汪志順 沈 昊 徐長庚 李國灝 郭永連

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)是指組織或者器官在缺血的基礎(chǔ)上恢復(fù)血流后，損傷進(jìn)一步加重，甚至出現(xiàn)損傷不可逆的現(xiàn)象。IRI是臨床上最常見的急性腎損傷的病因之一，常見于腎移植、保留腎單位手術(shù)，休克等臨床疾病的診治過程中[1]。目前對(duì)于IRI的病理生理機(jī)制尚未完全研究清楚?，F(xiàn)階段認(rèn)為其病變過程主要包括細(xì)胞能量代謝障礙，氧化應(yīng)激損傷，鈣離子超載，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，大量炎性細(xì)胞浸潤，補(bǔ)體激活，細(xì)胞的壞死及凋亡等，是由多因素多系統(tǒng)共同參與的復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程[2,3]。目前針對(duì)腎臟IRI的保護(hù)措施包括缺血預(yù)處理、干細(xì)胞移植、臨床新型藥物的使用等[4～6]。但大多數(shù)干預(yù)方式作用靶點(diǎn)較單一。IRI是多機(jī)制共同參與的，各機(jī)制間交叉重疊而又協(xié)同拮抗。目前很多植物活性成分是天然的抗氧化、抗炎藥物，具有多靶點(diǎn)優(yōu)勢(shì)，具有良好的研究?jī)r(jià)值。

原花青素是植物中廣泛存在的一大類多酚化合物的總稱，它廣泛存在于葡萄籽、蘋果、松樹皮、花生、櫻桃等植物中，其中尤其以葡萄籽中含量最為豐富。而葡萄籽原花青素B2(grape seed proanthocyanidin B2, GSPB2)在葡萄籽原花青素中分布最廣，抗氧化活性最強(qiáng)[7]。研究表明，GSPB2在胃和十二指腸消化條件下相對(duì)穩(wěn)定，且原花青素B2口服30min后就可以在血漿中檢測(cè)得到，因而GSPB2具有更好的生物利用度[8，9]。前期研究表明，原花青素B2具有極強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激、清除自由基、抗凋亡等生物活性[10～12]。但GSPB2在腎臟IRI模型中的作用研究甚少。本研究重點(diǎn)探討GSPB2對(duì)小鼠腎臟急性缺血再灌注損傷過程中氧化應(yīng)激損傷及凋亡的影響及機(jī)制。

材料與方法

1.材料：40只雄性C57BL小鼠購自華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。GSPB2和鴉膽子苦醇(brusatol, BRU)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL)購自南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司。SOD和MDA測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。Nrf-2、HO-1、cleaved-caspase-3一抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)公司，熒光標(biāo)記羊抗兔IgG二抗及HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗均購自武漢博士德生物工程有限公司。

2.模型建立及分組：所有C57BL小鼠均使用苯巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉，并行右腎切除術(shù)。然后用無損傷血管夾阻斷左腎動(dòng)靜脈45min，隨后恢復(fù)左腎動(dòng)靜脈血流，建立腎臟缺血再灌注模型。建模后24h處死各組小鼠并留取實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。所有小鼠隨機(jī)分成4組，即sham組(n=10，小鼠僅行右腎切除術(shù))、IRI組(n=10，小鼠行右腎切除術(shù)，后行左腎缺血45min，再灌注24h)、GSPB2+IRI組[n=10，小鼠在建模前45min腹腔注射GSPB2(30mg/kg)，后行右腎切除術(shù)，左腎缺血45min，再灌注24h]和GSPB2+BRU+IRI組[n=10，小鼠在建模前45min腹腔注射GSPB2(30mg/kg)及BRU(10mg/kg), 后行右腎切除術(shù)，左腎缺血45min，再灌注24h]。

3.樣本收集：造模后24h，采用苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉，行腹部正中切口，切取左腎，將腎臟組織縱行剖開，一半放入4%多聚甲醛液中固定，另外一半再分成兩份，一份用于透射電鏡使用，另一份放入凍存管中并放入液氮罐保存。

4.HE染色：將左腎組織用10%中性甲醛溶液固定，按常規(guī)石蠟切片制作流程， 梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，切片(厚4μm)，HE染色，光鏡下觀察。

5.透射電鏡：取新鮮1mm3的小塊腎組織標(biāo)本置于2.5%戊二醛電鏡固定液固定2h,用1%鋨酸4℃再固定，Spurr樹脂包埋，LKB1型超薄切片機(jī)切片，經(jīng)枸櫞酸鉛和醋酸鈾雙重染色后，在JEM-1200EX透射電鏡下觀察切片。

6.TUNEL染色：本實(shí)驗(yàn)釆用商業(yè)化的細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒制造商提供的產(chǎn)品說明書進(jìn)行操作，并在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

7.檢測(cè)腎臟組織中SOD、MDA水平： 檢測(cè)各組小鼠腎臟組織中SOD、MDA水平，具體操作嚴(yán)格按照商業(yè)試劑盒進(jìn)行。

8.腎臟組織免疫熒光染色：切片脫蠟至水，處理后的組織切片置于制備的EDTA抗原修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)。然后用10%的正常山羊血清在37℃下封閉切片30min。然后加入一抗Nrf-2、HO-1、cleaved-caspase-3，全部在4℃下培養(yǎng)過夜。然后滴加熒光標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30min。并使用DAPI染液染細(xì)胞核5min。用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

9.Western blot法檢測(cè)：從小鼠腎組織中提取和純化蛋白質(zhì)。采用SDS PAGE凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用含5% 脫脂奶粉的TBST浸泡PVDF膜，室溫封閉2h。然后加入一抗Nrf-2、HO-1、cleaved-caspase-3，4℃孵育過夜。TBST充分洗滌PVDF膜，再加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育2h。再用TBST漂洗，ECL顯影。

結(jié) 果

1.葡萄籽原花青素B2對(duì)腎缺血再灌注損傷后的腎臟形態(tài)及病理學(xué)的影響：HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，IRI組腎小管上皮細(xì)胞的腫脹、壞死及凋亡明顯加重。而與IRI組比較，GSPB2+IRI組的腎臟形態(tài)學(xué)損傷明顯減輕。而在GSPB2+ BRU+IRI組中GSPB2干預(yù)的保護(hù)作用受到了一定程度的抑制(圖1)。透射電子顯微鏡檢查顯示，IRI組的腎小管上皮細(xì)胞線粒體腫脹，線粒體空泡樣變性，線粒體嵴斷裂或消失等。而GSPB2+IRI組腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體損傷明顯減輕。而在GSPB2+BRU+IRI組中GSPB2干預(yù)的保護(hù)作用受到了一定程度的抑制(圖2)。

圖1 各組小鼠腎臟的形態(tài)及病理改變(HE,×400)A.sham組；B.IRI組；C.GSPB2+IRI組；D.GSPB2+BRU+IRI組

圖2 各組小鼠腎臟超微結(jié)構(gòu)及病理改變(透射電鏡，×8000)A.sham組；B.IRI組；C.GSPB2+IRI組；D.GSPB2+BRU+IRI組

2.葡萄籽原花青素B2對(duì)腎缺血再灌注損傷后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響：與sham組比較，IRI組腎小管上皮細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯增多(圖3)。同時(shí)，cleaved-caspase-3蛋白在IRI組中的表達(dá)水平明顯高于sham組(圖4、圖5)。而與IRI組比較，GSPB2+IRI組腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，且cleaved-

圖3 各組小鼠腎臟腎小管上皮細(xì)胞的凋亡(TUNEL，×400)A.sham組；B.IRI組；C.GSPB2+IRI組；D.GSPB2+ BRU+IRI組

圖4 各組小鼠腎臟組織cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)(免疫熒光染色，×400)A.sham組；B.IRI組；C.GSPB2+IRI組；D.GSPB2+BRU+IRI組

圖5 Western blot法檢測(cè)各組小鼠腎臟組織cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低(圖4、圖5)。而與GSPB2+IRI組比較，GSPB2+ BRU+IRI組中cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高。

3.葡萄籽原花青素B2對(duì)腎缺血再灌注損傷后SOD, MDA活性的影響：如表1所示，與sham組比較，IRI組、GSPB2+IRI組以及GSPB2+BRU+IRI組小鼠腎臟組織中的MDA的水平均明顯升高(P均<0.05)。同時(shí)，與IRI組比較，GSPB2+IRI組小鼠腎臟組織中的MDA的水平明顯降低，SOD水平明顯提高(P<0.05)。而GSPB2+BRU+IRI組小鼠腎臟組織中的MDA的水平又較GSPB2+IRI組明顯升高，同時(shí)SOD水平明顯降低(P<0.05)。

表1 各組小鼠腎臟組織中SOD及MDA的水平

4.葡萄籽原花青素B2對(duì)腎缺血再灌注損傷后抗氧化蛋白表達(dá)的影響：免疫熒光染色及Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，GSPB2+IRI組中小鼠腎臟組織的Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)水平較IRI組明顯上調(diào)。同時(shí)，與GSPB2+IRI組比較，GSPB2+ BRU+IRI組小鼠腎臟組織中Nrf2及HO-1蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)(圖6、圖7)。

圖6 各組小鼠腎臟組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)(免疫熒光染色，×400)A.sham組；B.IRI組；C.GSPB2+IRI組；D.GSPB2+BRU+IRI組

圖7 Western blot法檢測(cè)各組小鼠腎臟組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)

討 論

缺血再灌注損傷的病理生理及發(fā)病機(jī)制涉及多因素，并且錯(cuò)綜復(fù)雜。目前認(rèn)為在再灌注階段可產(chǎn)生大量的活性氧ROS(reactive oxygen species，ROS)，而線粒體越來越多的被認(rèn)為是這些ROS的關(guān)鍵來源[13]。來源于線粒體產(chǎn)生的過量的超氧化物可以激活多種途徑從而導(dǎo)致組織損傷。其中脂質(zhì)過氧化就可以導(dǎo)致細(xì)胞或線粒體的損傷進(jìn)一步導(dǎo)致ATP(adenosine triphosphate)生成中斷，鈣離子水平失調(diào)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放并隨后導(dǎo)致凋亡或壞死的發(fā)生[14]。因此，減少線粒體ROS產(chǎn)生或減輕氧化應(yīng)激損傷，減少腎小管上皮細(xì)胞的壞死和凋亡對(duì)減輕腎臟組織的缺血再灌注損傷具有重大意義。

正常情況下，腎小管上皮細(xì)胞線粒體呼吸可產(chǎn)生ROS，低水平的ROS作為細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)對(duì)于維持腎臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及功能具有重要意義，而過量的ROS則會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，對(duì)腎臟組織造成危害[15]。有研究表明，原花青素B2干預(yù)能促進(jìn)Nrf2核易位并對(duì)膿毒癥相關(guān)的急性腎損傷線粒體動(dòng)力學(xué)具有保護(hù)作用，同時(shí)原花青素B2干預(yù)能明顯降低小鼠腎臟組織中superoxide (O2-) 和NOX4的水平，提高腎臟組織中抗氧化酶SOD、GSH的水平，同時(shí)降低MDA的水平[16]。本研究中比較IRI組，GSPB2+IRI組腎小管上皮細(xì)胞線粒體損傷明顯減輕，同時(shí)小鼠腎臟組織中抗氧化酶SOD的水平明顯提高，同時(shí)小鼠腎臟組織中MDA的水平明顯降低。

為了維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，避免有害的氧化應(yīng)激損傷，由KEAP1(kelch-like ech- associated protein 1)和Nrf2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2)共同組成的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)多種解毒相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)揮著重要保護(hù)作用[17]。在正常情況下，KEAP1蛋白與Nrf2蛋白在細(xì)胞質(zhì)中結(jié)合，Nrf2受到 KEAP1的調(diào)控，并經(jīng)過泛素化降解，使Nrf2維持較低水平。當(dāng)受到氧化應(yīng)激刺激時(shí)，親電試劑與KEAP1的半胱氨酸殘基加成，誘導(dǎo)KEAP1的空間構(gòu)象改變，使Nrf2與KEAP1解離，解離后的Nrf2轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)與核內(nèi)的抗氧化反應(yīng)原件相結(jié)合，提高HO-1(heme oxygenase 1)、NQO-1 (NADPH quinone oxidoreductase 1) 等多種抗氧化基因的表達(dá)水平[18]。

本研究中，與IRI組比較，GSPB2+IRI組小鼠缺血再灌注損傷腎臟組織中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平均明顯提高。而當(dāng)加入Nrf2抑制劑BRU后，GSPB2+BRU+IRI組小鼠缺血再灌注損傷腎臟組織中Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá)水平較GSPB2+IRI組均明顯降低。因此，筆者推測(cè)葡萄籽原花青素B2干預(yù)可以激活內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)中Nrf2/HO-1信號(hào)通路并提高抗氧化蛋白Nrf2和HO-1的表達(dá)水平，從而減輕腎臟缺血再灌注過程中的氧化應(yīng)激損傷。

在缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷過程中不可避免的存在著內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到過量ROS和(或)Ca2+超載等嚴(yán)重應(yīng)激刺激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)受損，從而導(dǎo)致未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積聚，這些變化最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，原花青素B2預(yù)處理能通過調(diào)控Bcl-2/Bax和NF-κB 信號(hào)通路從而減少脂多糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[20]。本研究中葡萄籽原花青素B2預(yù)處理能明顯抑制缺血再灌注損傷腎臟組織中凋亡相關(guān)蛋白cleaved-caspase-3的表達(dá)，明顯減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，葡萄籽原花青素B2干預(yù)能明顯減輕小鼠腎臟缺血再灌注過程中的氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡。這可能與葡萄籽原花青素B2干預(yù)能激活內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)Nrf2/HO-1信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)初步表明了葡萄籽原花青素B2干預(yù)能減輕小鼠腎缺血再灌注損傷，為缺血再灌注損傷的藥物防治提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。