王西強 ,劉成峰 ,劉 平 ,馬愛群 ,劉小祥 ,石 爽

(1.陜西省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西西安 710068;2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科,陜西西安 710061)

心力衰竭(心衰)是心血管疾病的終末階段,心室重構(gòu)在心衰發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1]。越來越多的證據(jù)表明,炎癥反應(yīng)在心室重構(gòu)中具有關(guān)鍵作用,但不同種類的免疫細胞在心衰發(fā)生發(fā)展過程中的作用目前并不十分清楚[2]。B淋巴細胞是小鼠心肌組織中最為豐富的免疫細胞之一,B淋巴細胞向T細胞提供抗原并產(chǎn)生細胞因子和趨化因子,最終調(diào)節(jié)其他免疫細胞的功能[3]。既往研究表明,急性心肌損傷和慢性心肌損傷中,通過調(diào)節(jié)心肌B淋巴細胞的數(shù)量和功能對心臟具有保護作用[4-7]。ZOUGGARI等[4]的研究顯示,B淋巴細胞通過釋放細胞因子ccl7 從骨髓中招募Ly6C+單核細胞,從而促進心肌梗死后的左心室重構(gòu)。HORCKMANS等[6]的研究顯示,B淋巴細胞能夠顯著減輕心肌梗死后及心包脂肪組織中免疫細胞的增殖。目前,B 淋巴細胞在血管緊張素Ⅱ/腎上腺素(angiotensinⅡ/phenylephrine,AngⅡ/PE)誘導的非缺血性心肌病中的作用還不清楚。本研究用血管緊張素Ⅱ/苯腎上腺素,AngⅡ/PE 建立心室肥厚動物模型,以探索B 淋巴細胞在AngⅡ/PE 誘導的心室肥厚中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 AngⅡ/PE心室肥厚模型的建立

選用10～14周齡雌性C57BL/B6J野生型小鼠(WT)及B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J(μMT)B淋巴細胞敲除小鼠進行實驗。小鼠均在無病原體的環(huán)境中,按照指南自由給予食物及水進行飼養(yǎng)。所有實驗根據(jù)西安交通大學醫(yī)學院動物委員會批準的動物協(xié)議進行。

將AngⅡ/PE(血管緊張素Ⅱ,1.5μg/g·d,Bachem;苯腎上腺素,50μg/g·d,Millipore Sigma)及生理鹽水(SAL,對照組)裝入微量泵中,隨后將滲透性微量泵通過手術(shù)植入小鼠皮下,并輸注AngⅡ/PE或SAL(對照組)于小鼠體內(nèi)(2周或4周)。小鼠滲透性微量泵植入手術(shù)根據(jù)西安交通大學醫(yī)學部動物研究委員會發(fā)布的指導方案進行。

1.2 血壓測量

采用尾袖CODA 無創(chuàng)血液監(jiān)測系統(tǒng)(Kent Scientific Corporation,Torrington,CT),通過容積描記的方法測量實驗組及對照組的基線、給藥后2周及4周小鼠尾部血壓,確定收縮壓、舒張壓和脈搏率,連續(xù)測量3 d,求平均值。

1.3 流式細胞術(shù)分析

提前準備好小鼠CO2處死箱,打開CO2控制器,控制CO2流量約2 L/min,取出各組小鼠,將小鼠放入充滿CO2的小鼠CO2處死箱中,處死小鼠。使用10 m L平衡鹽溶液(HBSS)溶液從右心室底部沖洗心臟。將心臟放入盛有Hank’s HBSS的100 mm培養(yǎng)皿中擠出心臟中的殘留血液。去除心臟表面液體,稱量左心室,使用刀片切碎左心室,均為2 min。之后,于含有3 m L HBSS的15 m L 離心管中,并換洗1次。向盛有標本的各離心管中分別加入膠原酶(450 U/m L)、透明質(zhì)酸酶(60 U/m L)、DNAseⅠ(60 U/m L)。將所有標本置于37℃的震蕩器中恒溫、勻速消化45 min后加入6 m L HBB 終止消化。40μm 濾膜過濾細胞,轉(zhuǎn)入新的15 m L 離心管中,4℃,400 r/min,離心7 min。去上清,每個樣品加入1 m L ACK lysis buffer,混勻后于冰上靜置12 min,加入5 m L FACS buffer,4℃、400 r/min再次離心7 min。去上清,加入45μL FACS buffer,取體積的1/3轉(zhuǎn)入1.5 m L離心管中,加入目標抗體混合物,上機進行實驗檢測。流式細胞術(shù)設(shè)門策略見圖1。

圖1 流式細胞術(shù)設(shè)門策略Fig.1 Gating strategy for the flow cytometric analysis

1.4 小鼠心臟超聲檢查

超聲檢查使用Vevo 770超聲系統(tǒng)(VisualSonics Inc,Toronto,Ontario,Canada)。腹腔注射(0.005 mL/g)20 g/L Tribromoethanol麻醉小鼠,根據(jù)超聲檢查時間,可每隔30 min予初始劑量的1/5作為維持劑量。使用化學脫毛劑從前胸脫掉毛發(fā),將小鼠以左側(cè)臥位放置在保暖墊上,以維持體溫(37℃),用直腸溫度計監(jiān)測體溫。胸口部位涂抹適當超聲用凝膠,注意保持適當接觸的同時,避免過度按壓胸部。通過手持操作超聲換能器獲得二維多普勒圖像。超聲檢測左心室質(zhì)量(LVM)、左心室射血分數(shù)(LVEF)、左心室舒張末期容積(LVEDV)、左心室收縮末期容積(LVESV)。

1.5 形態(tài)學和組織學觀察

AngⅡ/PE給藥2周或4周,處死小鼠后,取心臟稱重,確定心臟質(zhì)量與脛骨長度的比值(HW/TB)。心臟經(jīng)過處理,石蠟包埋后,使用Masson三色染色法進行染色[8]。使用ImageJ軟件對Masson’s三色染色的連續(xù)切片進行纖維化程度的量化檢測,以左心室纖維化陽性的平均百分比表示其纖維化程度。為使用麥胚凝集素(WGA)染色心肌細胞細胞膜,用Zeiss共聚焦顯微鏡觀察熒光,用Zeiss Axiovision軟件分析和測量數(shù)字圖像,以明確心肌細胞橫截面積。

1.6 CD68+巨噬細胞和Ly6G+中性粒細胞染色及計數(shù)分析

處死小鼠,迅速取出心臟,放入盛有心臟停搏液的培養(yǎng)皿中,充分沖洗后稱重,于40 g/L多聚甲醛溶液(PFA)中固定24 h,再放入300 g/L 蔗糖溶液中24 h。用OCT 包埋后于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。制?0μm 厚切片,于濕盒中,30 g/L 牛血清白蛋白(BSA)孵育過夜后,加入30 g/L BSA 配制的CD68(1∶400)一 抗100μL,室溫孵育1 h。PBS 清洗3次,5 min/次。加入30 g/L BSA 配制的熒光二抗(Alexa Fluor 555,1∶1 000),避光室溫孵育30 min 后,PBS清洗后加入含DAPI的抗熒光淬滅劑100μL,蓋上蓋玻片,避光保存30 min后,封片劑封片。使用激光共聚焦掃描完整的心臟切片,并使用Image J軟件計數(shù)CD68+的巨噬細胞數(shù)量。

1.7 統(tǒng)計學分析

變量采用均數(shù)±標準誤(S.E.M)表示,兩組間比較采用Student’sT檢驗,兩組以上比較采用One-way Anova檢驗。生存曲線采用Kaplan-Meier法,log-rank檢驗進行比較。P<0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。使用GraphPad prism 8.0(Graphpad software,Inc.,Cary,NC)進行統(tǒng)計分析和繪圖。

2 結(jié)果

2.1 B淋巴細胞在AngⅡ/PE誘導的心室肥厚模型心肌組織中大量聚集

實驗組(WT_AngⅡ/PE)小鼠的CD45+白細胞、CD64-Ly6C+單核細胞、CD64+Ly6C-巨噬細胞和Ly6g+中性粒細胞在2周時顯著增加(P<0.05),4周時各免疫細胞數(shù)量較2周時有所下降(圖2A～圖2D)。2周及4周模型組B淋巴細胞、B1淋巴細胞和B2淋巴細胞(為CD45+CD19+細胞、CD45+CD19+CD11b+細胞、CD45+CD19+CD11b-細胞)在心肌組織中大量聚集(P<0.05),與對照組(WT_SAL)小鼠心肌細胞內(nèi)免疫細胞相比,WT_AngⅡ/PE 小鼠心臟CD45+CD19+CD11b-(B2)細胞數(shù)量有增加趨勢,但在第4周時沒有統(tǒng)計學差異(圖2E～圖2G)。結(jié)果顯示,AngⅡ/PE 作用心肌細胞后導致B淋巴細胞在心肌組織中聚集,提示B細胞介導的免疫應(yīng)答在心臟損傷中可能發(fā)揮著重要作用。

圖2 流式細胞術(shù)檢測AngⅡ/PE作用2周及4周時小鼠心臟免疫細胞浸潤情況Fig.2 B cells deficiency alleviated cardiac hypertrophy at 2 and 4 weeks in AngⅡ/PE treatment mice

2.2 B淋巴細胞敲除可減輕AngⅡ/PE誘導的心肌肥厚

技術(shù)路線圖如圖3A 所示。AngⅡ/PE作用2周及4 周時,各組小鼠(WT_SAL、μMT_SAL、WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE)血壓檢測結(jié)果表明,B淋巴細胞敲除時不影響AngⅡ/PE 所致的血壓升高(圖3B)。

與WT_SAL及μMT_SAL組相比,4周時WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE 組的HW/TB 和左心室質(zhì)量(LVM)顯著增加(P<0.01,P<0.000 1);而WT_AngⅡ/PE 小鼠心臟HW/TB和LVM 同μMT_AngⅡ/PE相比顯著增大(P<0.05,圖3C、圖3D)。與上述結(jié)果一致,WGA 染色結(jié)果顯示,與WT_SAL和μMT-SAL組小鼠相比,WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE小鼠心臟的心肌細胞橫截面積顯著增加(P<0.000 1),而μMT_AngⅡ/PE 組心肌細胞橫截面積明顯小于WT_AngⅡ/PE 組(P<0.000 1,圖3E、圖3F)。提示B細胞敲除可減輕AngⅡ/PE誘導的心肌肥厚。

圖3 B淋巴細胞缺乏可改善AngⅡ/PE作用4周的小鼠心肌肥厚Fig.3 B lymphocyte deficiency alleviated myocardial hypertrophy after 4 weeks of AngⅡ/PE treatment in mice

心動超聲結(jié)果顯示,給予AngⅡ/PE 干預(yù)4 周時,WT_SAL、μMT_SAL、WT_AngⅡ/PE、μMT_AngⅡ/PE 四組間的LVEF、LVEDV、LVESV 無統(tǒng)計學差異(圖4A～圖4C)。心臟Masson 三色染色結(jié)果顯示,AngⅡ/PE可誘導WT 和μMT 小鼠心臟纖維化;WT_AngⅡ/PE小鼠與μMT_AngⅡ/PE 小鼠比較,4周時心肌細胞Masson's膠原染色百分比無統(tǒng)計學差異(圖4D、圖4E)。

圖4 B淋巴細胞缺乏改善AngⅡ/PE作用4周時小鼠心臟的結(jié)構(gòu)及功能Fig.4 B lymphocyte deficiency improved cardiac structure and function in mice treated with AngⅡ/PE for 4 weeks

2.3 B淋巴細胞敲除可減輕2周時AngⅡ/PE誘導的炎癥反應(yīng)

在AngⅡ/PE作用2周時,對各組心肌細胞內(nèi)免疫細胞進行流式細胞術(shù)分析,結(jié)果顯示,與WT_SAL AngⅡ/PE心肌組織中CD45+細胞數(shù)量顯著增加和μMT_SAL 心臟相比,WT_AngⅡ/PE和μMT_(P<0.000 1);而與WT_AngⅡ/PE 小鼠心肌細胞內(nèi)免疫細胞相比,μMT_AngⅡ/PE 心臟的CD45+細胞數(shù)量較WT_AngⅡ/PE 小鼠心肌細胞內(nèi)顯著減少(P<0.04,圖5A)。

考慮到B 淋巴細胞缺乏使μMT_AngⅡ/PE 心肌損傷后白細胞的浸潤減少,進一步確定特定的免疫細胞類型,結(jié)果表明,同WT_SAL 和μMT_SAL 組相比,WT_AngⅡ/PE和μMT_AngⅡ/PE 小鼠心肌組織中CD45+Ly6C+CD64-單核細胞顯著聚集,但μMT_AngⅡ/PE 組心肌組織CD45+Ly6C+CD64-單核細胞較WT_AngⅡ/PE 組有減少的趨勢(P=0.051 3,圖5B)。與上述結(jié)果類似的是,在AngⅡ/PE作用2周時,可誘導CD45+Ly6C-CD64+巨噬細胞在WT_AngⅡ/PE 和μMT_AngⅡ/PE 組顯著增加,但μMT_AngⅡ/PE 組小鼠心肌細胞內(nèi)CD45+Ly6C-CD64+巨噬細胞較WT_AngⅡ/PE 組顯著減少 (P<0.05,圖5C)。

在AngⅡ/PE作用2周時進行免疫熒光染色,進一步證實WT 和μMT 心肌組織中巨噬細胞的變化,在AngⅡ/PE處理的WT 小鼠心肌組織中CD64+巨噬細胞聚集,而在μMT_AngⅡ/PE 組心肌組織的CD64+巨噬細胞較WT_AngⅡ/PE 組顯著減少(圖5D、圖5E)。這與流式細胞術(shù)結(jié)果一致。流式細胞術(shù)和免疫熒光染色結(jié)果顯示,與WT_SAL 心臟相比,WT_AngⅡ/PE 和μMT_AngⅡ/PE 小鼠心臟Ly6G+中性粒細胞顯著增加(P<0.05和P<0.05,圖5F～圖5 H);而與WT_AngⅡ/PE相比,流式細胞術(shù)及免疫熒光染色μMT_AngⅡ/PE 心臟中Ly6G+細胞無統(tǒng)計學差異(P>0.05,圖5F、圖5H)。這提示B淋巴細胞缺乏可選擇性地減少μMT_AngⅡ/PE 中巨噬細胞的數(shù)量,而不影響Ly6G+中性粒細胞的數(shù)量。

圖5 流式細胞術(shù)檢測AngⅡ/PE作用2周時心肌組織內(nèi)炎癥細胞變化Fig.5 Changes of inflammatory cells in myocardial tissue at 2 weeks of AngⅡ/PE treatment detected by flow cytometry

3 討 論

既往研究顯示,AngⅡ刺激心臟和血管中促炎細胞因子、趨化因子和粘附分子的合成,誘導巨噬細胞、T 淋巴細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞的招募和激活[9]。然而,B淋巴細胞在AngⅡ/PE 誘導的心肌損傷中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果顯示,B淋巴細胞缺乏顯著降低AngⅡ/PE 誘導的心臟肥厚。心肌肥厚的改善是與CD45+白細胞、Ly6C+CD64-單核細胞和CD64+Ly6C-巨噬細胞在心肌細胞內(nèi)的減少有關(guān)。這提示B淋巴細胞缺乏能夠降低AngⅡ/PE 誘導的心臟炎癥,抑制心肌肥厚,并且這種作用獨立于AngⅡ/PE誘導的血壓升高。

B淋巴細胞敲除小鼠在AngⅡ/PE 作用下同樣出現(xiàn)了高血壓,但與WT 處理的小鼠相比,其心臟肥厚減輕,說明在AngⅡ/PE 誘導的心肌損傷中,B 淋巴細胞在心肌損傷中發(fā)揮重要作用,高血壓作為唯一的血流動力學損傷,可能不足以完全促進心肌損傷,進一步探索和干預(yù)炎癥反應(yīng)可能是治療心室肥厚的另一重要靶點。

研究顯示,在正常的成年小鼠心臟中存在著不同種類的免疫細胞群,CD19+B 淋巴細胞是成年小鼠心臟[3]中最多的免疫細胞之一。近期,ADAMO等[10]研究發(fā)現(xiàn),野生型小鼠心臟中有大量的CD19+CD11b-CD23-CD21-IgD+Ig Mlo淋巴細胞,以及兩種含量較少的CD19+CD11b+B1a和B1b細胞。心臟B淋巴細胞是循環(huán)B 淋巴細胞的一個重要亞群,與心臟的微血管內(nèi)皮密切接觸,并在通過心臟時短暫停留。絕大多數(shù)(>95%)心臟B細胞仍在血管內(nèi),而心臟細胞內(nèi)B淋巴細胞很少(<5%)[4]。并且,心臟B淋巴細胞的表型在發(fā)育過程中發(fā)生動態(tài)變化,新生兒心臟B淋巴細胞以CD11b+和CD11b-CD21-CD23-為主,成人B 淋巴細胞以CD11b-CD21+CD23+為主[10-12]。有研究顯示,B 淋巴細胞在心臟損傷后慢性左室重構(gòu)中發(fā)揮重要作用,但具體的B淋巴細胞介導的慢性左心室重構(gòu)的機制尚不清楚。有研究人員認為,免疫球蛋白參與了缺血再灌注后心肌的急性炎癥反應(yīng),在缺血后心衰模型中,B 淋巴細胞產(chǎn)生的Ig M 和IgG 抗體的表達在缺血后狀態(tài)下較對照組增加了3倍。采用特異性靶向Ig M 的N2或21G6 F(ab)2肽與心臟缺血抗原結(jié)合可預(yù)防及降低心臟I/R 后心臟損傷[13]。并且,ZOUGGARI等[4]發(fā)現(xiàn)CD19+B 淋巴細胞通過CCL7依賴途徑[6]從骨髓中招募Ly6C+單核細胞進入心肌梗死區(qū)域,并促進了心肌梗死后的心室重構(gòu)。

本研究的結(jié)果證實并擴展了之前描述的心肌B淋巴細胞的研究,提示B 淋巴細胞在AngⅡ/PE 作用后的心肌肥厚調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,B淋巴細胞在AngⅡ/PE誘導的心臟損傷中發(fā)揮著重要作用,B 淋巴細胞缺乏可以減輕心臟肥厚,改善心臟功能?？傊?本研究結(jié)果表明,B 淋巴細胞缺乏抑制AngⅡ/PE誘導的心臟炎癥反應(yīng),改善心肌肥厚,而這種作用不依賴于AngⅡ/PE誘導的高血壓。