劉萌萌，張 ，張紫薇，袁建彬，郭景茹

（黑龍江八一農墾大學，大慶 163319）

北方寒冷天氣是多種疾病的誘因，機體的免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等都易受到寒冷環(huán)境的影響［1，2］。有研究表明，冷暴露能夠導致機體腸道菌群破壞、免疫細胞數(shù)量下降、生長速度減慢、生產性能和飼料轉化率降低，使動物感染疾病的幾率大大增加，甚至造成新生幼崽死亡，母畜流產等，進而降低動物產品的產出，制約我國北方畜牧業(yè)的經濟發(fā)展［3-5］。

腸道為機體主要消化吸收的部位，極易受到外部環(huán)境的變化致腸道疾病發(fā)生。有研究表明，慢性冷暴露增加大鼠的肥大細胞數(shù)量，引起大鼠小腸上皮細胞增殖速率受損，從而促進炎癥性腸炎的發(fā)生［6］。回腸具有消化、排空等功能，是動物吸取營養(yǎng)物質的主要部位。據報道，長期處于高溫或低溫的環(huán)境會破壞機體回腸微生物的多樣性［7］，影響機體生長發(fā)育、消化吸收、營養(yǎng)免疫等功能。腸道上皮屏障能夠隔離腸腔與血流，可分為機械屏障、免疫屏障、生物屏障和化學屏障四種類型［8］。其中機械屏障則是腸道復雜功能網絡的基礎，它是由緊密連接和腸黏膜上皮細胞組成。腸上皮細胞間的連接是一種復雜的分子結構，被稱為緊密連接，這種緊密連接能夠保持上皮細胞和內皮細胞結構的完整性，形成一種致密的黏膜屏障來維護腸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)［9］。緊密連接包括閉合蛋白（Claudins）、咬合蛋白（Occludin）、帶狀閉合蛋白（zonula occludens，ZOs）等，其中Claudin-1和Occludin是構成緊密連接的重要組成部分，ZO-1是緊密連接中跨膜蛋白的主要成分。緊密連接相關蛋白互相連接形成致密的復合物，以保證細胞與細胞之間的緊密結合［10］。以往研究發(fā)現(xiàn)，外界溫度驟降能夠減弱緊密連接功能，增加小鼠腸道通透性［11］，并指出完整的緊密結構對于機體健康的重要性。此外機體的免疫系統(tǒng)被激活后，免疫細胞活化，炎癥細胞因子釋放增加，激活相關通路，也會導致上皮細胞的緊密連接受到破壞，增加通透性，病原體和細菌趁機侵入腸道，增加腸道患病的幾率［12］。另有研究發(fā)現(xiàn)，當腸道受到抗原刺激時會使免疫防御機制遭到破壞，腸道微生物失調而引起炎癥性相關疾病的發(fā)生［13］。

據此，本研究旨在探討冷暴露對小鼠回腸屏障功能損傷的作用及NF-κB對其調控機制，為機體腸道健康及應激性腸病的靶向治療提供基礎數(shù)據。

1 材料及方法

1.1 建立小鼠冷暴露模型

將20只5周齡雄性C57BL/6小鼠（購于北京維通利華實驗動物技術有限公司）隨機分為兩組，即對照組和冷暴露組，每組10只。試驗前于室溫氣候室內預飼一周，保證自由飲食。預飼結束后將對照組小鼠置于恒溫氣候室內，飼養(yǎng)保持溫度（24±2）℃，濕度40%。冷暴露組小鼠每天轉移至溫度為（4±2）℃濕度為40%的恒溫氣候室中3 h，連續(xù)冷暴露三周。冷暴露周期結束后注射戊巴比妥麻醉處死，沿腹部中線剪開，距離盲腸前6 cm剪斷，采集回腸組織，用生理鹽水反復漂洗至干凈，濾紙吸干多余液體后，部分凍存于-80℃冰箱內以備用后續(xù)實驗，另取部分回腸組織置于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2 試劑

BCA蛋白質分析試劑盒，貨號：P0012S購于碧云天生物技術公司；抗體：p-p65（AF2006，1∶1 000）購于：Affinity Biosciences有限公司，Claudin-1（13050-1-AP，Proteintech，1∶5 000）、Occlundin（27260-1-AP，Proteintech，1∶3 000）、ZO-1（21773-1-AP，Proteintech，1∶7 000）、IL-1β（26048-1-AP，Proteintech，1∶800）、IL-6（66146-1-lg，Proteintech，1∶1 000）、p65（66535-1-Ig，1∶1 000）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（SA00001-1，1∶8 000）和HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（SA00001-2，1∶8 000）、CoraLite 488-Conjugated ZO-1 Polyclonal Antibody（CL488-21773，IF：1∶50～1∶500）均購于武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 小鼠回腸組織石蠟切片

取2～3 mm厚的小鼠回腸組織，脫水后放入4%的多聚甲醛后進行固定，隨后按照常規(guī)的切片制作步驟進行相應處理。然后將切片貼于已經處理后的載玻片上，烤片經一晝夜后保存，次日應用HE染色和Masson染料染色后，光學顯微鏡觀察其形態(tài)學變化。

1.4 免疫熒光染色

制作回腸組織切片，使用PBS沖洗切片4次，每次3 min，沖洗結束后滴加10%正常山羊血清37℃下封閉45 min。封閉結束后，沖洗干凈分別加入按照說明書稀釋的胞質緊密粘連蛋白1抗體（zonula occludens-1，ZO-1），放入濕盒中37℃下孵育1 h，置于4℃下過夜。孵育結束后，使用PBS沖洗3次，每次5 min，然后避光加入相應的熒光二抗（1∶200），37℃下孵育45 min，孵育結束后，吸棄二抗，不再清洗，使用抗熒光淬滅劑（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）在避光條件下封片，置于熒光顯微鏡下觀察，保存圖像。

1.5 免疫蛋白印跡

蛋白樣品的制備及濃度的測定：取5周齡C57BL/6對照組和冷暴露組的雄性小鼠的回腸組織，制備所需要的蛋白樣品，高溫變性后凍存于-20℃。將提前制備好SDS-PAGE膠置于電泳液中，按照一定順序在梳孔加入蛋白樣品后進行電泳，電泳結束后進行電轉，室溫封閉PVDF膜1 h，使用TBST漂洗，依次加入相應抗體，置于4℃搖床過夜。一抗孵育結束后使用TBST進行漂洗，然后使用二抗室溫孵育1 h，再次漂洗干凈。使用ECL化學發(fā)光試劑將帶有目的蛋白的PVDF膜進行顯影。應用lmage Lab軟件，檢測緊密連接蛋白、NF-κB蛋白、炎癥細胞因子蛋白并分析各條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值作為蛋白表達相對水平。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 冷暴露對小鼠回腸組織的影響

HE染色發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠回腸絨毛結構完整，排列整齊。與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸絨毛長度變短，部分絨毛缺失，隱窩深度增加，環(huán)形肌層變薄，出現(xiàn)大量炎癥浸潤現(xiàn)象（圖1）。Masson染色結果顯示：與對照組相比，冷暴露組膠原纖維沉積增加，出現(xiàn)輕微纖維化（圖2）。免疫熒光檢測可見，對照組ZO-1主要集中分布于絨毛緊密連接處，分布較為均勻、緊密；與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸組織ZO-1熒光強度明顯減弱，分布松散，失去緊密結構（圖3）。

Fig.1 Effects of cold exposure on mice ileum（HE×400）

Fig.2 Effects of cold exposure on collagen fibre in mice ileum（Masson×400）

Fig.3 Effects of cold exposure on tight junction of mice ileum determined by immunofluorescence method（Scale bar=25 μm）

2.2 冷暴露對小鼠回腸組織緊密連接相關蛋白表達的影響

Western blot檢測結果表明，與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸組織Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表達水平均顯著下調（P＜0.01，P＜0.05，圖4，表1）。

Fig.4 The protein expressionsof claudin-1，occludin and ZO-1 detected by Western blot（n=10）

Tab.1 The protein expressions levels of claudin-1，occludin，ZO-1 and p-p65 in different groups（±s，n=10）

Tab.1 The protein expressions levels of claudin-1，occludin，ZO-1 and p-p65 in different groups（±s，n=10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Croup Claudin-1 Occludin ZO-1 p-p65 Control 2.35±0.28 0.58±0.21 0.69±0.17 2.95±1.18 Cold exposure 1.63±0.15**0.31±0.12*0.49±0.09*5.77±1.91*

2.3 冷暴露對小鼠回腸組織NF-κB通路相關蛋白表達的影響

Western blot檢測結果表明，與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸中NF-κB通路的相關蛋白p-p65蛋白表達顯著上調（P＜0.05，圖5，表1）。

Fig.5 The protein expressions of p65 and p-p65 detected by Western blot（n=10）

2.4 冷暴露對小鼠回腸組織炎癥細胞因子蛋白表達的影響

Western blot檢測結果表明，與對照組相比，冷暴露組小鼠回腸組織炎性細胞因子白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6（interleukin-6，IL-6）蛋白表達水平均顯著上調（P＜0.05，P＜0.01，圖6，表2）。

Fig.6 The protein expressions of IL-1βand IL-6 detected by Western blot（n=10）

Tab.2 The levels of IL-1βand IL-6 in different groups（±s，n=10）

Tab.2 The levels of IL-1βand IL-6 in different groups（±s，n=10）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs control

Croup IL-1β IL-6 Control 0.02±0.01 0.13±0.18 Cold exposure 0.05±0.00* 0.78±0.15**

3 討論

近年來越來越多的研究表明，動物暴露在寒冷的環(huán)境時，可能會導致機體的體溫調節(jié)發(fā)生障礙，中樞系統(tǒng)受損，嚴重可影響動物的生命安全［14］。腸道是消化管中最長的一段，功能尤為重要?；啬c是消化和吸收的主要場所之一，緊密連接功能作為屏障的重要組成部分，當其功能被破壞時就會對腸道的健康造成負面影響。一旦腸屏障功能受損，腸道通透性升高，就會增加腸內細菌與毒素入血的概率，嚴重者或可導致腸源性膿毒血癥，繼發(fā)全身炎癥。在緊密連接蛋白受到抑制時易產生腹腔疾病，在早晚期的腸道腫瘤中也發(fā)現(xiàn)幾種緊密連接蛋白表達缺陷［15］。

本研究發(fā)現(xiàn)，冷暴露能夠造成小鼠回腸結構損傷，與以往相關報道的結果相一致［16］，均表明腸道絨毛結構完整性及機械物理屏障在腸道疾病的發(fā)生發(fā)展中起到不可或缺的作用。

緊密連接的相鄰細胞膜間形成的屏障層，是腸道機械屏障主要的組成部分之一。動物腸道中有大量的菌群和致病因子，健康腸道的腸黏膜屏障可以有效阻止大量抗原物質的侵害，從而保證腸道的正常功能及其內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。為適應復雜多變的腸道環(huán)境，緊密連接蛋白呈現(xiàn)高度動態(tài)變化，其完整性也與多種腸道疾病密切相關。以往研究發(fā)現(xiàn)，緊密連接蛋白的表達變化直接與小腸上皮的屏障功能和完整性直接相關［17］。本實驗在冷暴露的條件下，小鼠回腸的緊密連接蛋白顯著下降，致使腸道屏障受損。發(fā)生嚴重燙傷時，在創(chuàng)傷應激條件下緊密連接被破壞，腸黏膜屏障功能被削弱，通透性升高，從而導致細菌移位和內毒素血癥［18］。

核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）能夠參與體內的應激反應、免疫應答與炎癥反應［19］。細胞正常狀態(tài)下，NF-κB主要以二聚體形式存在，其中大部分二聚體與抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）相結合，而處于無活性狀態(tài)，一旦細胞受到炎癥因子刺激后，IκB將與NF-κB二聚體解離而使其p65亞基發(fā)生磷酸化并進入細胞核，致使NF-κB被激活，促使炎癥發(fā)生［20］。近年來國內外的研究都指出NF-κB與腸道疾病之間的密切聯(lián)系［21］。有研究表明，患有潰瘍性結腸炎小鼠的結腸中發(fā)現(xiàn)通透性升高與腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、NF-κB p65升高呈正相關［22］；在腸道黏膜上皮處檢測到NF-κB的表達增多，促炎細胞因子也隨之增加，加劇炎癥反應［23］。肖南［24］等人研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制NF-κB p65的活化，能夠緩解葡聚糖硫酸鈉鹽誘導小鼠結腸炎的病理損傷，減少炎癥細胞因子的釋放，抑制結腸細胞凋亡。據報道巨噬細胞過度活化可以激活NF-κB通路，促進釋放炎癥細胞因子，引起組織炎癥反應［25］。本研究結果表明，冷暴露后回腸組織內p-p65的蛋白表達水平上調，激活回腸內NF-κB通路，表明冷暴露能夠促進炎癥反應的發(fā)生。當腸道受刺激時，免疫巨噬細胞釋放大量炎癥細胞因子，能夠引發(fā)克羅恩病、潰瘍性結腸炎在內的多種炎癥性疾?。?6］。其機制是由于促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間平衡被打破［27］。白細胞介素是介導免疫細胞活化和增殖的一類細胞因子，參與免疫反應的調節(jié)。本研究結果顯示：冷暴露后小鼠回腸炎癥細胞因子IL-1β和IL-6的蛋白表達有所增加。表明促炎細胞因子聚積，導致炎癥性疾病的發(fā)生。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)冷暴露能夠破壞回腸組織緊密連接與機械屏障的完整性，增加回腸組織的通透性和疾病易感性，激活NF-κB信號通路，促進炎癥反應的發(fā)生。