鮑巖巖 時宇靜 高英杰 周利潤 耿子涵 姚榮妹 郭姍姍 包 蕾 韓 冰 葛一蒙 崔曉蘭

(1 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700; 2 黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司,虎林,158400)

副流感病毒由于其諸多特性與流感病毒不同,故命名為副流感病毒。仙臺病毒屬于乙型副流感病毒,1959年在日本仙臺市從死于肺炎患者的肺液中獲得,是呼吸道感染性疾病的常見病原體[1-2]。副流感病毒是常常引起兒童、老人及免疫缺陷人群下呼吸道感染,其致病性僅次于呼吸道合胞病毒。復(fù)方芩蘭口服液由金銀花、黃芩、連翹、板藍(lán)根4味中藥組成,金銀花清熱解毒,疏風(fēng)解表為君藥;黃芩清熱燥濕,瀉火解毒,用于外部熱邪入肺引起肺熱咳嗽,高熱煩渴,可以助君藥清熱解毒為臣藥;板藍(lán)根清熱解毒,涼血消腫;連翹清熱解毒,消腫散結(jié),均可用于外邪入里入血而引起高熱不退以及熱毒蘊結(jié)于肺而造成的咳嗽胸痛等肺部感染癥狀。二者均可協(xié)助臣藥清熱解毒,散結(jié)消腫,對外毒內(nèi)侵造成的肺部病變有較好的消腫抗炎和修復(fù)能力。四藥合用,共奏辛涼解表,清熱解毒之功效。臨床報道其治療急性上呼吸道感染的整體療效較好,且具有較好的安全性[3-6]。為了進(jìn)一步研究復(fù)方芩蘭口服液防治副流感病毒感染的作用,本課題組采用副流感病毒(仙臺株)感染美國癌癥研究所(Institute of Cancer Research,ICR)小鼠模型,評價復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒感染治療作用,研究結(jié)果為臨床應(yīng)用提供實驗室數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選取3周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級ICR小鼠70只,雌雄各半,體質(zhì)量13～15 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,許可證號:SCXK(京)2016-0006。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所ABSL-2生物安全實驗室,溫度18～29 ℃,日溫差≤3 ℃,相對濕度40%～70%,新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h,噪聲≤60 dB,照度150～300 Lux。本研究所有動物實驗得到中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所動物倫理委員會批準(zhǔn)(倫理審批號:2019D025)。

1.1.2 病毒毒株 副流感病毒(仙臺株)購自美國典型菌種保藏中心(ATCC),由本ABSL-2生物安全實驗室常規(guī)傳代,在-80 ℃環(huán)境保存。

1.1.3 藥物 復(fù)方芩蘭口服液(黑龍江珍寶島藥業(yè)股份有限公司,批號:B14190506);利巴韋林顆粒(四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司,批號:190106);疏風(fēng)解毒膠囊(安徽濟人藥業(yè)有限公司,批號:2190504)。

1.1.4 試劑與儀器 甲醛(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號:F20180825);裂解液(北京索萊寶科技有限公司,批號:20191211);小鼠趨化因子(9因子混合)多因子檢測試劑盒(Luminex公司,美國,批號:218355-001)。A2型生物安全柜(Thermo公司,美國,型號:Thermo MSC1.8);電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司,型號:YP1002);電子天平(梅特勒-托利多儀器公司,型號:AL204);IVC小鼠飼養(yǎng)籠(蘇州馮氏股份有限公司,型號:ZJ-4);低溫高速離心機(Eppendorf公司,德國,型號:5810R)。

1.2 方法

1.2.1 劑量設(shè)計 復(fù)方芩蘭口服液成人臨床常規(guī)用量為60 mL/(kg·d),換算為小鼠高、中、低等效劑量為22 mL/(kg·d)、11 mL/(kg·d)、5.5 mL/(kg·d),分別相當(dāng)于人臨床用量的2倍、等倍及1/2倍,小鼠按20 mL/(kg·d)灌胃給藥,1次/d。利巴韋林顆粒成人臨床常規(guī)用量為450 mL/(60 kg·d),換算為小鼠等效劑量為82.5 mL/(kg·d),小鼠按20 mL/(kg·d)灌胃給藥,1次/d。疏風(fēng)解毒膠囊成人臨床常規(guī)用量為6.24 g/(60 kg·d),換算為小鼠等效劑量為1.144 g/(kg·d),小鼠按20 mL/(kg·d)灌胃給藥,1次/d。

1.2.2 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型肺指數(shù)的影響 70只ICR小鼠,按體質(zhì)量隨機分為7組:正常對照組、模型對照組、利巴韋林組、疏風(fēng)解毒膠囊組、復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組,每組10只,雌雄各半。除正常對照組外,其他各組小鼠乙醚輕度麻醉后,滴鼻感染100TCID50副流感病毒(仙臺株),45 μL/只。各組小鼠于感染后給予相應(yīng)的藥物,正常對照組、模型對照組在同等條件下給予蒸餾水,連續(xù)給藥4 d。第5天,小鼠稱重后眼眶取血并分離血清,分離肺組織后稱量肺重,肺組織分為2部分:一部分提取肺組織蛋白進(jìn)行多因子高通量檢測,另一部分肺組織用10%甲醛溶液固定后進(jìn)行組織病理學(xué)檢測。計算肺指數(shù)及抑制率,肺指數(shù)=肺濕重(g)/體質(zhì)量(g)×100,抑制率(%)=(模型組肺指數(shù)-給藥組肺指數(shù))/(模型組肺指數(shù)-正常對照組肺指數(shù))×100%。

1.2.3 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型病理改變的影響 固定于10%甲醛溶液中的肺組織,48 h后取出流水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,浸蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察、照相。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。鏡下觀察標(biāo)準(zhǔn)如下，“-”:小鼠肺組織及肺泡、肺組織內(nèi)細(xì)支氣管周圍及腔內(nèi)未見有明顯病變,結(jié)構(gòu)正常?！?”:小鼠肺組織間質(zhì)有輕度少量滲出液,病變較局限,肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍、腔內(nèi)未見有炎癥反應(yīng)?！?+”:小鼠肺組織間質(zhì)有明顯炎癥反應(yīng),肺泡間質(zhì)有輕度滲出性水腫,少部分肺間隔有輕度融合,肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍有滲出性炎癥反應(yīng),腔內(nèi)未見有炎癥反應(yīng)?！?++”:小鼠肺內(nèi)組織間質(zhì)大面積炎癥滲出,大量炎癥反應(yīng)細(xì)胞滲出,以淋巴為主、少量中性分葉核;肺間隔明顯水腫、淤血,大量血漿滲出,并有淤血;肺內(nèi)先支氣管周圍炎癥反應(yīng)明顯,有部分細(xì)支氣管內(nèi)有脫落炎癥反應(yīng)。

1.2.4 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型血清免疫因子生長調(diào)節(jié)癌基因-α(Growth-regulated Oncogene-α,GRO-α)、誘導(dǎo)蛋白-10(Induced Protein-10，IP-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)、MCP-3、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α(Macrophage Inflammatory Protein-1α,MIP-1α)、MIP-1β、RANTES的影響全血靜置分層后,3 500×g離心15 min,上層清液采用小鼠趨化因子(9因子混合)多因子檢測試劑盒檢測小鼠血清。

1.2.5 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響 稱量30 mg肺組織,剪碎,加入1 mL裂解液,超聲裂解,4 ℃,10 000×g離心30 min,上清液采用Mouse Chemokine Panel 1(9 plex)多因子檢測試劑盒檢測。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型肺指數(shù)的影響 與正常對照組比較,模型對照組肺指數(shù)顯著增加(P<0.01);與模型對照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高劑量組肺指數(shù)顯著降低(P<0.05),高、中、低劑量組肺指數(shù)抑制率分別為49.47%、29.68%、18.46%,且抑制率顯示出了量效關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型肺指數(shù)的影響(n=10)

2.2 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型病理改變的影響 正常對照組肺組織內(nèi)肺泡未見有融合,肺間質(zhì)未見有明顯炎癥反應(yīng)、水腫,血管內(nèi)未見有淤血;肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍及腔內(nèi)未見有炎癥反應(yīng)滲出,氣管黏膜未見有脫落,組織結(jié)構(gòu)正常。模型對照組部分肺組織內(nèi)肺泡有片狀融合,肺組織間質(zhì)有滲出性炎性腫脹,血漿滲出液粉色,滲出細(xì)胞以小淋巴細(xì)胞及B細(xì)胞為主,有少量中性分葉核、大量紅細(xì)胞滲出,有淤血。肺內(nèi)細(xì)支氣管周圍大面積炎癥反應(yīng)浸潤,部分腔內(nèi)有炎癥脫落;與正常對照組比較,模型對照組肺部及支氣管病變顯著(P<0.01)。復(fù)方芩蘭口服液高、中、低劑量組肺組織炎癥反應(yīng)滲出、水腫,病變,與模型對照組比較有改善;與模型對照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高、中劑量組支氣管病變顯著改善(P<0.05)。見表2,圖1。

表2 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型病理改變的影響(n=10)

圖1 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型病理改變的影響(HE染色)

2.3 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型血清免疫因子的影響 與正常對照組比較,模型對照組血清免疫因子GRO-α、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β、RANTES含量顯著增加(P<0.01);與模型對照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高劑量組血清免疫因子IP-10、MCP-3、MIP-1α、RANTES、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子含量顯著降低(P<0.05),復(fù)方芩蘭口服液中劑量組血清免疫因子MCP-3含量顯著降低(P<0.05)。見表3。

2.4 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響 與正常對照組比較,模型對照組肺組織免疫因子GRO-α、IP-10、MCP-1、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、RANTES含量顯著增加(P<0.01);與模型對照組比較,復(fù)方芩蘭口服液高劑量組肺組織免疫因子GRO-α、MCP-1、MCP-3、MIP-2、IP-10、MIP-1α、MIP-1β、RANTES含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),中劑量組肺組織免疫因子GRO-α、MCP-1、MCP-3、MIP-2含量顯著降低(P<0.05,P<0.01),低劑量組肺組織免疫因子GRO-α含量顯著降低(P<0.05)。見表4。

3 討論

副流感病毒是單股負(fù)鏈的RNA病毒,屬副粘病毒科。副流感病毒感染屬于直接細(xì)胞毒性引起的呼吸道炎癥反應(yīng),病毒在呼吸道上皮細(xì)胞引起宿主反應(yīng),被感染的細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)調(diào)集炎癥細(xì)胞至感染細(xì)胞處,從而導(dǎo)致疾病[7]。

表4 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響

續(xù)表4 復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒(仙臺株)感染小鼠模型肺組織免疫因子的影響

中藥治療副流感病毒感染方面有良好的作用[8-14]。為了評價復(fù)方芩蘭口服液在防治副流感病毒感染中的藥效作用,本課題組設(shè)計了相關(guān)藥效試驗。我們利用副流感病毒(仙臺株)感染ICR小鼠制備小鼠肺炎模型,采用此模型評價復(fù)方芩蘭口服液在防治副流感病毒感染中的作用。本研究中,模型組小鼠肺指數(shù)與正常對照組比較顯著升高,模型對照組小鼠肺組織及肺部支氣管與正常對照組比較病變顯著,模型對照組小鼠肺組織病毒核酸表達(dá)與正常對照組比較顯著增加;實驗中復(fù)方芩蘭口服液高劑量組肺指數(shù)與模型對照組比較顯著降低,高、中劑量組肺部支氣管病變與模型對照組比較顯著改善。病毒感染會使免疫因子表達(dá)發(fā)生變化,甚至引起免疫因子風(fēng)暴,中醫(yī)藥通過調(diào)節(jié)免疫因子表達(dá)防治病毒感染性疾病方面有其特有的優(yōu)勢[15-20]。本研究中,我們采用多因子檢測試劑盒高通量檢測小鼠血清及肺組織勻漿中的免疫因子含量,評價復(fù)方芩蘭口服液對免疫因子的影響。

綜上所述,本研究采用副流感病毒(仙臺株)感染ICR小鼠模型,評價了復(fù)方芩蘭口服液防治副流感病毒的作用,并且考察了其對肺組織及肺支氣管病理改變、血清及肺組織勻漿中免疫因子含量的影響。本研究結(jié)果提示,復(fù)方芩蘭口服液對副流感病毒感染有一定的治療作用,可以改善肺支氣管病變、降低血清及肺組織免疫因子含量。本研究結(jié)果為臨床用藥提供了實驗依據(jù)。