曹書源，常 青，劉國純，羅明昊，汪 洋，何龍林

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，重慶 400050）

高血壓引發(fā)慢性腎?。╟hronic kidney disease，CKD）和終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD），最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化甚至腎功能衰竭［1］，已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的巨大威脅，目前在臨床治療中能夠阻止或逆轉(zhuǎn)腎纖維化的療法仍然有限［2，3］。近年來有研究表明，有氧運(yùn)動(dòng)或有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合抗阻運(yùn)動(dòng)可以改善高血壓、增強(qiáng)腎臟抗氧化能力、減輕腎臟纖維化程度。Souza Michel Kendy等人［4］研究表明，抗阻訓(xùn)練可有效減輕5/6腎切除CKD模型大鼠的腎臟纖維化和炎癥；Shimojo Guilherme Lemos等人［5］證明有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合抗阻訓(xùn)練可降低平均動(dòng)脈血壓，減少去卵巢大鼠心臟炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)，降低心臟和腎臟的脂質(zhì)過氧化水平，還增強(qiáng)心臟和腎臟的總抗氧化能力。有氧運(yùn)動(dòng)作為運(yùn)動(dòng)康復(fù)的重要手段之一，是改善原發(fā)性高血壓患者血壓的一種潛在的非藥物治療方法。但是關(guān)于有氧運(yùn)動(dòng)如何改善高血壓腎損傷的機(jī)制研究甚少，有待進(jìn)一步的探討。

有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以通過下調(diào)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的活性來降低血壓。Silva SD等人研究［6］證實(shí)有氧訓(xùn)練降低自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）的動(dòng)脈收縮壓，下調(diào)RAAS的血管收縮軸進(jìn)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用，并且這些益處是可持續(xù)的。付常喜等人研究顯示［7］，8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后自發(fā)性高血壓大鼠有氧運(yùn)動(dòng)組的TGF-β和CTGF蛋白表達(dá)量下調(diào)，提示規(guī)律運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練至少部分通過抑制TGF-β信號(hào)通路改善高血壓誘導(dǎo)的腎臟纖維化。綜上，有氧運(yùn)動(dòng)可以下調(diào)RAAS的血管收縮軸，抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)活性。本研究旨在探討在持續(xù)有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練干預(yù)下，腎臟中的血管緊張素Ⅱ含量的變化，血管緊張素Ⅱ-血管緊張素1型受體-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（AngⅡ-AT1R-TGF-β）通路的表達(dá)是否會(huì)隨之下調(diào)，并對(duì)比低、中有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）腎臟纖維化影響的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

8周齡雄性SHR和同齡Wistar京都大鼠（WKY），均為SPF級(jí)，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2019-0009）。將大鼠隨機(jī)分為4組（n=6）：安靜WKY對(duì)照組（WKY-S）、安靜SHR對(duì)照組（SHR-S）、低強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（SHR-L）和中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（SHRM）。重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（渝）2018-0003）統(tǒng)一飼養(yǎng)，每籠約5只，室溫約22℃，正常光照周期（晝夜12∶12 h），濕度保持40%～45%，飲用水和飼料自由獲取，所有實(shí)驗(yàn)環(huán)境達(dá)到特定的無病原體（SPF級(jí)）。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與運(yùn)動(dòng)方案

根據(jù)《心血管研究動(dòng)物運(yùn)動(dòng)和訓(xùn)練方案指南》［8］的要求，運(yùn)動(dòng)組大鼠經(jīng)過一周的適應(yīng)性訓(xùn)練后，SHR-L組、SHR-M組分別以14 m/min（最大有氧速度的35%）、20 m/min（最大有氧速度的50%）在0°坡度的運(yùn)動(dòng)跑步機(jī)上跑步［9］。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練組運(yùn)動(dòng)負(fù)荷為每天跑步60 min，每周跑步5 d，共14周。大鼠運(yùn)動(dòng)結(jié)束后72 h的上午，進(jìn)行血壓、心率測(cè)定（避免急性運(yùn)動(dòng)的影響），三次測(cè)量結(jié)果計(jì)算平均值，之后取血和腎臟。

1.3 實(shí)驗(yàn)取材與檢測(cè)指標(biāo)

實(shí)驗(yàn)14周后，所有實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行血壓、心率測(cè)定后，稱重，腹腔注射1%戊巴比妥麻醉。采用眼眶取血法，1 500 r/min離心10 min，分離血清，-80℃凍存。氧化酶法測(cè)定血清肌酐（serum creatinine，SCr），尿素酶-谷氨酸脫氫酶法測(cè)定血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）。對(duì)大鼠實(shí)施安樂死，取出腎臟，剝離筋膜后將腎臟分為兩部分，一部分用多聚甲醛浸泡固定后待切片病理組織學(xué)觀察，采用蘇木精與伊紅（HE）染色觀察腎組織形態(tài)，Masson染色觀察腎組織膠原沉積情況，計(jì)算腎臟膠原容積分?jǐn)?shù)；另一部分腎臟用凍存管儲(chǔ)存并迅速轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱凍存，待Western blot檢測(cè)腎臟AngⅡ、AT1R、TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達(dá)。

1.4 血壓心率測(cè)定

智能無創(chuàng)血壓計(jì)-Softron BP-2010系列血壓計(jì)，測(cè)定尾動(dòng)脈收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、心率（heart rate，HR）。

1.5 腎臟病理組織學(xué)觀察

腎臟病理組織學(xué)觀察組織用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋并利用病理切片機(jī)（RM2255，德國）制作4μm切片。用蘇木精與伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)，Masson染色膠原纖維，正置相差顯微鏡（Leica DM4B，德國）下選取10個(gè)視野，觀察膠原沉積情況，用圖像分析軟件（ImageJ 1.52v，美國）測(cè)量結(jié)締組織面積與所測(cè)視野面積的比值作為膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volumetric fraction，CVF）。

1.6 蛋白表達(dá)量檢測(cè)

利用Western blot法檢測(cè)腎臟AngⅡ、AT1R、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、TGF-β和CTGF蛋白表達(dá)量。分離腎皮質(zhì)，勻漿后提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。取50μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)7.5%SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。兔抗鼠一抗4℃靜置孵育過夜，羊抗兔二抗37℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL發(fā)光成像，利用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并掃描各條帶灰度值。將各組與GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 有氧運(yùn)動(dòng)后SHR大鼠血壓水平變化

與WKY-S組比較，SHR-S組SBP、DBP和MAP均顯著性升高（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組血壓水平降低（P＜0.05），SHR-M組血壓水平降低相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，表1）。

2.2 有氧運(yùn)動(dòng)后SHR大鼠腎臟功能變化

腎臟功能檢測(cè)顯示，與WKY-S組比較，SHR-S組BUN和SCr升高（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組BUN和SCr下降（P＜0.05），SHR-M組BUN和SCr下降水平相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，表1）。

Tab.1 Changes of blood pressure and kidney function of SHR after aerobic exercise（±s，n=6）

Tab.1 Changes of blood pressure and kidney function of SHR after aerobic exercise（±s，n=6）

SBP：Systolic blood pressure；DBP：Diastolic blood pressure；MBP：Mean arterial pressure；Scr：Serum creatinine；BUN：Blood urea nitrogen；WKY-S：Sedentary wistar kyoto rats；SHR-S：Sedentary spontaneously hypertensive rats *P＜0.05 vs WKY-S；#P＜0.05 vs SHR-S；▲P＜0.05 vs SHR-L

Group SBP（mmHg） DBP（mmHg） MBP（mmHg） Scr（mol/L） BUN（mmol/L）WKY-S 108.6±5.42 82.0±4.07 90.6±4.53 29.79±2.51 6.09±0.55 SHR-S 154.0±11.01* 124.9±10.13* 134.5±5.43* 51.14±4.46* 10.71±0.73*SHR-L 141.3±10.42# 113.6±7.82# 123.3±8.31# 40.35±6.89# 8.28±0.37#SHR-M 125.6±10.72#▲ 95.3±6.50#▲ 102.9±5.00#▲ 30.69±2.01#▲ 5.94±0.89#▲

2.3 腎臟組織病理學(xué)觀察與膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）

四組大鼠腎臟HE染色與Masson染色顯示病理變化見圖1，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞呈紅色，膠原纖維呈藍(lán)色。WKY-S組腎小球和腎小管形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)中僅有少量膠原纖維；SHR-S組腎小球萎縮，腎小管管腔擴(kuò)張，間質(zhì)增厚并存在大量膠原纖維，CVF高于WKY-S組（P＜0.05）；SHR-L組和SHR-M組腎小球、腎小管病變減輕，膠原纖維減少，CVF較SHR-S組分別降低（P＜0.05）。SHR-M組膠原纖維減少相較SHR-L組更明顯（表2）。

Fig.1 HE and Masson staining in renal tissues of rats in each group

2.4 AngⅡ、AT1R蛋白表達(dá)量的變化

與WKY-S組比較，SHR-S組AngⅡ、AT1R蛋白表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組AngⅡ、AT1R蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），SHR-M組AngⅡ、AT1R蛋白表達(dá)下調(diào)相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，圖2，表2）。

Fig.2 AngⅡand AT1R protein expressions in renal tissues of rats in each group

Tab.2 The levels of SHBG and LPSin rats（±s，n=10）

Tab.2 The levels of SHBG and LPSin rats（±s，n=10）

*P＜0.05 vs WKY-S；#P＜0.05 vs SHR-S；▲P＜0.05 vs SHR-L

Group Ang II AT1R Collagen volumetric fraction（%）WKY-S 1.00±0.08 1.00±0.22 3.34±1.82 SHR-S 3.05±0.22*4.53±0.60* 12.96±5.44*SHR-L 1.85±0.30#2.25±0.20# 6.72±2.37#SHR-M 1.44±0.28#▲1.27±0.24#▲ 3.56±1.36#▲

2.5 TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達(dá)量的變化

與WKY-S組比較，SHR-S組TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達(dá)量上調(diào)（P＜0.05）；與SHR-S組比較，SHR-L組和SHR-M組TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），SHR-M組TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達(dá)下調(diào)相較SHR-L組更明顯（P＜0.05，圖3，表3）。

Fig.3 Expressions ofα-SMA，TGF-β，CTGF protein in renal tissues of rats in each group

Tab.3 The protein levels ofα-SMA，TGF-βand CTGF（±s，n=6）

Tab.3 The protein levels ofα-SMA，TGF-βand CTGF（±s，n=6）

*P＜0.05 vs WKY-S；#P＜0.05 vs SHR-S；▲P＜0.05 vs SHR-L

Group α-SMA TGF-β CTGF WKY-S 1.00±0.11 1.00±0.11 1.00±0.23 SHR-S 2.05±0.22*4.49±0.41*4.30±0.45*SHR-L 1.47±0.17#2.47±0.17#2.73±0.61#SHR-M 1.26±0.14#▲1.26±0.11#▲1.05±0.20#▲

3 討論

本研究結(jié)果表明：（1）14周的規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)可以降低SHR血壓，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)降血壓效果更明顯。（2）SHR腎功能發(fā)生損傷，14周規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以減輕SHR腎損傷程度且中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)較低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)減輕腎損傷的作用更顯著。（3）SHR出現(xiàn)腎纖維化，經(jīng)過14周的規(guī)律有氧運(yùn)動(dòng)減輕了腎纖維化程度，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)較低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)減輕腎纖維化的效果更明顯。（4）運(yùn)動(dòng)后SHR腎臟AngⅡ-AT1R-TGF-β促纖維化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受到抑制，AngⅡ、AT1R、TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達(dá)下調(diào)，且中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)組較低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)組下調(diào)效果更明顯。

運(yùn)動(dòng)可以改善高血壓狀態(tài)，且本研究在設(shè)置不同強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)中顯示，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)組的降血壓效果更明顯。其他相關(guān)研究對(duì)此有相同性結(jié)論：竇麗的研究表明［10］持續(xù)有規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR的降壓效果持續(xù)有效，且堅(jiān)持運(yùn)動(dòng)數(shù)周后降壓效果更明顯。腎素-醛固酮-血管緊張素系統(tǒng)（RAAS）活化會(huì)促進(jìn)血管緊張素Ⅱ的血管收縮作用升高血壓［11］。李曄研究表明［12］長(zhǎng)期中等強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR大鼠血漿、胸主動(dòng)脈、心臟和腎臟的內(nèi)皮素-1和血管緊張素Ⅱ的分泌均有明顯的下調(diào)作用，提示有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)SHR的降壓作用是通過影響內(nèi)皮素-1和血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生和釋放來實(shí)現(xiàn)的。黃超清等人［13］通過12周的運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)，闡釋了運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能有效降低SHR的血壓和SHR腎損害的嚴(yán)重程度；Almeida，J.A等人［14］研究發(fā)現(xiàn)，高強(qiáng)度間歇有氧訓(xùn)練可降低SHR的血壓。本實(shí)驗(yàn)在有氧運(yùn)動(dòng)可以下調(diào)AngⅡ活性的假設(shè)前提下，試圖闡明有氧運(yùn)動(dòng)可以通過抵抗AngⅡ的血管收縮作用來降低血壓，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腎臟中AngⅡ表達(dá)量降低和SHR的血壓下降明顯相關(guān)。本研究表明規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)可以減輕SHR腎損傷程度，且中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)較低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)減輕腎損傷的作用更顯著。但是牛衍龍等人［15］的研究表明，大鼠6周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練后腎功能受損，出現(xiàn)蛋白尿，此現(xiàn)象的可能原因?yàn)檫^度訓(xùn)練誘導(dǎo)腎臟內(nèi)部及循環(huán)系統(tǒng)中RAAS持續(xù)興奮，下調(diào)Nephrin蛋白的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)與功能異常。

通過組織病理學(xué)觀察和膠原容積分?jǐn)?shù)分析，我們發(fā)現(xiàn)SHR出現(xiàn)腎纖維化，經(jīng)過14周規(guī)律的有氧運(yùn)動(dòng)減輕腎纖維化程度，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)較低強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)減輕腎纖維化的效果更明顯。TGF-β通路被激活促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transdifferentiation，EMT），從而促進(jìn)AngⅡ誘導(dǎo)腎臟纖維化［16］。AngⅡ作為促纖維化細(xì)胞因子，通過EMT有關(guān)的各種途徑調(diào)節(jié)腎細(xì)胞的增殖，細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的下游靶標(biāo)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）的表達(dá)［17］。Silva SD等人［6］實(shí)驗(yàn)研究表明有氧運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以通過下調(diào)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的活性，特異性降低SHR腎血管AngⅡ含量來降低血壓和改善腎臟纖維化。Ciampone S等人研究表明［18］，長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)對(duì)AngⅡ受體表達(dá)產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，可以使腎臟中AT1R表達(dá)降低。在以上研究基礎(chǔ)上，本研究重點(diǎn)關(guān)注運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的差異對(duì)SHR腎纖維化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)更有利于下調(diào)RAAS活性，降低SHR腎血管AngⅡ含量，減少通路下游血管緊張素Ⅰ型受體（AT1R）和AngⅡ的結(jié)合，抑制AngⅡ-AT1R-TGF-β通路上游的傳導(dǎo)，從而延緩SHR腎纖維化的發(fā)展進(jìn)程。

王欣彤［19］在實(shí)驗(yàn)研究中闡明血管緊張素Ⅱ-血管緊張素1型受體-結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（AngⅡ-AT1R-CTGF）的過度活躍是高血壓腎損害的重要原因，阻斷其中任何一個(gè)因子，不僅可以降血壓，而且還有腎臟保護(hù)作用。付常喜等人研究顯示［7］8周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)后SHR有氧運(yùn)動(dòng)組的TGF-β和CTGF蛋白表達(dá)量下調(diào)，從而改善高血壓誘導(dǎo)的腎臟纖維化。12周運(yùn)動(dòng)跑臺(tái)訓(xùn)練通過降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGFβ），磷酸化-Smad2/3（p-Smad2/3）的表達(dá)，減弱結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）纖維化途徑，改善高血壓腎纖維化程度［13］。本研究設(shè)定低、中強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度梯度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，中等強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)更明顯地降低SHR的TGF-β、α-SMA、CTGF蛋白表達(dá)，提示AngⅡ-AT1R-TGF-β信號(hào)通路被抑制，有效地減輕SHR的腎纖維化。但是Almeida JA等人［14］研究發(fā)現(xiàn)，8周高強(qiáng)度間歇有氧訓(xùn)練可降低SHR的血壓并下調(diào)RAAS活性。以上研究結(jié)果的差異可能與運(yùn)動(dòng)類型不同有關(guān)，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證。

本課題組前期研究證明［9］，低中強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以激活SIRT1/3-AMPK通路，延緩SHR的病理生理進(jìn)展，降低血壓，改善血管功能。SIRT1/3-AMPK通路激活可以對(duì)抗纖維化［20］，我們推測(cè)運(yùn)動(dòng)改善腎纖維化可能與SIRT1/3-AMPK通路有關(guān)，下一步準(zhǔn)備進(jìn)行驗(yàn)證。本次研究只設(shè)計(jì)低中強(qiáng)度有氧運(yùn)動(dòng)組的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，對(duì)其他不同運(yùn)動(dòng)類型、不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度比如高強(qiáng)度或高強(qiáng)度間歇性運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓腎損害影響的作用效果與機(jī)制，還有待科研人員開展進(jìn)一步的研究，為臨床醫(yī)學(xué)疾病治療提供更全面、完整的參考依據(jù)。

綜上所述，AngⅡ-AT1R-TGF-β通路的過度活躍會(huì)導(dǎo)致SHR腎纖維化、腎功能進(jìn)行性下降；有氧運(yùn)動(dòng)可以通過下調(diào)AngⅡ-AT1R-TGF-β信號(hào)通路抑制高血壓腎病大鼠腎臟纖維化并提高腎功能；中等強(qiáng)度的有氧運(yùn)動(dòng)可以更好地改善SHR腎功能損害、抑制SHR腎纖維化。