性成分，該批樣品疑似未按處方以蛇膽汁投料。

5 討論

UPLC-Q-TOF-MS 技術(shù)可以同時提供良好的分離效果，提供精確的、豐富的質(zhì)譜信息，被廣泛用于中藥復(fù)雜成分的在線快速鑒別。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合主成分分析法分析蛇膽汁和其他動物膽汁的差異。結(jié)果表明，利用該方法能區(qū)分蛇膽汁和其他動物膽汁，并找出具有鑒別意義的特征性成分，分別為?；侨パ跄懰崃蛩狨ィ–HNOS）和牛磺膽酸硫酸酯（CHNOS），再根據(jù)各自的二級碎片，建立了在質(zhì)譜定性鑒別中較常用且靈敏度很高的三重串聯(lián)四極桿多反應(yīng)監(jiān)測方法。但目前這兩個成分均無法在市場上獲得對照品，只能以蛇膽汁對照藥材作為特征成分保留時間的參照，這種通過對照藥材圖譜對色譜峰定位的思路在一些難以獲得對照物質(zhì)的民族藥或動物藥上已有嘗試。蛇膽川貝液為市面上常見的止咳藥，處方中除了蛇膽汁、平貝母，還有薄荷腦、杏仁水、蜂蜜及大量蔗糖等輔料。平貝母的主要成分為生物堿類，而大量的糖漿容易損耗儀器也會增加基質(zhì)效應(yīng)，降低靈敏度。綜合考慮，在樣品前處理中，先將樣品用冰醋酸酸化后，再經(jīng)過耐受酸堿的HLB 固相萃取小柱凈化，首先用水洗去糖漿以及酸化成鹽的生物堿，再用甲醇將膽汁酸類成分洗脫。本文選擇甲醇作為洗脫溶劑，獲得了更好的濃縮效率。該方法專屬性、重現(xiàn)性均良好，操作方便，能有效控制蛇膽汁不投料的不法行為。