張 帆 周云鑫 劉 柯 丁軍穎
新型冠狀病毒肺炎疫情的肆虐提高了國內(nèi)外對(duì)呼吸系統(tǒng)感染性疾病的關(guān)注。近年來,由環(huán)境污染、空氣質(zhì)量下降等因素引起的呼吸系統(tǒng)炎癥性疾病的發(fā)生率逐年升高,加之抗生素治療產(chǎn)生的毒性不良反應(yīng)、細(xì)菌譜耐藥性的增加,多重耐藥菌感染性肺炎的病死率居高不下。中醫(yī)藥不易耐藥,在治療呼吸系統(tǒng)感染性疾病時(shí)優(yōu)勢(shì)顯著。
由黃芪、當(dāng)歸、金銀花、青蒿及虎杖5味藥組成的芪歸銀方(Qiguiyin,QGY),可明顯降低耐藥菌對(duì)抗生素的耐藥性,有效提高抗生素的療效[1]。QGY及其含藥血清在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中雖對(duì)銅綠假單胞菌無直接抑菌作用,但可調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子存在影響[2~4]。此外,QGY可有效促進(jìn)肺炎大鼠肺組織高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的表達(dá),且髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response 88,MyD88)/IL-1受體接頭蛋白分子(IL-1 receptor domain-containing adaptor,TRIF)依賴通路的效應(yīng)分子核因子-κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)、IL-4、IL-1β、TNF-α和干擾素(interferon,IFN)-γ等均在QGY適宜劑量時(shí)出現(xiàn)表達(dá)抑制[5]。本研究擬以LPS誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383構(gòu)建炎性細(xì)胞模型,進(jìn)一步探討QGY對(duì)呼吸系統(tǒng)免疫功能的調(diào)節(jié)作用,為QGY治療呼吸系統(tǒng)炎性疾病的抗炎機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
1.材料:(1)藥物:芪歸銀方各組分(由黃芪、當(dāng)歸、金銀花、青蒿及虎杖按12∶3∶3∶2∶2比例配成)由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院提供。脂多糖(5克/支)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。(2)細(xì)胞株:大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。(3)試劑:胎牛血清、0.25%胰酶購自美國Gibco公司;RPMI-1640購自美國HyClone公司;DMSO購自美國Sigma公司;CCK-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所;大鼠IL-1β、TNF-α、MCP-1和Arg-1的ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。
2.藥物制備:QGY凍干粉:將芪歸銀方各組分按比例稱取。首次煎煮,加入生藥總克數(shù)10倍體積的超純水,提前浸泡30min,武火煮沸,轉(zhuǎn)文火煎煮2h,過濾備用;二次煎煮,添加6倍體積的超純水,武火煮沸,轉(zhuǎn)文火煎煮1.5h,過濾備用;兩次煎液合并,加熱濃縮至目的體積,收集后恢復(fù)至室溫,置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥,獲取凍干粉,備用。
3.細(xì)胞培養(yǎng):NR8383細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,2~3天換液1次,生長密度達(dá)85%左右按1∶3進(jìn)行傳代,取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
4.細(xì)胞炎癥模型建立:取對(duì)數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的NR8383進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。調(diào)整NR8383細(xì)胞懸液至5×105/ml,以每孔2ml接種于12孔板中,適應(yīng)性培養(yǎng)2h。各組分別加入LPS(0、0.125、0.25、0.5、1、2μg/ml)繼續(xù)培養(yǎng)24h。于倒置顯微鏡下觀察不同濃度的LPS誘導(dǎo)的NR8383巨噬細(xì)胞形態(tài)的變化。
5.細(xì)胞活力檢測(cè):將對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的NR8383細(xì)胞懸液調(diào)整為1×104個(gè)/毫升,以每孔100μl接種于96孔板中。設(shè)置空白細(xì)胞組(該組不含細(xì)胞)、空白藥物組(該組不含藥物)、QGY給藥組??瞻捉M加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)基,QGY給藥組加入不同濃度的QGY凍干粉(0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16mg/ml),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。每組3個(gè)樣本,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。檢測(cè)前2h每孔加入10%的CCK-8溶液100μl,37℃培養(yǎng)箱中孵育2h,酶標(biāo)儀450nm處檢測(cè)吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以細(xì)胞存活率表示,細(xì)胞存活率(%)=(QGY給藥組A值-空白細(xì)胞組A值)/(空白藥物組A值-空白細(xì)胞組A值)×100%。
6.免疫因子檢測(cè):將對(duì)數(shù)生長期生長狀態(tài)良好的NR8383細(xì)胞懸液調(diào)整為5×105個(gè)/毫升,以每孔2ml接種于12孔板中。設(shè)置空白對(duì)照組(control組)、模型對(duì)照組(LPS組)和芪歸銀實(shí)驗(yàn)組(LPS+QGY組)??瞻讓?duì)照組加入等量的RPMI-1640培養(yǎng)基,模型對(duì)照組加入已篩選的LPS最佳濃度,芪歸銀實(shí)驗(yàn)組加入LPS和不同濃度的QGY凍干粉(0.5、1、2、4mg/ml),置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)24、48、72h。每組3個(gè)樣本,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。ELISA法檢測(cè)NR8383細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、MCP-1和Arg-1的含量,實(shí)驗(yàn)按照ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行。繪制ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,依據(jù)曲線公式,結(jié)合稀釋倍數(shù)求得樣本各指標(biāo)的含量。
1.LPS最佳濃度的優(yōu)化結(jié)果:倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)如圖1所示。control組中細(xì)胞呈圓形,整體分布均勻,半貼壁半懸浮生長。與control組比較,各模型組中細(xì)胞數(shù)量明顯減少,出現(xiàn)不同程度的空泡、破裂,以及明顯的聚集現(xiàn)象;形態(tài)上,細(xì)胞偽足增加,細(xì)胞由折光度較高的圓形分化為梭形、星形和多角形等。而不同濃度LPS處理的細(xì)胞形態(tài)略有差異,與control組比較,1μg/ml的LPS誘導(dǎo)下細(xì)胞形態(tài)變化更為明顯。LPS在1μg/ml的濃度時(shí),成功構(gòu)建了NR8383炎性細(xì)胞模型。
圖1 不同濃度的LPS對(duì)NR8383細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×100)
2.QGY對(duì)NR8383細(xì)胞活力的影響:如圖2所示,0.125~2.000mg/ml的QGY在72h內(nèi)對(duì)NR8383巨噬細(xì)胞無明顯毒性不良反應(yīng);1~2mg/ml的QGY顯著促進(jìn)NR8383巨噬細(xì)胞增殖(P<0.05);QGY濃度高于2mg/ml對(duì)細(xì)胞生長存在一定的抑制作用,且隨濃度的增加和作用時(shí)間的延長,抑制作用呈增強(qiáng)趨勢(shì),提示本研究所用QGY最佳濃度為2mg/ml,且在72h監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞無明顯毒性不良反應(yīng)。
圖2 不同劑量QGY對(duì)NR8383巨噬細(xì)胞活力的影響與空白藥物組比較,*P<0.05
3.QGY對(duì)NR8383免疫因子分泌的影響:QGY能夠降低LPS刺激下NR8383細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α和MCP-1的含量。如圖3所示,與空白對(duì)照組比較,在LPS刺激72h監(jiān)測(cè)范圍內(nèi),1μg/ml的LPS組中,IL-1β、TNF-α和MCP-1的含量均顯著升高(P均<0.05),Arg-1的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與模型對(duì)照組比較,1~2mg/ml的QGY可顯著降低IL-1β和MCP-1的含量(P均<0.05),2mg/ml則可顯著降低TNF-α的含量(P<0.05)。其中,2mg/ml的QGY作用48h,可顯著降低TNF-α和MCP-1的含量(P均<0.01)。與模型對(duì)照組比較,QGY對(duì)NR8383巨噬細(xì)胞Arg-1的含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而當(dāng)QGY濃度>2mg/ml,不同時(shí)間點(diǎn)上的IL-1β、TNF-α、MCP-1和Arg-1的含量下降并不明顯,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。
圖3 不同劑量QGY對(duì)LPS刺激下NR8383巨噬細(xì)胞免疫因子的影響與模型對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白對(duì)照組比較,#P<0.05
以《內(nèi)外傷辨惑論》中當(dāng)歸補(bǔ)血湯化裁而成的QGY,是劉清泉教授積多年臨床實(shí)踐所創(chuàng)的用于治療耐藥菌肺炎的經(jīng)典效方[1,6]。QGY以“扶正透邪”為治則,補(bǔ)氣養(yǎng)血而不滋膩,清熱透達(dá)而不傷正,契合感染性肺炎,尤其是耐藥菌肺炎“正氣不足、邪毒內(nèi)伏”的證候特點(diǎn)[7]。QGY及其含藥血清在體外抑菌實(shí)驗(yàn)中雖對(duì)銅綠假單胞菌無直接抑菌作用,但可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答,在合理使用抗生素的基礎(chǔ)上,促進(jìn)阻斷炎性瀑布反應(yīng),提高抗多重耐藥菌感染的臨床療效[3,4,7]。
IL-1β和TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的早期促炎性細(xì)胞因子,是機(jī)體炎性反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的中心遞質(zhì),發(fā)揮“主調(diào)節(jié)器”的作用[8,9]。IL-1β和TNF-α可刺激肺巨噬細(xì)胞產(chǎn)生和傳遞趨化因子,激活外周循環(huán)中的其他免疫因子,募集并浸潤到肺泡和肺間質(zhì)中,催化肺部的炎性反應(yīng),導(dǎo)致肺組織損傷[10,11]。QGY的主要藥效成分包括黃芪甲苷、綠原酸、虎杖苷和白藜蘆醇等[12]。
研究發(fā)現(xiàn),QGY的諸多藥效成分參與調(diào)節(jié)免疫因子的表達(dá),對(duì)呼吸系統(tǒng)炎性疾病起保護(hù)作用。黃芪甲苷是中藥黃芪的主要藥效成分,可降低野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓大鼠血清中TNF-α和IL-1β的含量,以及肺組織中TNF-α和IL-1β基因的表達(dá),改善肺部炎癥及肺動(dòng)脈重塑[13]。阿魏酸是中藥當(dāng)歸的主要有機(jī)酸成分,可通過減少大鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中的IL-1β和TNF-α等的分泌,減輕LPS誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[14]。綠原酸作為金銀花的主要藥效成分,聯(lián)合左氧氟沙星可顯著降低模型小鼠血清中TNF-α和IL-1β的分泌水平,提高肺炎克雷伯菌感染小鼠的存活率,減輕小鼠的肺部感染,發(fā)揮抗肺炎克雷伯菌感染的協(xié)同作用[15]?;⒄溶帐侵兴幓⒄鹊暮诵乃幮С煞?,虎杖苷可通過抑制S100B介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps,NETs)的形成,減少IL-1β、TNF-α和MCP-1等的釋放,減輕嚴(yán)重創(chuàng)傷性腦損傷引起急性肺損傷(acute lung injury,ALI)[16]。白藜蘆醇作為虎杖苷的自由態(tài),可通過抑制LPS刺激的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞MH-S中TNF-α和IL-1β的增加,減輕膿毒癥誘導(dǎo)的ALI[17]。此外,青蒿琥酯作為中藥青蒿的衍生物,通過減少LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷體內(nèi)炎性細(xì)胞的數(shù)量,抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌等,參與保護(hù)LPS誘導(dǎo)的ALI[18]。
MCP-1(也稱為CCL2)是趨化因子CC亞族中的一員,參與調(diào)節(jié)單核-吞噬細(xì)胞以及T淋巴細(xì)胞的分化、遷移和浸潤,對(duì)抗炎性反應(yīng)[19]。在肺部細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí),單核-吞噬細(xì)胞等均可分泌出大量MCP-1,趨化巨噬細(xì)胞浸潤肺實(shí)質(zhì),參與呼吸系統(tǒng)炎性疾病的發(fā)生與發(fā)展[20,21]。研究表明,細(xì)菌感染所致ALI體外模型細(xì)胞上清液中MCP-1的分泌增加,體內(nèi)模型BALF中TNF-α、MCP-1及血清中MCP-1水平均升高,蓮花清瘟膠囊可通過下調(diào)MCP-1的表達(dá),有效降低單核細(xì)胞對(duì)肺部感染灶的趨化性,從而阻斷ALI疾病發(fā)展[22]。MCP-1參與TNF-α誘導(dǎo)的炎性反應(yīng),白藜蘆醇可通過抑制TNF-α而下調(diào)MCP-1的表達(dá),對(duì)大鼠肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞起保護(hù)作用[23]。
此外,研究發(fā)現(xiàn)QGY的君藥黃芪及臣藥金銀花可促進(jìn)COVID-19患者康復(fù)過程中肺部病變的吸收[24]?;⒄戎械幕⒄溶占鞍邹继J醇是治療冠狀病毒感染的潛在廣譜抑制劑,可有效抑制新型冠狀病毒的復(fù)制[25]。同時(shí),研究表明,青蒿提取物可抑制COVID-19及其兩種變體的體外復(fù)制[26]。為QGY治療新型冠狀病毒肺炎提供了可能,同時(shí)也拓展了QGY對(duì)感染性肺炎的治療范圍。
綜上所述,本研究采用大鼠肺泡巨噬細(xì)胞NR8383作為研究對(duì)象,通過LPS誘導(dǎo)成功構(gòu)建了體外炎性細(xì)胞模型,檢測(cè)細(xì)胞上清液中IL-1β、TNF-α、MCP-1和Arg-1的含量,結(jié)果顯示QGY可顯著抑制LPS刺激后IL-1β、TNF-α和MCP-1的分泌,與既往體外研究報(bào)道相一致,提示QGY對(duì)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NR8383具有免疫調(diào)節(jié)作用。本研究豐富了QGY治療呼吸系統(tǒng)炎性疾病抗炎機(jī)制的理論內(nèi)涵,為臨床開發(fā)和應(yīng)用中醫(yī)藥治療耐藥菌所致肺炎奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。