譚桂蘭 彭婧嬪 劉國維 鐘李璐 袁 敏

(深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院中醫(yī)科,深圳,518000)

心肌纖維化(Myocardial Fibrosis,MF)是全因死亡及心源性猝死發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,也是冠心病、心肌梗死、心力衰竭等多種心血管疾病發(fā)展到終末期的共同病理改變[1-2]。心肌成纖維細(xì)胞(Cardiac Fibroblasts,CFs)是MF的主要效應(yīng)細(xì)胞,抑制CFs的增殖并減少膠原的沉積是預(yù)防和逆轉(zhuǎn)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix,ECM)重構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)作為降解ECM成分的重要酶系[4],其基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1,TIMP-1)可抑制MMPs的活性,是其特異性抑制劑[19]。二者比例失衡可使ECM代謝紊亂,促進(jìn)心肌纖維化進(jìn)程[5]。大量研究證實(shí),芪參顆粒可改善MF[6-7],但其在細(xì)胞外基質(zhì)代謝方面的作用機(jī)制尚不明確?；诖?本研究以大鼠原代CFs為研究對象,觀察芪參顆粒對血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ,AngⅡ)作用下CFs基質(zhì)代謝的影響,同時(shí)分析其抗MF的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取30只健康3周齡無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠,飼養(yǎng)于SPF級動(dòng)物房,飼養(yǎng)溫度保持在(25±2)℃,相對濕度保持在(40±2)%,12 h光照,12 h黑暗,自由給食水,總共進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,選購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號:SCXK(京)2016-0006。本研究經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號:L201601009)。

1.1.2 藥物 芪參顆粒(北京同仁堂制藥有限公司,生產(chǎn)批號:040910)由黃芪30 g、玄參10 g、丹參15 g、黑順片9 g、金銀花10 g、炙甘草6 g等中藥組成。

1.1.3 試劑與儀器 胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)-(Gibco公司,美國,貨號:16140-089),波形蛋白(Vimentin)抗體(Santa Cruz公司,美國,貨號:sc-5565),α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(Smooth Muscle Actin,α-SMA)抗體(Abcam公司,美國,貨號:ab124964),AngⅡ(sigma公司,美國,貨號:A9525),Trizol核酸提取液(Ambion公司,美國,貨號:RK30129),SYBR Select Master Mix(美國Thermo公司,貨號:CFX 2X5ML)。超凈工作臺(蘇州凈化,型號:Sff-CJ-lFD),二氧化碳培養(yǎng)箱(德國Heraeus,型號:BB16UV/BB5060UV),實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied-Biosystem公司,美國,型號:ABI Prism 7500),紫外分光光度計(jì)(Pharmacia Biotech公司,美國,型號:UV-2000),光學(xué)顯微鏡(Olympus公司,日本,型號:BB16UV/BB5060UV CKX31)。

1.2 方法

1.2.1 CFs的培養(yǎng)和鑒定 在無菌條件下取出SD大鼠心室,用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)沖洗,切成糊狀,用0.25%胰蛋白酶消化液反復(fù)消化(37 ℃恒溫振蕩10～15 min),至組織塊消失,消化后收集上清液,加入杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle Medium，DMEM)(含20%血清)混勻后離心,取沉淀用后DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)混勻制成單細(xì)胞懸液。接種在培養(yǎng)瓶中,然后在孵育箱中培養(yǎng)。差速貼壁法分離心肌細(xì)胞,待CFs生長接近融合時(shí)獲得CFs,用胰蛋白酶消化傳代。實(shí)驗(yàn)用3～4代CFs,鏡下觀察CFs形態(tài),采用免疫法鑒定CFs。

1.2.2 分組與干預(yù)方法 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至5×104個(gè)細(xì)胞/mL,每孔200 μL接種于96孔培養(yǎng)板上。細(xì)胞生長至70%～60%后,更換無血清DMEM同步化24 h。將細(xì)胞分為5組:空白對照加入2% FBS-DMEM、二甲基亞砜(Dimethyl Sulfoxide，DMSO)對照組加入0.1% DMSO、AngⅡ組加入10-7mol/L AngⅡ、卡托普利組加入10-7mol/L AngⅡ+22 mg/L卡托普利,芪參顆粒組加入10-7mol/L AngⅡ+1 mg/mL芪參顆粒,處理48 h。進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活力 按照說明書操作,每孔加入CCK-8溶液10 μL孵育2 h,于酶標(biāo)儀450 nm處測定光密度(Optical Density,OD)值。

1.2.4 Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ,Col Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(CollagenⅢ,Col Ⅲ)、基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metallopeptidase MMP)-2、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases,TIMP)-1和TIMP-2含量的檢測 取上清按試劑盒說明書操作,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測,于酶標(biāo)儀450 nm處測定每個(gè)孔的OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度。

1.2.5 Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的表達(dá) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測Col Ⅰ和Col Ⅲ mRNA的表達(dá),用Trizol提取細(xì)胞總RNA,采用酶標(biāo)儀對RNA的純度和濃度進(jìn)行測定。再根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書對提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)。以cDNA為模板,以GAPDH為內(nèi)參。引物序列為GAPDH,上游:5′-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3′,下游:5′-TACTCAGCACCAGCATCACC-3′;Col Ⅰ,上游:5′-TGACCAGCCTCGCTCACAG-3′,下游:5′-ATCCAGTAGTAATCGCTCTTCCA-3′;Col Ⅲ,上游:5′-CGGAGGAATGGGTGGCTATC-3′,下游:5′-CAGTCCACGCTCTCCAGGTC-3′。PCR工作條件:預(yù)變性95 ℃,10 min,變性95 ℃,30 s,退火55 ℃,30 s,延伸72 ℃,20 s,循環(huán)40個(gè)。所得CT值按照2-△△Ct的方法均一化后行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 CFs的鑒定 CFs細(xì)胞鏡下狀態(tài)較好,生長迅速,達(dá)融合狀態(tài)僅需要1～2 d,大部分呈梭形或三角形,無自發(fā)性搏動(dòng)。免疫染色顯示細(xì)胞波形蛋白染色陽性,α-SMA染色陰性,表明細(xì)胞純度>95%。

2.2 各組CFs增殖比較 各組OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),空白對照組與DMSO對照組OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與空白對照組比較,AngⅡ組CFs OD值明顯升高(P<0.01);與AngⅡ組比較,卡托普利組與芪參顆粒組CFs OD值明顯降低(P<0.01);與卡托普利組比較,芪參顆粒組CFs OD值明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組Fs增殖比較

2.2 各組CFs Col Ⅰ、Col Ⅲ含量比較 AngⅡ組較空白對照組Col Ⅰ、Col Ⅲ含量明顯增加(P<0.01);與AngⅡ比較,卡托普利組和芪參顆粒組Col Ⅰ、Col Ⅲ含量減少(P<0.01或P<0.05);與卡托普利組比較,芪參顆粒組Col Ⅰ、Col Ⅲ含量有減少趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組Col Ⅰ、Col Ⅲ含量比較

2.3 各組CFs Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表達(dá)比較 AngⅡ組較空白對照組Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.01);與AngⅡ比較,卡托普利組和芪參顆粒組Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05);與卡托普利組比較,芪參顆粒組Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表達(dá)有下降趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組Col Ⅰ、Col Ⅲ mRNA表達(dá)比較

2.4 各組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2比較 AngⅡ組較空白對照組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2含量均明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1有下降趨勢;與AngⅡ比較,卡托普利組與芪參顆粒組細(xì)胞培養(yǎng)上清中的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01),MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1有降低趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與卡托普利組比較,芪參顆粒組MMP-2、MMP-9表達(dá)明顯下降(P<0.05),TIMP-1、TIMP-2、MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1有降低趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2比較

3 討論

芪參顆?；米越?jīng)典名方真武湯及四妙勇安湯,由黃芪、丹參、玄參、金銀花、附子、炙甘草組成[8]。功效為活血解毒、溫陽益氣。研究證實(shí),芪參顆粒可以改善心功能并逆轉(zhuǎn)心肌梗死后的心室重構(gòu)[9],但其作用的具體分子機(jī)制尚待完善,本研究在細(xì)胞水平進(jìn)一步從基質(zhì)代謝角度探討了芪參顆?？筂F的分子機(jī)制。

細(xì)胞外基質(zhì)主要由Col Ⅰ、Col Ⅲ組成,其合成增多或降解減少均會(huì)導(dǎo)致MF的發(fā)生[10]。Col Ⅰ主要是粗纖維,約占心肌膠原的80%,以其強(qiáng)大的僵硬度和抗?fàn)坷?確保了室壁的強(qiáng)度;Col Ⅲ為細(xì)網(wǎng)狀,膠原約占15%,以其較強(qiáng)的伸展性和彈性,保證了室壁的順應(yīng)性[11]。Col Ⅰ和Col Ⅲ的比例決定了心肌僵硬度,與舒張功能不全密切相關(guān)。CFs大量地散布于膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中,是Col Ⅰ、Col Ⅲ的主要分泌細(xì)胞。它在病理因素刺激下,過度增殖并大量分泌Col Ⅰ、Col Ⅲ,可增加心肌僵硬度,加重纖維化[12]。AngⅡ主要通過與AngⅠ受體結(jié)合,促發(fā)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和心臟間質(zhì)纖維化[13],故實(shí)驗(yàn)采用AngⅡ刺激CFs建立MF細(xì)胞模型。結(jié)果顯示,AngⅡ組Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量和mRNA的表達(dá)上調(diào),卡托普利組的Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量和mRNA的表達(dá)與AngⅡ比較均出現(xiàn)明顯的下調(diào),而芪參顆粒組的Col Ⅰ、Col Ⅲ的含量和mRNA的表達(dá)與AngⅡ和卡托普利組比較均出現(xiàn)明顯的下調(diào),提示芪參顆?？梢酝ㄟ^下調(diào)心肌膠原蛋白的含量,減輕MF的程度,并且效果優(yōu)于卡托普利。

MMPs是一種鋅離子依賴性蛋白水解酶家族,它不僅能有效降解ECM成分的,還能對膠原蛋白的合成有一定調(diào)節(jié)作用[13]。心肌損傷后,受損細(xì)胞釋放出趨化因子、生長因子等引發(fā)免疫反應(yīng),而后心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞在此刺激下大量釋放有活性的MMPs[14]。MMPs可以直接降解某一種或幾種ECM，也可以通過激活其他類型的MMPs形成瀑布效應(yīng),進(jìn)一步加強(qiáng)降解作用[15]。此外,MMPs還能調(diào)節(jié)膠原蛋白的合成,其表達(dá)及活性增高可促使ECM大量降解,使正常的膠原網(wǎng)絡(luò)降解并被缺乏連接結(jié)構(gòu)的纖維間質(zhì)所取代,導(dǎo)致正常間質(zhì)結(jié)構(gòu)消失,心肌細(xì)胞排列紊亂,促進(jìn)纖維化發(fā)展[16-17]。其中,MMP-2和MMP-9屬于明膠酶類,是纖維化早期ECM的主要分解酶[18]。

TIMPs是MMPs的特異性抑制劑,通過其N端功能區(qū)的半胱氨酸殘基與MMPs鋅離子活性中心結(jié)合形成復(fù)合物,從而影響MMPs酶原的活化;或通過阻斷MMPs與底物結(jié)合,而抑制MMPs的活性[19]。TIMPs與MMPs共同參與調(diào)節(jié)ECM的代謝,二者比例失衡可導(dǎo)致心肌纖維化[20]。本研究發(fā)現(xiàn),AngⅡ組MMP-2、MMP9、TIMP-1、TIMP-2表達(dá)明顯上調(diào),MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值有升高趨勢,提示MMP-2、MMP-9表達(dá)相對增加,細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂,AngⅡ促進(jìn)了纖維化的發(fā)展?？ㄍ衅绽MMMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達(dá)及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值下調(diào),芪參顆粒組上述指標(biāo)較卡托普利組進(jìn)一步下調(diào),提示芪參顆粒可能通過降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1來調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)代謝,具有改善MF的作用,且效果優(yōu)于卡托普利。

綜上所述,本研究在細(xì)胞學(xué)水平證實(shí)了芪參顆粒可能通過調(diào)控MMPs和TIMPs以及二者比例平衡從而調(diào)控基質(zhì)代謝,減少Col Ⅰ、Col Ⅲ的沉積,達(dá)到改善MF的作用,并且證實(shí)芪參顆粒對MF的治療效果優(yōu)于西藥卡托普利。MF的作用機(jī)制復(fù)雜,今后我們將繼續(xù)對芪參顆粒抗MF的分子機(jī)制作進(jìn)一步的探索。