王 瑞 高 釗 張曉東 樊貝貝 孫夢(mèng)娜 王 偉 曾廣偉

(1 空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科,西安,710032; 2 西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心臟內(nèi)科,西安,710100)

心肌缺血指心臟的血液灌注降低,誘使心臟的供氧減少,心肌能量代謝異常,無(wú)法促進(jìn)心臟正常工作的一種病理狀態(tài)[1]。近年來(lái),隨著人民生活水平的提高,心肌缺血的患病率和發(fā)病率逐年升高,目前已成為中老年人的常見(jiàn)病和多發(fā)病。缺血性心臟病是造成人類死亡的關(guān)鍵誘因之一,心肌缺血再灌注(Myocardial Ischemia/Reperfusion,MI/R)損傷是一種常見(jiàn)的病理生理過(guò)程,但是發(fā)生發(fā)展機(jī)制繁雜,至今尚未完全研究清楚。目前,治療冠心病的主要方法為冠狀動(dòng)脈介入治療、溶栓治療等[2],但對(duì)于MI/R造成的組織損傷尚無(wú)有效的防治方法。因此,探討MI/R發(fā)病機(jī)制,研究治療的新途徑,對(duì)于MI/R的防治具有重要意義。炎癥反應(yīng)在心肌缺血再灌注損傷發(fā)病過(guò)程中具有重要作用,已有研究表明炎癥反應(yīng)是MI/R損傷的主要病理機(jī)制之一,在心肌缺血患者中炎癥反應(yīng)明顯升高[3-4]。白藜蘆醇(Resveratrol,Res)是一種多酚化合物,葡萄酒中含量較高。Res具有廣泛的藥理作用,包括抗癌、保護(hù)神經(jīng)元、抗衰老等作用[5]。有研究發(fā)現(xiàn)預(yù)處理Res對(duì)MI/R損傷大鼠的具有保護(hù)作用[6-7],但是具體的保護(hù)機(jī)制尚未完全研究清楚。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent Information Regulator 1,Sirt1)是一種抗衰老蛋白,幾乎在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中均有表達(dá),涉及細(xì)胞內(nèi)能量代謝、抗細(xì)胞凋亡、抗氧和抗炎等生物作用[8]。研究顯示，Sirt1可改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),還可減輕缺血再灌注所致腦組織損傷[9]。Res作為Sirtl的激活劑,研究發(fā)現(xiàn)Res的保護(hù)作用與激活Sirtl密切相關(guān)[10]。Res可通過(guò)激活Sirt1抑制核因子κB炎癥反應(yīng)通路,該研究提示Res可通過(guò)Sirt1/核因子κB通路減少炎癥介質(zhì)[11],但是Res是否可通過(guò)Sirt1/核因子κB通路改善心肌缺血損傷仍值得進(jìn)一步研究。眾所周知,線粒體是缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)損傷的重要靶點(diǎn)。心肌I/R損傷不僅導(dǎo)致線粒體能量產(chǎn)生障礙,而且還導(dǎo)致線粒體鈣超載、線粒體膜電位喪失、線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,進(jìn)而導(dǎo)致線粒體介導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[1]。研究表明,多種心臟保護(hù)劑(如維生素C和硫化氫)可以抑制再灌注期間線粒體鈣超載,從而減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的過(guò)度開(kāi)放,最終減少細(xì)胞凋亡[12]。然而,目前Res是否可通過(guò)Sirt1改善心肌缺氧缺血損傷誘導(dǎo)的線粒體功能障礙

因此本研究將對(duì)通過(guò)建立MI/R模型和心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型,進(jìn)一步探討Res改善心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取60只6～7周齡雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g。SD大鼠購(gòu)自空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)：SYXK(陜)2020-007。實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周,實(shí)驗(yàn)室環(huán)境控制室內(nèi)濕度40%～60%,溫度20～24 ℃,12 h光/暗循環(huán),不限制大鼠飲食。本研究通過(guò)空軍軍醫(yī)大學(xué)附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)倫理審核(倫理審批號(hào):TDLL-2018010-26)。

1.1.2 藥物 白藜蘆醇(上海寶曼生物科技有限公司,貨號(hào):D0041),

1.1.3 試劑與儀器 大鼠心臟來(lái)源的H9c2細(xì)胞(ATCC,美國(guó),貨號(hào):bio-54156),二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)(Sigma公司,美國(guó),貨號(hào):D2650),Sirt1抑制劑EX527(MCE公司,美國(guó),貨號(hào):HY-15452A),肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase MB,CK-MB)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):H197-1),乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A020-1-2),TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):H052-1),IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):H007),一抗Sirt1抗體(BioVision,美國(guó),貨號(hào):6137-100),一抗核因子κB抗體(Proteintech公司,美國(guó),貨號(hào):14220-1-AP),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(上海聯(lián)邁生物工程有限公司,貨號(hào):LM0208),四甲基偶氮唑鹽(Methyl Thiazolyl Tetrazolium,MTT)試劑盒(愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司,貨號(hào):abs42022059),Rhod-2 AM(愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司,貨號(hào):abs47045183)、鈣黃綠素乙酰氧基甲基酯(Calcein-acetoxymethylester，Calcein AM)(愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司,貨號(hào):abs42014734),CoCl2(上海雅吉生物科技有限公司,貨號(hào):YJ-34224R)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假手術(shù)組、心肌缺血再灌注模型組(MI/R組)、白藜蘆醇組(Res組)、Sirt1抑制劑EX527組(EX527組),每組15只。根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法采用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎法建立MI/R損傷大鼠模型。假手術(shù)組:大鼠開(kāi)胸但不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈。Res和EX527分別溶于5% DMSO,Res組:大鼠于缺血前15 min和再灌注前1 min經(jīng)尾靜脈注入Res(20 mg/kg);EX527組:大鼠給藥時(shí)間同Res組,經(jīng)尾靜脈注入Res(20 mg/kg)+EX527(1 μg/kg)。

1.2.2 心功能檢測(cè) 麻醉后將大鼠仰位固定,經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管入左心室,聯(lián)接心電圖,記錄左心室舒張末期壓(Left Ventricular End Dilated Pressure,LVEDP)、左心室收縮壓(left Venteicular Systolic Pressuer,LVSP)、左室內(nèi)壓力變化最大上升和下降速率(±dp/dt)。

1.2.3 CK-MB、LDH、炎癥介質(zhì)腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)水平檢測(cè) 再灌注2 h后,取腹主動(dòng)脈血5 mL,離心后取上清液,置于-80 ℃冰箱備用。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH和炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6水平。

1.2.4 心肌梗死面積測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,取大鼠心臟,去除多余組織和血水,濾紙吸干后稱重。切片,氮藍(lán)四唑溶液恒溫染色,梗死區(qū)心肌為淡紅色或不著色,正常心肌為暗紫色。梗死范圍=梗死區(qū)面積/左心室面積×100%。

1.2.5 心肌髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)活力 取實(shí)驗(yàn)大鼠部分心肌組織,去除多余組織、沖洗后勻漿,離心(-4 ℃,15 min)取上清液,采用比色法并測(cè)定吸光度(OD)值,計(jì)算MPO活力,具體相關(guān)步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定Sirt1和核因子κB蛋白表達(dá)水平 取大鼠心肌組織備用,吸干多余水分、血絲,去掉多余組織殘?jiān)?依次稱重。將H9c2細(xì)胞裂解。按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白定量測(cè)定并計(jì)算上樣體積,凍存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)前根據(jù)目的蛋白的分子量配置分離膠和濃縮膠,分別37 ℃烘箱孵育后,按照定量計(jì)算的上樣量進(jìn)行上樣并電泳,電泳后按照分子量切膠轉(zhuǎn)膜,封閉2 h,然后室溫孵育一抗Sirt1(1∶1 000)和核因子κB(1∶1 000)過(guò)夜。第2天洗滌3次,10 min/次,再室溫孵育二抗2 h,同樣洗滌3次后顯影成像,保存圖片后進(jìn)行灰度值掃描和統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)和缺氧/復(fù)處理 H9c2細(xì)胞用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，F(xiàn)BS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的低糖杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后更換培養(yǎng)基,用磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)沖洗1次,加入缺氧緩沖液:1.0 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2、139 mmol/L NaCl、4.7 mmol/L KCl、5 mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid,HEPES]、20 mmol/L乳酸鈉。在MIC-101細(xì)胞低氧培養(yǎng)箱(5% CO2和95% N2)中于37 ℃孵育16 h模擬缺氧損傷。最后,在常氧條件下,將H9c2細(xì)胞置于無(wú)胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)4 h,同時(shí)給予不同藥物處理。

1.2.8 細(xì)胞分組 H9c2細(xì)胞分為5組:1)對(duì)照組:在正?？諝鈼l件下培養(yǎng)16 h,然后用無(wú)血清DMEM代替培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。2)缺氧/復(fù)氧組:細(xì)胞缺氧培養(yǎng)16 h,再用無(wú)血清DMEM復(fù)氧培養(yǎng)4 h。3)Res組:細(xì)胞缺氧培養(yǎng)16 h,用無(wú)血清DMEM復(fù)氧培養(yǎng)時(shí)加入20 mmol/LRes處理4 h。4)EX527組:細(xì)胞缺氧培養(yǎng)16 h,用無(wú)血清DMEM復(fù)氧培養(yǎng)時(shí)加入1 μmol/L EX527處理4 h。

1.2.9 細(xì)胞活力檢測(cè) 細(xì)胞活力采用MTT法檢測(cè)。H9c2細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板中,以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種。缺氧/復(fù)氧損傷后,用MTT(5 mg/mL)孵育細(xì)胞。4 h后丟棄上清液,每孔加入二甲基亞砜200 mL。用Bio-RAD Model 680型酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度。

1.2.10 線粒體鈣離子濃度檢測(cè) 用Rhod-2 AM檢測(cè)線粒體鈣離子(Ca2+)濃度。細(xì)胞5×104個(gè)/mL的濃度培養(yǎng)在共聚焦培養(yǎng)皿中,與5 mmol/LRod-2 AM避光孵育20 min。用PBS洗滌后,分別在552 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和581 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下采集圖像。

1.2.11 線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度的測(cè)定 用Calcein AM和CoCl2測(cè)定線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度。細(xì)胞用1 mmol/L Calcein AM和1 mmol/L CoCl2避光孵育15 min,然后用PBS清洗兩次。分別在494 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和517 nm的發(fā)射波長(zhǎng)下用FV1000激光共聚焦掃描顯微鏡掃描圖像。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心功能的比較 與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠的LVSP、+dp/dtmm和-dp/dtmm均明顯降低,LVEDP升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠LVSP、+dp/dtmm和-dp/dtmm均明顯增加,LVEDP減少(P<0.01),但是Sirt1的抑制劑EX527可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)MI/R大鼠心肌血流量的改善作用(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠心功能的比較

2.2 心肌梗死面積的比較 與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠心肌梗死面積明顯升高(P<0.05);與MI/R組比較,Res組大鼠心肌梗死面積減少(P<0.01),但Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)MI/R大鼠心肌梗死面積的減少作用(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 白藜蘆醇對(duì)MI/R大鼠心肌梗死面積的影響

2.3 各組大鼠Sirt1、核因子κB蛋白表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠核因子κB表達(dá)水平均明顯升高,Sirt1水平降低(P<0.05);與MI/R組比較,Res組大鼠核因子κB表達(dá)水平均明顯降低,Sirt1水平升高(P<0.05);但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)MI/R大鼠Sirt1/核因子κB通路的改善作用(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠Sirt1、核因子κB蛋白表達(dá)水平比較

2.4 各組大鼠肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶比較 與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠心肌損傷標(biāo)志物CK-MB和LDH均明顯升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠CK-MB和LDH均明顯降低(P<0.05),但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)MI/R大鼠心肌損傷標(biāo)志物的改善作用(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠肌酸激酶同工酶和乳酸脫氫酶比較

2.5 各組大鼠炎癥介質(zhì)比較 與假手術(shù)組比較,MI/R組大鼠血清炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6的水平均明顯升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠TNF-α和IL-6的水平明顯下降(P<0.05),但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)MI/R大鼠炎癥反應(yīng)的改善作用(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠炎癥介質(zhì)比較

2.6 各組大鼠髓過(guò)氧化物酶活力比較 與假手術(shù)組比較,M/IR組大鼠MPO活力均明顯升高(P<0.05)。與MI/R組比較,Res組大鼠MPO活力明顯下降(P<0.05),但是Sirt1的抑制劑EX527組可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)MI/R大鼠MPO活力的改善作用(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠髓過(guò)氧化物酶活力比較

2.7 組H9c2細(xì)胞Sirt1蛋白表達(dá)和細(xì)胞活力比較 與對(duì)照組比較,缺氧/復(fù)氧組H9c2細(xì)胞的Sirt1蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。與缺氧/復(fù)氧組比較,Res組H9c2細(xì)胞的Sirt1蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細(xì)胞的Sirt1蛋白表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)。與對(duì)照組比較,缺氧/復(fù)氧組H9c2細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)。與缺氧/復(fù)氧組比較,Res組H9c2細(xì)胞的活力明顯升高(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細(xì)胞的活力明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 各組H9c2細(xì)胞Sirt1蛋白表達(dá)和細(xì)胞活力比較

2.8 各組H9c2細(xì)胞線粒體Ca2+水平比較 與對(duì)照組比較,缺氧/復(fù)氧組H9c2細(xì)胞的線粒體Rhod-2相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)。與缺氧/復(fù)氧組比較,Res組H9c2細(xì)胞的線粒體Rhod-2相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯下降(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細(xì)胞的線粒體Rhod-2相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

圖5 各組H9c2細(xì)胞線粒體Ca2+水平比較

2.9 各組H9c2細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度比較 與對(duì)照組比較,缺氧/復(fù)氧組H9c2細(xì)胞的Calcein相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯下降(P<0.05)。與缺氧/復(fù)氧組比較,Res組H9c2細(xì)胞的Calcein相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)。與Res組比較,EX527組H9c2細(xì)胞的Calcein相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯下降(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 各組H9c2細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放程度比較

3 討論

心肌缺血系指各種原因引起的冠狀動(dòng)脈血流量減少,心肌氧等物質(zhì)供應(yīng)不足以及代謝產(chǎn)物清除遇到障礙的臨床癥狀,主要表現(xiàn)為心律失常、微血管阻塞、心肌細(xì)胞凋亡等[14]。隨著人們生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的變化,心肌缺血發(fā)病率和致病率逐年升高。MI/R指心肌組織血流供應(yīng)被中斷一段時(shí)間后恢復(fù)正常灌注時(shí),造成心肌功能異常和組織損傷的病理過(guò)程[15]。

臨床發(fā)現(xiàn),心肌缺血一段時(shí)間再灌注后,發(fā)生炎癥反應(yīng)、細(xì)胞能量代謝異常等癥狀[16]。研究表明,MI/R早期造成的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致心肌組織繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素,繼而刺激機(jī)體產(chǎn)生一系列的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)[17]。CK-MB為心肌細(xì)胞內(nèi)特征性的同工酶,主要存在于心肌組織,可反映心肌細(xì)胞損傷程度[18]。LDH廣泛分布心肌組織,是判斷心肌疾病發(fā)展的常用指標(biāo)[19]。本研究結(jié)果同樣顯示MI/R大鼠心功能發(fā)生損傷、心肌梗死面積和心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、LDH水平均明顯高于假手術(shù)組。

白藜蘆醇(Res)是一種多酚類化學(xué)物質(zhì),主要存在于紅酒和葡萄中,具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗炎等作用。Res可有效改善MI/R損傷的心肌梗死面積和凋亡水平[20]。有研究發(fā)現(xiàn),Res可通過(guò)調(diào)控血管生成、抗炎、抗氧化等發(fā)揮保護(hù)心肌的作用[21]。本研究結(jié)果同樣顯示,MI/R大鼠經(jīng)Res治療后可明顯改善大鼠的心功能發(fā)生損傷、心肌梗死面積、MPO活力和炎癥反應(yīng)。

Res是Sirtl激活劑,Res可通過(guò)激活Sirt1發(fā)揮抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)Sirtl在MI/R損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用[22]。核因子κB是炎癥反應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)因子,可間接促進(jìn)炎癥反應(yīng)[23]。在腦缺血后Sirt1可通過(guò)抑制核因子κB發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[24-25]。本研究結(jié)果同樣顯示,Res可明顯升高Sirt1的蛋白表達(dá)水平,而降低核因子κB表達(dá)水平。Sirt1的抑制劑EX527可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)MI/R大鼠心功能、心肌梗死面積、炎癥反應(yīng)和MPO活力的改善作用,且升高核因子κB表達(dá)水平。

多種心臟保護(hù)劑(如維生素C和硫化氫)可以抑制再灌注期間線粒體鈣超載,從而減少線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的過(guò)度開(kāi)放,最終減少細(xì)胞凋亡[26]。線粒體鈣超載是心肌I/R損傷的重要因素。鈣離子水平的變化是線粒體功能的指標(biāo)[27]。研究表明,線粒體鈣超載導(dǎo)致線粒體去極化改變,最終導(dǎo)致ATP消耗和細(xì)胞死亡。本研究用Rhod-2 AM標(biāo)記心肌線粒體,觀察Res對(duì)線粒體鈣離子變化的影響。結(jié)果顯示,Res組的Rhod-2熒光強(qiáng)度明顯低于缺氧/復(fù)氧組,提示Res能抑制I/R損傷所致的心肌細(xì)胞線粒體鈣超載。

高線粒體鈣離子水平可以觸發(fā)許多反應(yīng),如線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放,最終導(dǎo)致線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔是線粒體內(nèi)膜和線粒體外膜之間的通道。在生理?xiàng)l件下,線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔被周期性地打開(kāi)。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放是I/R損傷的主要機(jī)制[28]。本研究采用Calcein和CoCl2染色顯示線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開(kāi)放。當(dāng)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔被周期性打開(kāi)時(shí),Calcein進(jìn)入線粒體,并在與線粒體內(nèi)膜上的NAD+結(jié)合時(shí)發(fā)出綠色熒光。如果線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過(guò)度開(kāi)放,NAD+就會(huì)從孔中滲出,與細(xì)胞質(zhì)Calcein結(jié)合產(chǎn)生的綠色熒光會(huì)被CoCl2猝滅,線粒體熒光強(qiáng)度會(huì)變暗,間接反映線粒體內(nèi)膜的通透性。本研究結(jié)果顯示,Res組的綠色熒光強(qiáng)度明顯高于缺氧/復(fù)氧組,表明Res對(duì)缺血再灌注損傷引起的線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過(guò)度開(kāi)放有明顯的抑制作用。

最近有報(bào)道稱,Sirt1也存在于線粒體內(nèi),并且與線粒體DNA密切相關(guān)。它與線粒體轉(zhuǎn)錄因子A相互作用,調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生[29]。此外,低氧條件下的線粒體延伸是通過(guò)Sirt1介導(dǎo)的線粒體融合蛋白1去乙?；瘉?lái)調(diào)節(jié)的[30]。在本研究中,缺氧/復(fù)氧處理降低了心肌細(xì)胞中的Sirt1表達(dá),而Res可上調(diào)Sirt1的表達(dá)。此外,Sirt1的抑制劑EX527可逆轉(zhuǎn)Res對(duì)I/R損傷所致的線粒體鈣超載和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過(guò)度開(kāi)放的影響。上述結(jié)果提示,Res對(duì)I/R處理的心肌細(xì)胞線粒體功能的改善作用也是部分通過(guò)調(diào)節(jié)Sirt1實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述,本研究結(jié)果表明Res可通過(guò)激活Sirt1在一定程度上抑制核因子κB通路,降低炎癥介質(zhì)水平,改善MI/R大鼠心功能、心肌梗死面積和MPO活力。Res能抑制I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞線粒體鈣超載和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔過(guò)度開(kāi)放。由此可見(jiàn),Res具有較好地保護(hù)心肌缺血再灌注損傷的作用,其機(jī)制可能與Sirt1信號(hào)通路。