肖雯婧 ,侯 君 ,張?jiān)冁?,王婷婷 ,呼永河,

(1.西南交通大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,四川成都 610031;2.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科,四川成都 610083;3.西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院,四川成都 610031)

糖尿病已成為影響中國(guó)人健康的主要慢性病之一[1],糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是一種獨(dú)立于高血壓、冠心病及其他已知心臟疾病,由糖代謝紊亂引起的嚴(yán)重心臟并發(fā)癥[2]。DCM 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,其中體內(nèi)高糖環(huán)境可導(dǎo)致心細(xì)胞活性氧(reactive oxygen,ROS)增多,促進(jìn)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)過(guò)度激活,這可能是其重要發(fā)病原因之一[3]。NLRP3激活是細(xì)胞焦亡起始因素,既往研究顯示,沉默NLRP3可有效抑制細(xì)胞焦亡,改善DCM癥狀,保護(hù)心功能[4-5]。然而,心臟組織致密,如何將基因藥物有效遞送至心臟是研究靶向NLRP3治療DCM 臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值的關(guān)鍵突破點(diǎn)。與傳統(tǒng)病毒載體相比,超聲靶向微泡爆破技術(shù)(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)作為體外刺激,可遠(yuǎn)程調(diào)控基因物質(zhì)定點(diǎn)釋放,因其安全、無(wú)創(chuàng)、低成本等優(yōu)勢(shì)備受關(guān)注。超聲成像是一種成熟的心血管疾病臨床診斷法,而通過(guò)UTMD 介導(dǎo)超聲響應(yīng)微泡向心臟靶向遞送基因藥物是一種有前景的心血管疾病治療新手段[6]。但傳統(tǒng)UTMD 多使用微泡(microbubbles,MBs)作為基因載體,受限于微米級(jí)尺寸,即使在具有高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect,EPR 效應(yīng))的腫瘤組織,MBs仍然很難穿過(guò)血管內(nèi)皮間隙進(jìn)入腫瘤內(nèi)部,從而有效遞送藥物[7]。心臟組織間隙比腫瘤更加致密,其生理屏障嚴(yán)重阻礙MBs介導(dǎo)的藥物遞送,因此,研究具有更強(qiáng)組織穿透能力的超聲響應(yīng)納米載體系統(tǒng)對(duì)促進(jìn)心臟基因治療臨床轉(zhuǎn)化具有重要價(jià)值。本研究首先合成一種生物安全性好的嵌段共聚物與siNLRP3形成膠束,增加載體對(duì)基因藥物的裝載量,隨后將膠束與氣芯脂質(zhì)體異組裝形成超聲響應(yīng)納米載體系統(tǒng),增強(qiáng)其穿透能力,研究其對(duì)DCM 的治療作用。

1 材料與方法

1.1 材料

甲氧基-聚乙二醇-氨基(m PEG2000-NH2)、N-ε-芐氧羰基賴氨酸酸酐(CBLLys-NCA)、二棕櫚酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)及二硬脂?；字Ｒ掖及?DSPE)均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司;siNLRP3(NLRP3 小干擾RNA)由北京擎科生物科技有限公司合成;鏈脲佐菌素、HE 試劑盒、Masson試劑盒購(gòu)于成都湖畔科技有限公司;雄性SPF級(jí)SD 大鼠、普通飼料、高脂飼料購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,動(dòng)物準(zhǔn)字為SCXK(川)2020-030,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案參照中國(guó)動(dòng)物福利法案設(shè)計(jì),申請(qǐng)后經(jīng)中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)后進(jìn)行;抗NLRP3抗體(Cat#MA5-32255,1∶600稀釋)、抗caspase-1-p20抗體(Cat#PA5-99390,1∶600稀釋)、抗IL-1β抗體(Cat#PA5-46956,1∶200稀釋)購(gòu)于Santa Cruz公司,抗GSDMD-N 抗體(Cat#A20728,1∶600稀釋)購(gòu)于愛(ài)博泰克生物公司,合成mPEG-b-PLLys并制備siNLRP3膠束。

參照文獻(xiàn)[8]以端氨基聚乙二醇(m PEG)作為大分子引發(fā)劑,采用開(kāi)環(huán)聚合方式合成mPEG-b-PLLs。合成路線(圖1A)如下:Schlenk 瓶中加入mPEGn-NH2(Mn=2 000 Da)與CBLLys-NCA 單體(摩爾比為1∶55),加入無(wú)水二甲基亞砜20 m L,35℃氮?dú)獗Ｗo(hù)反應(yīng)72 h。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物沉淀到大量冷乙醚中,抽濾,不溶物減壓干燥,即得白色共聚物mPEG-b-PCBLLys。mPEG-b-PCBLLys 溶解于0℃的三氟乙酸,隨后加入33%溴化氫醋酸溶液。室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2 h,加入過(guò)量乙醚,用乙醚反復(fù)洗滌5次。低速離心去掉過(guò)量溶劑,減壓干燥獲得mPEG-b-PLLs。共聚物采用1H NMR(Bruker AM 300,德國(guó)BRUKER 公司)表征產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確定芐基完全脫離并使用凝膠滲透色譜(Waters 2695,美國(guó)WATERS公司)檢測(cè)分子量。隨后按N/P比1∶4采用自組裝方式制備siNLRP3-mPEG-b-PLLys膠束。

1.2 方法

1.2.1 制備負(fù)載siNLRP3的納米載體系統(tǒng) 首先采用薄膜水化超聲法制備超聲響應(yīng)納米微泡:精密稱取處方量DPPE∶DPPC∶DSPE(摩爾比1∶1∶0.1)置于茄形瓶中,加入氯仿使其完全溶解形成澄清透明溶液,使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-200,瑞士BUCHI公司),37℃水浴真空蒸發(fā)磷脂溶液得脂質(zhì)體膜,然后放入真空干燥箱,25℃常溫真空干燥除去殘留有機(jī)溶劑。干燥12 h 后取出茄形瓶加入水化介質(zhì)(含體積比10%甘油以及2 mg/m L 泊洛沙姆F-68),50℃水化脂質(zhì)體膜60 min,震蕩形成囊泡。將囊泡懸浮液轉(zhuǎn)移至50 m L 無(wú)核酶離心管中,用50 m L 帶細(xì)長(zhǎng)針的注射器將液體上方的空氣替換為C3F8氣體,然后將該囊泡溶液于55℃水浴超聲(200 W,5 min)形成粒度較為均勻的氣芯脂質(zhì)體。氣芯脂質(zhì)體與siNLRP3膠束按照siRNA 含磷量/氣芯脂質(zhì)體磷量比1∶6混合,25℃孵育30 min,形成siNLRP3異組裝納米體系(siNLRP3-NBs)。使用動(dòng)態(tài)光散射法(dynamic light scattering method,DLS,NanoZS90,英國(guó)馬爾文公司)檢測(cè)siNLRP3-NBs粒度及Zeta電位。

1.2.2 檢測(cè)NBs對(duì)siNLRP3 的保護(hù)作用 使用RNase ONE(TM)Ribonuclease檢測(cè)NBs保護(hù)siNLRP3不被RNA 酶降解的作用。按siRNA 量計(jì)算,分別取0.5μg siNLRP3或0.5μg siNLRP3與NBs混合加入1.5 mL無(wú)核酸酶的EP管中,加入含0.1 unit核糖核酸酶的反應(yīng)緩沖液(含10 mmol/L p H 7.5的Tris-HCl緩沖液,5 mmol/L EDTA 和0.2 M 乙酸鈉)。另取0.5μg未進(jìn)行酶解siNLRP3作為對(duì)照組,37℃孵育60 min后加入10μg肝素繼續(xù)室溫孵育60 min,然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳觀察NBs對(duì)siNLRP3的保護(hù)作用。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型 SD大鼠[(200±20)g,雄性]隨機(jī)分為4組:對(duì)照組(CON)、糖尿病心肌病組(DCM)、糖尿病心肌病siNLRP3-NBs治療組(US-)、糖尿病心肌病siNLRP3-NBs聯(lián)合UTMD 治療組(US+)。除CON組外,其余組大鼠使用高脂飼料喂養(yǎng)(含16%脂肪,0.25%膽固醇)進(jìn)行喂養(yǎng),4周后按35 mg/kg腹腔注射鏈脲霉素(streptozotocin,STZ)。STZ注射1周后檢測(cè)大鼠空腹血糖,空腹血糖≥16.7 mol/L確定造模成功,每組8只隨機(jī)分入DCM 組或治療組。

1.2.4 藥物及超聲輻照處理 喂養(yǎng)8周后,DCM 組尾靜脈注射治療組等體積生理鹽水。US-組按200μg/kg每3 d經(jīng)尾靜脈注射siNLRP-NBs。US+組麻醉后呈仰臥位置于37℃加熱墊上,注射US-組等劑量siNLRP-NBs后胸部備皮行心臟超聲(Acuson Sequoia 512C 彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng),德國(guó)Siemens公司),探頭置于心前區(qū)取左心室乳頭肌短軸觀(深度約4.0 cm),經(jīng)尾靜脈注射藥物,心肌內(nèi)觀察到納泡后超聲調(diào)節(jié)至微泡爆破模式以擊破微泡(MI=1.9),超聲爆破至納泡完全消失。療程共4周,每周定時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠體質(zhì)量及空腹血糖。

1.2.5 大鼠超聲心功能檢查 療程結(jié)束后檢測(cè)各組大鼠心功能變化程度。使用100 g/L 水合氯醛麻醉大鼠后取超聲心動(dòng)圖像,并取心功能參數(shù),參數(shù)包括左室短軸縮短率(LVFS)、左室收縮末期壓力(LVESP)、左室舒張末期壓力(LVEDP)。

1.2.6 檢測(cè)心肌纖維化程度 療程結(jié)束后處死大鼠,取左心室進(jìn)行石蠟包埋。切片后按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Masson染色及HE 染色并計(jì)算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)。

1.2.7 檢測(cè)心肌NLRP3 相關(guān)蛋白表達(dá) 使用Western blotting法檢測(cè)NLRP3蛋白表達(dá)量及焦亡相關(guān)指標(biāo)caspase-1、IL-1β、GSDMD-N 在心肌組織中表達(dá)改變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS v18.0(SPSS,Chicago,IL,USA)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布,兩組數(shù)據(jù)選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)使用單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mPEG-b-PLLys及siNLRP3-NBs表征

圖1B 為mPEG-b-PLLys的1H NMR 圖譜,化合物中特征氫質(zhì)子吸收峰均有所標(biāo)示,圖譜中未見(jiàn)芐基氫相關(guān)位移,提示mPEG-b-PCBLLys芐基完全脫去轉(zhuǎn)化為mPEG-b-PLLys。表1為通過(guò)1H NMR 及GPC測(cè)量得到的共聚物分子量,結(jié)果表明,該共聚物具有較好的分子量和較窄的多分散性。圖1C為siNLRP3與核酸酶共孵育后電泳圖,siNLRP3異組裝入NBs后可有效避免被核酸酶降解,泳道內(nèi)未發(fā)現(xiàn)裸siNLRP3,而siNLRP3-NBs泳道內(nèi)可觀察到明顯條帶,提示其結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變,納米體系可有效保護(hù)siNLRP3核酸酶環(huán)境下的結(jié)構(gòu)完整性。圖1D 為siNLRP3 膠束及siNLRP3-NBs透射電鏡圖,粒度與DLS結(jié)果基本一致,siNLRP3-NBs中觀察到NBs表面隱約可見(jiàn)磷脂膜,囊泡內(nèi)顆?？赡転閟iNLRP3膠束。表2為siNLRP3膠束及siNLRP3-NBs的粒度與Zeta電位。

圖1 共聚物及NBs表征圖Fig.1 Characterization of copolymer and NBs

表1 共聚物分子量Tab.1 Molecular characteristics of the synthesized block copolymers

表2 膠束及NBs粒徑及Zeta電位分布Tab.2 Mean diameter and zeta potential of micelle and NBs

2.2 UTMD增強(qiáng)siNLRP3對(duì)DCM 大鼠心功能的改善作用

超聲心動(dòng)圖結(jié)果(圖2)顯示,與CON 組相比,DCM 組大鼠LVFS與LVESP明顯下降[(LVFS:(52.8±2.3)%vs.(32.0±1.9)%,P<0.05;LVESP:(98.3±7.4)mm Hgvs.(58.4±3.2)mm Hg,P<0.05)],LVEDP明顯上升[(2.93±0.41)mmHgvs.(4.12±0.62)mmHg,P<0.05)],提示大鼠左心室腔增大且室壁變薄[9]。沉默NLRP3治療后,心功能均有所恢復(fù)。siNLRP3-NBs暴露于超聲輻照下治療效果明顯提高[(US-vs.US+:LVFS(35.3±1.6)%vs.(47.9±2.0)%,P<0.05;LVESP(64.2±2.9)mm Hgvs.(78.9±3.5)mm Hg,P<0.05;LVEDP(3.86±0.81)mm Hgvs.(3.21±0.38)mm Hg,P<0.05]。

圖2 siNLRP3-NBs治療后DCM 大鼠心功能變化Fig.2 Cardiac function changes in DCM rats after treatment with siNLRP3-NBS

2.3 UTMD增強(qiáng)siNLRP3對(duì)DCM 大鼠心肌纖維化及細(xì)胞焦亡的治療作用

血糖及體質(zhì)量結(jié)果顯示,siNLRP3治療后各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,推測(cè)可能為定點(diǎn)心臟爆破siNLRP3-NBs,未作用于其他器官發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。圖3A 為心臟HE染色及Masson 染色結(jié)果。HE 染色結(jié)果顯示,DCM 組出現(xiàn)明顯心肌結(jié)構(gòu)損傷,治療后結(jié)構(gòu)恢復(fù)程度明顯,US-與US+相比結(jié)構(gòu)損傷程度相對(duì)較高。對(duì)Masson染色進(jìn)行CVF分析數(shù)據(jù)顯示,與HE染色結(jié)果一致,siNLRP3-NBs聯(lián)合UTMD治療后心肌纖維化程度明顯下降[US-vs.US+:CVF值(21.2±3.6)%vs.(14.0±1.8)%,P<0.05]。Western blotting結(jié)果顯示(圖3B,圖3C),UTMD 可促進(jìn)NBs介導(dǎo)的NLRP3沉默,NLRP3在US+組表達(dá)最低,與NLRP3蛋白變化一致;與CON 組相比,焦亡標(biāo)志物GSDMDN、IL-β及caspase-1表達(dá)升高,灰度值分析結(jié)果顯示,siNLRP3聯(lián)合UTMD治療后標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯下降,提示US+組抑制焦亡能力最為顯著。圖3D 為心臟超聲造影圖,可觀察到大鼠心臟內(nèi)充盈NBs,UTMD爆破后可大量釋放藥物。

圖3 心肌病理及焦亡水平改變Fig.3 Myocardial pathology and pyroptosis changes

3 討論

DCM 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,患者體內(nèi)高血糖誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)被認(rèn)為是DCM 發(fā)生發(fā)展的主要原因[11]。ROS產(chǎn)生可誘導(dǎo)炎癥小體(NLRP3)激活[12]。NLRP3 激活后可促進(jìn)pro-caspase-1轉(zhuǎn)化為活性caspase-1 p10/20四聚體。caspase-1激活后切割GSDMD 蛋白(GSDMD-N),其N 端轉(zhuǎn)位插入質(zhì)膜,形成內(nèi)徑10～20 nm 的孔隙,同時(shí),活化的caspase-1還會(huì)激活I(lǐng)L-1β等炎癥因子,活化的炎癥因子通過(guò)GSDMD-N制造的孔洞釋放到細(xì)胞外,形成細(xì)胞焦亡表型[13-14]。因此,使用siRNA 沉默NLRP3是治療DCM 的一種潛在策略。但是siRNA體內(nèi)穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低,限制了siRNA 類藥物的臨床應(yīng)用[13]。

UTMD 介導(dǎo)超聲響應(yīng)復(fù)合納米微泡在增強(qiáng)基因藥物穩(wěn)定性提高轉(zhuǎn)染效率方面顯示出巨大潛力[14]。mPEG-b-PLLys膠束復(fù)合納米載體系統(tǒng)是一種優(yōu)良的超聲響應(yīng)載體,mPEG-b-PLLys可在體內(nèi)降解為賴氨酸,具有生物相容性好、毒性小、易被機(jī)體吸收代謝等優(yōu)點(diǎn)。作為兩親性嵌段共聚物,mPEG-b-PLLys可通過(guò)自組裝與基因藥物形成膠束,膠束再通過(guò)異組裝與氣芯納米脂質(zhì)體復(fù)合形成超聲響應(yīng)復(fù)合納米微泡。該微泡已被證實(shí)具有良好的超聲響應(yīng)能力,可增加基因藥物載藥量,改善其體內(nèi)穩(wěn)定性;與傳統(tǒng)微泡相比,在致密的組織內(nèi)具有更好的穿透力及轉(zhuǎn)染能力[15-16],但其對(duì)心血管疾病的治療效果有待研究。

本研究使用mPEG-b-PLLys復(fù)合納米微泡作為載體介導(dǎo)siNLRP3治療DCM,結(jié)果顯示,UTMD可有效增強(qiáng)siNLRP3-NBs對(duì)DCM 的治療作用,改善心肌纖維化及細(xì)胞焦亡。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局已發(fā)布《基因治療產(chǎn)品非臨床研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》,我們后續(xù)研究將會(huì)重點(diǎn)關(guān)注長(zhǎng)期使用UTMD治療的安全性及siNLRP3-NBs量效關(guān)系,為其臨床轉(zhuǎn)化提供參考數(shù)據(jù)。