舒展，任越，陳紫軍，張燕玲（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥信息工程重點實驗室，北京 102488）

復(fù)方杜仲健骨顆粒由杜仲、白芍、續(xù)斷、黃芪、枸杞子、牛膝、三七、雞血藤、人參、當(dāng)歸、黃柏、威靈仙12 味中藥組成。該藥為紅棕色的顆粒，微苦，具有滋補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血榮筋、通絡(luò)止痛的功效，臨床上主要用于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎、缺血性股骨頭壞死等骨關(guān)節(jié)疾病的治療。方中君藥為杜仲，可補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨。黃芪、續(xù)斷、白芍為臣藥，具有養(yǎng)血榮筋、補(bǔ)氣固表、柔肝止痛、調(diào)血脈、解痙抗炎、免疫調(diào)節(jié)的作用。人參、牛膝、當(dāng)歸、枸杞子、黃柏、三七、雞血藤為佐藥，具有補(bǔ)肝腎、益精氣、堅筋骨、消腫定痛的作用。威靈仙作為佐藥，發(fā)揮祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、止痛的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實，復(fù)方杜仲健骨顆?？梢杂行Ц纳乒顷P(guān)節(jié)疾病，其提取液能直接作用于軟骨細(xì)胞，改善新陳代謝，進(jìn)而維護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的正常構(gòu)造和功能，防止骨關(guān)節(jié)炎疾病的進(jìn)一步發(fā)展。

然而復(fù)方杜仲健骨顆粒的組成中藥眾多，且化學(xué)成分復(fù)雜，其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尚不清楚。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路與中醫(yī)藥多成分、多靶標(biāo)、系統(tǒng)調(diào)控的理念相一致，將其應(yīng)用于中藥研究能夠明確藥效物質(zhì)和疾病的關(guān)系，揭示藥物的作用機(jī)制，具有獨到的優(yōu)勢和廣闊的前景。因此，本研究通過數(shù)據(jù)庫收集復(fù)方杜仲健骨顆粒的化學(xué)成分及其潛在作用靶標(biāo)，分析其生物功能及信號通路，以期從分子網(wǎng)絡(luò)水平上研究復(fù)方杜仲健骨顆粒整體的作用機(jī)制，并對部分藥理作用和關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行生物驗證，進(jìn)而評價網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法的合理性和準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的復(fù)方杜仲健骨顆粒作用機(jī)制研究

1.1.1 復(fù)方杜仲健骨顆粒中藥成分及靶標(biāo)篩選及收集 通過中藥化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫（Traditional Chinese Medicine Database，TCMD）和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMSP（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）收集復(fù)方杜仲健骨顆粒12 味中藥的化學(xué)成分，并通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫收集相應(yīng)成分的靶標(biāo)。

1.1.2 靶標(biāo)名稱校準(zhǔn) 采用UniProt（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫中UniProtKB 檢索功能，通過輸入“1.1.1”項下收集到的蛋白名稱，規(guī)定物種為“human”，將獲得的所有蛋白校正為UniProt ID，從而得到復(fù)方杜仲健骨顆粒的化合物潛在作用靶標(biāo)。

1.1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及關(guān)鍵靶標(biāo)的獲取 為明確復(fù)方杜仲健骨顆粒靶標(biāo)間的相互作用，將復(fù)方杜仲健骨顆粒潛在作用靶標(biāo)導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/）平臺構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction network，PPI），選擇置信度高于0.7 的蛋白互作信息，然后將PPI 網(wǎng)絡(luò)模型導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，利用cytoHubba 插件，計算互作網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的度值（degree），并用度值評價節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵程度。

1.1.4 GO 功能富集分析與KEGG 富集分析 通過DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對得到的化合物潛在作用靶標(biāo)開展GO 富集分析和KEGG 富集分析。以

P

＜0.05 作為篩選條件，獲取復(fù)方杜仲健骨顆粒可能作用的GO 富集結(jié)果及信號通路。

1.2 復(fù)方杜仲健骨顆粒部分藥理作用及關(guān)鍵靶標(biāo)的驗證

1.2.1 細(xì)胞 小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW 264.7，購于上海澤葉生物科技有限公司。

1.2.2 儀器與試藥 二氧化碳培養(yǎng)箱（美國賽默飛公司）；倒置相差顯微鏡（德國徠卡公司）；TDL-50B 低速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)有限責(zé)任公司）。復(fù)方杜仲健骨顆粒（批號：2010908，規(guī)格每袋12 g，北京雙鶴藥業(yè)銷售有限責(zé)任公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（含谷氨酰胺，含丙酮酸鈉，貨號：06-1055-57-1ACS）、熱滅活特級胎牛血清（貨號：04-121-1A，BI 公司）；青鏈霉素（貨號：15140122，Invitrogen 公司）；MTT（貨號：0793，AMRESCO 公司）；脂多糖（LPS，貨號：L2880，LABLEAD 公司）；一氧化氮檢測試劑盒（貨號：E1030，北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；無水乙醇（貨號：SJ-C1-13-01ZY-017，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；氯仿（貨號：112050，北京市通廣精細(xì)化工公司）；異丙醇（貨號：10239，美國賽默飛公司）；無DNA酶/RNA 酶去離子水（貨號：RT121）、6×Loading Buffer（貨號：9156）、D2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)（貨號：MD114-02）、GeneGreen 核酸染料（貨號：RT210）（TIANGEN 公司）；PCR 引物（上海生工公司）；PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（貨號：RR037A）、SYBR Premix Ex Taq II（貨號：RR820A）（TAKARA 公司）。

1.2.3 藥物配制 稱取復(fù)方杜仲健骨顆粒10 g 加蒸餾水50 mL，超聲破碎90 min（20 kHz），5000 r·min離心15 min。離心后取上清液，利用冷凍干燥機(jī)將上清凍干后于－20℃保存，實驗前用DMEM 培養(yǎng)液稀釋，5000 r·min離心15 min，兩次離心后，0.22 μm 濾膜過濾，依次稀釋至質(zhì)量濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 RAW 264.7 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%熱滅活特級胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基，于37℃、5%CO條件下培養(yǎng)，次日更換新鮮DMEM 完全培養(yǎng)基。

1.2.5 復(fù)方杜仲健骨顆粒細(xì)胞毒性評價 RAW 264.7 細(xì)胞生長至85%～90%時，制成密度為每孔5×10個的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱孵育24 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有不同質(zhì)量濃度的藥物培養(yǎng)基（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L），每組設(shè)置4 個復(fù)孔，置5% CO、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg·mL）100 μL，培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育4 h 后棄去上清液，每孔加入DMSO 150μL，避光振搖10 min，采用連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀在490 nm 波長處測量各孔的吸光度值，并計算各組細(xì)胞的存活率。

1.2.6 復(fù)方杜仲健骨顆粒對NO 釋放的影響RAW 264.7 細(xì)胞生長至85%～90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，制成密度為每孔5×10個的細(xì)胞懸液，接種于96 孔板中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱孵育24 h 后，棄去舊的培養(yǎng)液，將96 孔板培養(yǎng)的細(xì)胞分為空白對照組、模型組和不同劑量藥物組。空白對照組加入完全培養(yǎng)基；模型組加入0.2 μg·LLPS 溶液；藥物組加入0.2 μg·LLPS 和不同質(zhì)量濃度的復(fù)方杜仲健骨顆粒（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L）混合液。作用24 h 后，采用NO 檢測試劑盒測定NO 釋放量。

1.2.7 復(fù)方杜仲健骨顆粒對

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

mRNA 表達(dá)的影響 將處于對數(shù)期的RAW 264.7細(xì)胞以每孔9×10個接種于6 孔板中，每孔2 mL。細(xì)胞貼壁24 h 后，設(shè)為空白對照組、模型組和藥物組，空白對照組加入完全培養(yǎng)基；模型組加入0.2 μg·LLPS 溶液；藥物組加入0.2 μg·LLPS 和最大無毒濃度的復(fù)方杜仲健骨顆?；旌弦海靠? mL，培養(yǎng)24 h 后，提取總RNA。使用RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。RT-qPCR 采用SYBR Green 法。利用2計算目的基因表達(dá)量，試驗所需引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。目的基因引物序列見表1。

表1 PCR 引物序列
Tab 1 Primer sequence of PCR

靶標(biāo)正向引物反向引物STAT3AATCTCAACTTCAGACCCGCCAACGCTCCACGATCCTCTCCTCCAG TNFGCGACGTGGAACTGGCAGAAGGTGGTTTGTGAGTGTGAGGGTCTG MAPK1AATAAGGTGCCGTGGAACAGGTTGAAGTCGTCCAGCTCCATGTCAAAC GAPDH（內(nèi)參）CGTCCCGTAGACAAAATGGTTTGATGGCAACAATCTCCAC

1.2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較使用單因素方差分析方法（One-way ANOVA），

P

＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的復(fù)方杜仲健骨顆粒作用機(jī)制研究

2.1.1 復(fù)方杜仲健骨顆粒中藥成分及靶標(biāo)篩選及收集 本研究基于TCMSP 數(shù)據(jù)庫、TCMD 數(shù)據(jù)庫，收集得到復(fù)方杜仲健骨顆?；瘜W(xué)成分及對應(yīng)靶標(biāo)。去重后得到杜仲相關(guān)成分167 個，續(xù)斷57個，黃芪115 個，三七191 個，黃柏153 個，威靈仙81 個，枸杞102 個，人參326 個，當(dāng)歸161個，白芍112 個，牛膝56 個，雞血藤71 個。通過TCMSP 收集到337 個靶標(biāo)蛋白，經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫對靶標(biāo)名稱進(jìn)行校準(zhǔn)后去重，共得到有效UniProtID 279 個。

2.1.2 復(fù)方杜仲健骨顆粒蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶標(biāo)的篩選 將279 個潛在靶標(biāo)錄入STRING數(shù)據(jù)庫， 設(shè)置interaction score ＞0.7， 利用Cytoscape 3.8.2 進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖1。對復(fù)方杜仲健骨顆粒PPI 的關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，可參與抗炎作用，如TNF、IL-6 等；并可參與細(xì)胞生長、增殖和分化，如STAT3、VEGFA 等；部分靶標(biāo)對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)具有調(diào)節(jié)作用，如MAPK1、MAPK14、MAPK8 等。

圖1 復(fù)方杜仲健骨顆粒蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 PPI network of compound Duzhong Jiangu granule

2.1.3 GO 富集分析結(jié)果 以

P

＜0.05 為篩選條件，獲得GO 功能富集條目678 個，其中生物過程條目487 條。對以上生物過程進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)復(fù)方杜仲健骨顆?？赡軈⑴c的生物學(xué)過程可以歸為調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，對細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控，影響血管生成等方面（見表2）。

表2 復(fù)方杜仲健骨顆粒作用靶標(biāo)GO 生物學(xué)過程富集
Tab 2 Biological process of GO target enrichment in compound Duzhong Jiangu granule

分類條目名稱P 值炎癥反應(yīng)細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)（cellular response to lipopolysaccharide）4.39×10－12脂多糖介導(dǎo)的信號通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）1.55×10－9對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）8.73×10－8炎癥反應(yīng)（inflammatory response）1.73×10－5 NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)節(jié)（positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity）6.99×10－5 I-κB 激酶/NF-κB 信號的正調(diào)節(jié)（positive regulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling）3.36×10－4細(xì)胞因子分泌的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of cytokine secretion）6.88×10－4白三烯生物合成過程（leukotriene biosynthetic process）4.07×10－3對細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)控凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of apoptotic process）1.01×10－10凋亡過程的正向調(diào)控（positive regulation of apoptotic process）2.64×10－8無配體的外在凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）6.03×10－8神經(jīng)元凋亡過程的負(fù)調(diào)控（negative regulation of neuron apoptotic process）1.85×10－6神經(jīng)元凋亡過程的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of neuron apoptotic process）5.83×10－6參與凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的激活（activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）8.73×10－6凋亡過程（apoptotic process）2.32×10－5神經(jīng)元凋亡過程（neuron apoptotic process）1.88×10－4內(nèi)在凋亡信號通路的負(fù)調(diào)控（negative regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway）4.14×10－4響應(yīng)DNA 損傷的內(nèi)在凋亡信號通路（intrinsic apoptotic signaling pathway in response to DNA damage） 1.01×10－3響應(yīng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的內(nèi)在凋亡信號通路（intrinsic apoptotic signaling pathway in response to endoplasmic reticulum stress）1.67×10－2通過死亡域受體的外在凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway via death domain receptors） 2.43×10－2腫瘤壞死因子產(chǎn)生的負(fù)調(diào)控（negative regulation of tumor necrosis factor production）2.43×10－2血管生成血管生成的正向調(diào)節(jié)（positive regulation of angiogenesis）5.29×10－8血管生成（angiogenesis）8.50×10－5血管內(nèi)皮生長因子受體信號通路（vascular endothelial growth factor receptor signaling pathway）1.78×10－4血管生成的調(diào)節(jié)（positive regulation of angiogenesis）4.07×10－3

2.1.4 KEGG 富集分析結(jié)果 以

P

＜0.05 為篩選條件，對279 個靶蛋白進(jìn)行KEGG 通路富集，共富集到133 條信號通路。對以上信號通路進(jìn)行分析、歸類，發(fā)現(xiàn)復(fù)方杜仲健骨顆粒主要影響炎癥、軟骨細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及代謝等相關(guān)通路過程發(fā)揮作用，結(jié)果見表3。

表3 復(fù)方杜仲健骨顆粒作用靶標(biāo)KEGG 通路富集
Tab 3 KEGG signal pathway information of compound Duzhong Jiangu granule

分類信號通路名稱P 值炎癥相關(guān)信號通路腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）4.66×10－9 HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）3.25×10－8 Toll 樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway）1.48×10－7 T 細(xì)胞受體信號通路（T cell receptor signaling pathway）4.65×10－5軟骨細(xì)胞增殖、分化及凋亡相關(guān)通路鈣信號通路（calcium signaling pathway）6.63×10－8 p53 信號通路（p53 signaling pathway）1.98×10－5 PI3K-Akt 信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）3.07×10－5 FoxO 信號通路（FoxO signaling pathway）7.24×10－5 MAPK 信號通路（MAPK signaling pathway）2.30×10－4 NF-κB 信號通路（NF-kappa B signaling pathway）2.30×10－4 Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）1.21×10－3催產(chǎn)素信號通路（oxytocin signaling pathway）6.84×10－3 Jak-STAT 信號通路（Jak-STAT signaling pathway）1.37×10－2間接相關(guān)通路HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）3.25×10－8雌激素信號通路（estrogen signaling pathway）3.12×10－7甲狀腺激素信號通路（thyroid hormone signaling pathway）4.97×10－7血管內(nèi)皮生長因子信號通路（VEGF signaling pathway）1.13×10－6胰島素抵抗信號通路（insulin resistance signaling pathway）5.29×10－6脂肪細(xì)胞因子信號通路（adipocytokine signaling pathway）1.60×10－4

2.2 復(fù)方杜仲健骨顆粒部分藥理作用及關(guān)鍵靶標(biāo)驗證

為了進(jìn)一步評價網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，研究對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)獲得的關(guān)鍵藥理作用及靶標(biāo)進(jìn)行了實驗驗證。炎癥是骨關(guān)節(jié)疾病中非常重要的致病機(jī)制，且在本研究中為關(guān)鍵藥理作用。因此本研究選擇抗炎活性進(jìn)行驗證。LPS 刺激誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞炎癥模型可較好地反映體內(nèi)局部炎癥狀態(tài)，NO 水平能夠反映炎癥的嚴(yán)重程度。因此研究通過檢測復(fù)方杜仲健骨顆粒對LPS 刺激誘導(dǎo)的RAW 264.7 細(xì)胞炎癥模型的NO 生成抑制作用進(jìn)而評價其抗炎活性。此外，基于拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)TNF、STAT3、MAPK1 是復(fù)方杜仲健骨顆粒的關(guān)鍵作用靶標(biāo)。故研究利用RT-qPCR 對其進(jìn)行驗證。

2.2.1 復(fù)方杜仲健骨顆粒細(xì)胞毒性研究 不同濃度的復(fù)方杜仲健骨顆粒對RAW 264.7 細(xì)胞活性的影響結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，0.3125 ～2.5 g·L復(fù)方杜仲健骨顆粒對細(xì)胞無毒性，表明在2.5 g·L以下，復(fù)方杜仲健骨顆粒對RAW 264.7 細(xì)胞的正常生長無影響。

圖2 復(fù)方杜仲健骨顆粒對RAW 264.7 細(xì)胞存活率的影響Fig 2 Effect of compound Duzhong Jiangu granule on the survival rate of RAW 264.7 cells

2.2.2 復(fù)方杜仲健骨顆?？寡谆钚匝芯?與空白對照組相比，模型組NO 釋放量明顯增加（

P

＜0.001）。結(jié)果提示LPS 能誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生，成功構(gòu)建了巨噬細(xì)胞炎癥模型。與模型組相比，復(fù)方杜仲健骨顆粒在0.3125 ～2.5 g·L能有效降低NO 的釋放（

P

＜0.001），見表4。表明復(fù)方杜仲健骨顆?？梢栽谝欢ǔ潭壬匣謴?fù)RAW 264.7 的炎性損傷，進(jìn)一步驗證了復(fù)方杜仲健骨顆粒的抗炎作用。

表4 復(fù)方杜仲健骨顆粒對LPS 誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞釋放NO 的抑制作用
Tab 4 Inhibitory effect of compound Duzhong Jiangu granule on NO release induced by LPS

注：與空白對照組比較， ＜0.001；與模型組比較， ＜0.001。
Note：Compared with the blank control group， ＜0.001；compared with the model group， ＜0.001.

組別NO 釋放量/（μmol·L－1）抑制率/%空白對照組 1.04±0.05—模型組37.74±0.72*—復(fù)方杜仲健骨顆粒0.3125 g·L－1 組 34.42±0.21# 9.03±0.02復(fù)方杜仲健骨顆粒0.625 g·L－1 組29.87±0.22#21.43±0.02復(fù)方杜仲健骨顆粒1.25 g·L－1 組26.59±0.28#30.38±0.02復(fù)方杜仲健骨顆粒2.5 g·L－1 組 7.71±0.15#81.83±0.01

2.2.3 復(fù)方杜仲健骨顆粒對

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

mRNA 表達(dá)的影響 結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

的mRNA 表達(dá)水平上調(diào)（

P

＜0.01）；與模型組相比，2.5 g·L的復(fù)方杜仲健骨顆?？墒?p>TNF

、

STAT3

、

MAPK1

的mRNA 表達(dá)水平降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01 或

P

＜0.001），見圖3。

圖3 TNF、AKT1 和MAPK1 mRNA 表達(dá)水平Fig 3 mRNA expression level of TNF，AKT1，and MAPK1

3 討論

復(fù)方杜仲健骨顆粒在臨床上應(yīng)用廣泛，然而其整體作用機(jī)制尚不明確。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實驗，初步探討了復(fù)方杜仲健骨顆粒的整體作用機(jī)制。

綜合拓?fù)鋮?shù)、KEGG、GO 富集分析所得到的關(guān)鍵靶標(biāo)、信號通路、生命過程，構(gòu)建復(fù)方杜仲健骨顆?！瓣P(guān)鍵靶標(biāo)-信號通路-生命過程-藥理作用”網(wǎng)絡(luò)，見圖4。分析網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方杜仲健骨顆粒具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及凋亡、影響血管生成等藥理作用。

圖4 “關(guān)鍵靶標(biāo)-信號通路-生命過程-藥理作用”網(wǎng)絡(luò)Fig 4 Network of key targets-signaling pathways-biological processes-pharmacological action

目前，復(fù)方杜仲健骨顆粒在臨床上可用于骨關(guān)節(jié)疾病的治療?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，骨關(guān)節(jié)疾病的根本原因在于軟骨等“關(guān)節(jié)保護(hù)系統(tǒng)”對關(guān)節(jié)保護(hù)能力的喪失。研究表明，軟骨細(xì)胞和關(guān)節(jié)組織的其他細(xì)胞分泌的促炎因子能夠促進(jìn)軟骨基質(zhì)的降解，進(jìn)而破壞關(guān)節(jié)組織代謝平衡并導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)疾病的產(chǎn)生。此外，軟骨細(xì)胞增殖、分化以及凋亡過程能夠影響關(guān)節(jié)軟骨的退化。研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨病變的過程中，血管侵襲作為軟骨破壞的始動環(huán)節(jié)，起到了不容忽視的作用，新生血管可進(jìn)一步加重軟骨結(jié)構(gòu)的破壞，抑制血管侵襲可以阻止骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)一步發(fā)展。故推測復(fù)方杜仲健骨顆粒可能是通過影響骨關(guān)節(jié)處炎癥、軟骨細(xì)胞增殖、分化以及凋亡及調(diào)節(jié)血管生成等藥理作用，進(jìn)而發(fā)揮治療骨關(guān)節(jié)疾病的作用。

為評價網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法的合理性和準(zhǔn)確性，進(jìn)一步進(jìn)行了實驗驗證。首先針對作用突出的抗炎活性進(jìn)行了體外實驗驗證。本研究采用LPS 刺激巨噬細(xì)胞模擬人體在某些因素的刺激下引起的炎癥反應(yīng)的發(fā)生，通過不同濃度梯度的復(fù)方杜仲健骨顆粒對LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 的炎性損傷進(jìn)行細(xì)胞實驗。結(jié)果表明復(fù)方杜仲健骨顆?？稍谝欢ǔ潭壬蠝p輕RAW 264.7 的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步驗證了其抗炎作用。

對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的部分核心靶標(biāo)進(jìn)行RT-qPCR 檢測，發(fā)現(xiàn)復(fù)方杜仲健骨顆粒能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的RAW 264.7 炎癥細(xì)胞中

TNF

、

STAT3

和

MAPK1

基因的表達(dá)，與PPI 分析結(jié)果吻合。在骨關(guān)節(jié)炎疾病患者中，炎癥相關(guān)靶標(biāo)TNF 異常高表達(dá)。STAT3 是一種關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在炎性反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。且研究發(fā)現(xiàn)，STAT3是骨關(guān)節(jié)疾病的的核心轉(zhuǎn)錄因子，其可通過核因子

κ

B（NF-

κ

B）信號進(jìn)一步導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生。MAPK1 是MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要組成部分，MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則能夠負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子的過程，該過程最終可導(dǎo)致關(guān)節(jié)發(fā)炎和破壞，由此推斷復(fù)方杜仲健骨顆粒可能通過抑制

TNF

、

STAT3

和

MAPK1

mRNA 表達(dá)發(fā)揮抗炎的作用。上述結(jié)果在一定程度上從藥效以及靶標(biāo)層面揭示了復(fù)方杜仲健骨顆粒發(fā)揮作用的分子機(jī)制，并佐證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果。

綜上所述，本研究為復(fù)方杜仲健骨顆粒的整體作用機(jī)制解析提供了參考，為其臨床應(yīng)用提供了一定基礎(chǔ)。然而本研究仍存在一定不足，首先，本研究聚焦整體作用機(jī)制，未聚焦特定疾病，后期可針對特定疾病展開進(jìn)一步研究。此外，研究僅對復(fù)方杜仲健骨顆?？寡谆钚砸约安糠株P(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行了體外驗證，未對其他活性和靶標(biāo)進(jìn)行體外及體內(nèi)驗證。研究下一步將通過體外或體內(nèi)實驗對復(fù)方杜仲健骨顆粒的其他活性和關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步驗證，為其臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。