關(guān)東如，方 明，朱嫚子，王 克，崔 勇，柏友萍△

（1.安徽師范大學(xué)體育學(xué)院，蕪湖 241000；2.青島體育事業(yè)發(fā)展中心，山東 青島 266071；3.皖南醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241003）

Ras相關(guān)蛋白5（Ras-related proteins 5，Rab5）因其在機(jī)體代謝的重要作用受到廣泛關(guān)注，Rab5蛋白是Rab蛋白家族的成員之一，是早期胞吞途徑中一個重要的限速成分，在骨骼肌、肝臟和心臟等多組織均有表達(dá)。相關(guān)研究表明，Rab5參與調(diào)節(jié)細(xì)胞膜上葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（glucose transporte 4，GLUT4）的轉(zhuǎn)運(yùn)，GLUT4是骨骼肌葡萄糖發(fā)生轉(zhuǎn)運(yùn)的主要蛋白，僅位于肌肉和脂肪的胰島素敏感組織中。Rab5表達(dá)減少可能造成外周GLUT4的轉(zhuǎn)錄和翻譯能力降低，引起組織糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而引起血糖升高［1］。

規(guī)律性運(yùn)動可增加胰島素敏感性、提高骨骼肌質(zhì)量并增強(qiáng)其糖脂代謝能力，改善2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）患者體成分及骨骼肌病理損傷［2］。骨骼肌作為運(yùn)動的主要功能器官，占人體總比重40%左右，攝取和代謝機(jī)體約80%的葡萄糖，因此，深入研究骨骼肌對于揭示T2DM狀態(tài)下骨骼肌代謝紊亂尤為重要［3］。目前，有關(guān)運(yùn)動是否可以通過影響骨骼肌Rab5轉(zhuǎn)錄與翻譯，進(jìn)而影響骨骼肌GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)能力及調(diào)控血漿Rab5含量，發(fā)揮對T2DM保護(hù)作用的問題目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究中，以運(yùn)動為平臺，通過建立相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停谶\(yùn)動對肥胖、機(jī)體IR、糖脂代謝等方面的影響進(jìn)行多方面研究，為本研究奠定良好的基礎(chǔ)［4，5］。因此，本研究設(shè)計持續(xù)運(yùn)動、間歇負(fù)重運(yùn)動兩種不同的運(yùn)動方案進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，探討其不同運(yùn)動方式對2型糖尿病大鼠骨骼肌Rab5及糖代謝的影響，旨在為優(yōu)選T2DM運(yùn)動療法提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

STZ購自美國Sigma公司；RAB5A Antibody購自美國Proteintech公司；山羊抗兔IgG HL購自美國Abcam公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；GLUT4 Polyclonal Antibody購自中國Abclonal公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天公司；GHb ELISA試劑盒購自美國研域公司；RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Fermentas公司；Rab5 ELISA試劑盒購自美國研域公司；TEMED購自中國碧云天公司。

1.2 T2DM建模與分組

購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司（許可證：SCXK（滬）2018-0006）的雄性7周齡SPF級SD幼鼠。分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水。進(jìn)行3 d的適應(yīng)喂養(yǎng)，隨機(jī)選取8只為空白對照組（CR），普食喂養(yǎng)；其余為實(shí)驗(yàn)組，高脂高糖喂養(yǎng)，喂養(yǎng)6周后，實(shí)驗(yàn)組禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ，72 h后采用羅氏血糖儀（YZB-GER/5513-2014，德國）測隨機(jī)血糖，隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L為糖尿病建模成功。選取T2DM大鼠24只，按組間血糖無差異原則（P＞0.05）分為3組，每組8只，組別（簡寫）：糖尿病模型組（DRM）、持續(xù)運(yùn)動組（DCRE）、間歇負(fù)重運(yùn)動組（DWRE）。所有實(shí)驗(yàn)動物的操作均符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》要求，獲得安徽師范大學(xué)動物保護(hù)和倫理委員會批準(zhǔn)（2020023）。

1.3 運(yùn)動方案

本次運(yùn)動方案設(shè)計以本實(shí)驗(yàn)室前期運(yùn)動方案為基礎(chǔ)，針對T2DM大鼠的運(yùn)動能力進(jìn)行設(shè)計與實(shí)施。運(yùn)動采用大鼠跑臺訓(xùn)練（安徽正華，中國），進(jìn)行適應(yīng)性練習(xí)4 d，每天3～5次，跑臺坡度為0°，負(fù)重跑步訓(xùn)練器由本實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計（專利號：ZL 2019 2 1996838.5）。持續(xù)運(yùn)動方案：前1～2周采用準(zhǔn)備活動15 m/min（10 min）、運(yùn)動20 m/min（40 min）、整理活動15 m/min（10 min），后3～8周為18 m/min（10 min）、25 m/min（40 min）、15 m/min（10 min）；間歇負(fù)重運(yùn)動方案：采用1～2周負(fù)荷重量15%、3～4周為30%、5～8周為45%，運(yùn)動均為15 m/min（5 min），共12組，組間休息3 min，負(fù)荷重量百分比=負(fù)重重量/大鼠體重×100%。

1.4 樣本采集與處理

末次運(yùn)動結(jié)束后，每組大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（3.0 ml/kg）進(jìn)行麻醉，取腹主動脈血，保存于-80℃的冰箱中待測Rab5和GHb濃度；采集大鼠腓腸肌組織分裝在已滅菌的EP管中放-80℃保存，用于大鼠骨骼肌組織Rab5、GLUT4 mRNA和Rab5蛋白的測定。每組隨機(jī)留取1只大鼠施以灌注固定，用于HE染色觀察骨骼肌組織形態(tài)學(xué)變化，免疫熒光組化測定Rab5蛋白。

1.5 HE染色測骨骼肌組織形態(tài)和免疫熒光組化測骨骼肌Rab5蛋白表達(dá)

選取大鼠后腿腓腸肌組織用多聚甲醛固定、脫水、洗脫、包埋及切片（4μm）。HE染色選擇骨骼肌的切片脫蠟、洗滌及酒精梯度脫水，蘇木素-伊紅滴染，二甲苯透明處理封片，光學(xué)顯微鏡（Olympus/BX43日本）拍片。免疫熒光組化測骨骼肌Rab5蛋白表達(dá)：選擇骨骼肌切片，經(jīng)過脫蠟和水化，PBS漂洗，枸櫞酸緩沖液中經(jīng)不同時間高火和低火進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻PBS漂洗。PBT打孔，加入熒光封閉液，敷Rab5抗體（一抗），4℃過夜，二抗孵育，PBS漂洗，滴入抗衰劑，封片，共聚焦顯微鏡（LAICA/SP8 M德國）及配套軟件進(jìn)行圖像的拍攝。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR測骨骼肌Rab5與GLUT4 mRNA表達(dá)

骨骼肌組織用液氮研磨后，分別用Trizol、氯仿、異丙醇等試劑提取組織總RNA，RNA定量后按照試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Rab5與GLUT4引物序列見表1，以熒光定量PCR儀（西安天隆/TL988 中國）檢測，β-actin為內(nèi)參引物，△Ct=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），以2-△Ct進(jìn)行分析（計算相對量，結(jié)果擴(kuò)大1 000倍）。

Tab.1 Primer sequences for real-time PCR

1.7 Western blot測骨骼肌Rab5蛋白表達(dá)

組織用液氮研磨后，用RIPA裂解液（RIPA∶PMSF=99∶1）冰上裂解30 min，蛋白樣品定量變形后，SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，而后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。滴加Rab5抗體，在4℃條件下孵育過夜，TBST清洗，每次10 min，清洗3次，敷二抗，室溫孵育1 h，ECL極超敏發(fā)光液，A∶B=1∶1，將配制的發(fā)光液滴在PVDF膜上，用凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照，采用Image J灰度分析軟件進(jìn)行圖像定量分析，將目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值作為蛋白表達(dá)量。

1.8 ELISA測血漿Rab5與GHb濃度

嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，結(jié)束后立即放入酶標(biāo)儀中，在450 nm波長處測定各孔OD值，Rab5的線性回歸方程為y=0.018+0.034x（ng/ml），相關(guān)系數(shù)R=0.999；GHb回歸方程為y=0.008+0.001x（ng/ml），相關(guān)系數(shù)R=0.998，將方程輸入SPSS 21.0軟件中，得到相應(yīng)的濃度值，再將濃度值擴(kuò)大5倍得到樣本實(shí)際濃度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩種運(yùn)動方式對T2DM大鼠骨骼肌病理形態(tài)的影響

CR骨骼肌細(xì)胞形態(tài)正常，肌外膜完好，肌纖維排列規(guī)則，細(xì)胞間間隙清晰，組織結(jié)構(gòu)完整；與CR相比，DRM骨骼肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變，出現(xiàn)骨骼肌肌纖維面積縮小，細(xì)胞間隙增大，結(jié)締組織增多，個別細(xì)胞存在腫大，表現(xiàn)出病理性損傷；與DRM相比，DCRE和DWRE的骨骼肌肌纖維面積有所增加，細(xì)胞間隙變小，結(jié)締組織有所減少，骨骼肌組織形態(tài)明顯改善（圖1）。

Fig.1 Comparison of HE staining in skeletal muscle among groups（×200）

2.2 兩種運(yùn)動方式對T2DM大鼠骨骼肌Rab5免疫熒光蛋白表達(dá)的影響

各組別Rab5熒光蛋白表達(dá)均位于肌細(xì)胞膜上；與CR相比，DRM熒光表達(dá)量顯著較低，亮度強(qiáng)度減弱，蛋白表達(dá)減少；與DRM相比，DCRE、DWRE熒光表達(dá)量增多，亮度有所增強(qiáng)，蛋白表達(dá)量有所提高（圖2）。

Fig.2 Comparison of Rab5 fluorescence expression in skeletal muscle among groups（×200）

2.3 兩種運(yùn)動方式對T2DM大鼠骨骼肌Rab5 mRNA和蛋白表達(dá)及血漿Rab5濃度的影響

骨骼肌Rab5 mRNA表達(dá)：與CR相比，DRM顯著降低（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE顯著增高（P＜0.01），DWRE顯著增高（P＜0.05）；DCRE高于DWRE，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表2）。

骨骼肌Rab5蛋白表達(dá)：與CR相比，DRM Rab5蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE、DWRE Rab5蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05），DCRE和DWRE之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表2，圖3）。

血漿Rab5濃度：與CR相比，DRM顯著升高（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE和DWRE血漿Rab5濃度均顯著降低（P＜0.01）；DWRE血漿Rab5濃度低于DCRE，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表2）。

Tab.2 Comparison of the Rab5 mRNA and protein expressions in skeletal muscle，and plasma Rab5 concentration among groups（±s）

Tab.2 Comparison of the Rab5 mRNA and protein expressions in skeletal muscle，and plasma Rab5 concentration among groups（±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs CR；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DRM

Group Rab5 2-Δct（n=6）Rab5（n=5）Rab5（ng/ml）（n=6）CR 173.78±45.70 1 13.109±0.97 DRM 110.88±28.84**0.86±0.05**17.584±2.13**DCRE 191.80±45.27##0.97±0.08#13.908±1.35##DWRE 161.68±27.49#0.97±0.07#13.161±1.53##

Fig.3 Comparison of Rab5 protein expression in skeletal muscle among groups（n=5）

2.4 兩種運(yùn)動方式對T2DM大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)和血漿GHb濃度的影響

骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)：與CR相比，DRM GLUT4mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE和DWRE GLUT4 mRNA表達(dá)均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），DCRE和DWRE之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

血漿GHb濃度：與CR相比，DRM血漿GHb濃度顯著升高（P＜0.01）；與DRM相比，DCRE和DWRE血漿GHb濃度均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；DWRE血漿GHb濃度低于DCRE，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05，表3）

Tab.3 Comparison of GLUT4 mRNA expressions in skeletal muscle among groups（±s，n=6）

Tab.3 Comparison of GLUT4 mRNA expressions in skeletal muscle among groups（±s，n=6）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs CR；#P＜0.05，##P＜0.01 vs DRM

Group GLUT4 2-Δct GHb（ng/ml） CR 247.54±78.31 729.29±136.06 DRM 103.47±24.70** 1025.00±60.90**DCRE 210.81±75.69# 922.86±34.62#DWRE 225.27±82.65## 896.43±73.64##

3 討論

骨骼肌作為糖消耗的主要組織，也是T2DM高糖狀態(tài)下?lián)p害的重要靶位，深入研究其疾病狀態(tài)下病理形態(tài)對于闡明糖尿病發(fā)生發(fā)展有著重要病理意義［6］。本實(shí)驗(yàn)的骨骼肌HE染色表明：T2DM大鼠骨骼肌組織結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微改變，出現(xiàn)骨骼肌肌纖維面積縮小，細(xì)胞間隙增大，結(jié)締組織增多，個別細(xì)胞存在腫大，表現(xiàn)出病理性損傷。8周的持續(xù)運(yùn)動和間歇負(fù)重運(yùn)動均可改善T2DM大鼠骨骼肌病理損傷，兩種運(yùn)動方式之間無明顯的優(yōu)劣。

T2DM骨骼肌轉(zhuǎn)錄水平和代謝組學(xué)均發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后翻譯水平改變骨骼肌的蛋白合成而影響骨骼肌重塑、減少糖攝取，最終影響糖脂代謝和運(yùn)動能力［7］。在骨骼肌中，有眾多相關(guān)蛋白影響骨骼肌對糖、脂吸收和利用，影響機(jī)體代謝進(jìn)程。其中有關(guān)Ras酶超家族成員之一的Rab5蛋白對機(jī)體代謝影響的研究備受關(guān)注。它類屬GTP酶，被認(rèn)為是最早參與蛋白分選和維持胞內(nèi)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的成員，在骨骼肌、肝臟等代謝組織中均有表達(dá)，調(diào)控機(jī)體代謝穩(wěn)態(tài)過程［8］。代謝組學(xué)及相關(guān)機(jī)制研究表明：Rab5含量下降或功能發(fā)揮異常，會影響信號的正常傳遞，導(dǎo)致葡萄糖利用率降低進(jìn)而出現(xiàn)胰島素抵抗（insulin resistance，IR）；敲除骨骼肌中Rab5基因，骨骼肌感應(yīng)胰島素能力減弱，出現(xiàn)IR和葡萄糖不耐受等代謝失衡癥狀［9］；Rab5在骨骼肌再生修復(fù)中參與調(diào)控胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）信號傳導(dǎo)，協(xié)調(diào)骨骼肌內(nèi)胰島素敏感性和代謝活動［10，11］。因此，根據(jù)已查閱相關(guān)文獻(xiàn)可以證明，Rab5是骨骼肌和葡萄糖代謝的重要蛋白。

有關(guān)在T2DM骨骼肌中Rab5含量變化的研究鮮有報道，因此，在本研究免疫熒光技術(shù)觀察Rab5在骨骼肌肌細(xì)胞中定位的結(jié)果表明，活化的Rab5存在于肌細(xì)胞胞膜中，且在T2DM大鼠中，骨骼肌Rab5蛋白明顯降低，這提示高糖狀態(tài)下Rab5的含量已經(jīng)發(fā)生改變。在此基礎(chǔ)上，本研究又通過qRTPCR及Western blot技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明三者在一定程度上具有相似性。Rab5在T2DM大鼠骨骼肌中的蛋白表達(dá)下降，可能參與調(diào)節(jié)骨骼肌糖代謝。據(jù)報道Rab5與GLUT4關(guān)系密切，Rab5參與調(diào)控GLUT4從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外膜并與之相互融合的過程［12］。因此，本研究推測在T2DM中，骨骼肌Rab5含量降低可能影響GLUT4表達(dá)出現(xiàn)異常?；谶@一假設(shè)，本研究通過檢測大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)發(fā)現(xiàn)：在T2DM骨骼肌中，GLUT4基因表達(dá)顯著降低。因此，該結(jié)果提示，在高糖狀態(tài)下骨骼肌Rab5含量降低可能是導(dǎo)致GLUT4表達(dá)量減少的重要原因，進(jìn)而引起葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能力出現(xiàn)障礙，糖代謝出現(xiàn)紊亂。

相關(guān)研究顯示，運(yùn)動可以通過調(diào)控骨骼肌GLUT4水平，改變骨骼肌代謝能力，在該環(huán)節(jié)中，運(yùn)動通過提高或抑制諸多骨骼肌中與糖代謝有關(guān)的蛋白含量成為GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)的關(guān)鍵因素。例如，Blüher等［13］研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動可能通過磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine 5′-monophosphate（AMP）-activated protein kinase，AMPK）相關(guān)途徑提高GLUT4的表達(dá)，增強(qiáng)骨骼肌組織葡萄糖的攝取和利用及脂肪酸的氧化，改善IR。Sylow等［14］研究發(fā)現(xiàn)，GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)水平的提高，可能是通過運(yùn)動刺激小鼠Rac1水平升高從而增強(qiáng)骨骼肌對葡萄糖的攝取。張新霞［15］采用運(yùn)動療法后發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，這可能是通過抑制FOXO1實(shí)現(xiàn)對T2DM大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng)的緩解。在本實(shí)驗(yàn)中，通過8周持續(xù)運(yùn)動和間歇負(fù)重運(yùn)動均提高T2DM大鼠骨骼肌Rab5基因及蛋白表達(dá)，同時也可提高骨骼肌GLUT4 mRNA表達(dá)。該結(jié)果表明，Rab5可能是不同運(yùn)動方式提高骨骼肌GLUT4含量的關(guān)鍵蛋白。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證運(yùn)動提高Rab5蛋白表達(dá)并增強(qiáng)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)能力對機(jī)體血糖水平的影響。本研究選取糖化血紅蛋白（glycosylated hemoglobin A1c，GHb）作為機(jī)體血糖水平指標(biāo)，GHb短期變異性較低，不受降糖藥物、空腹、抽血時間等影響，可反映2～3個月的血漿葡萄糖平均水平，被視為臨床評估血糖控制的“金標(biāo)準(zhǔn)”，對及時了解糖尿病患者血脂及血糖水平有著重要價值［16，17］。本實(shí)驗(yàn)中，T2DM大鼠血漿GHb濃度明顯增加，而在8周持續(xù)運(yùn)動和間歇負(fù)重運(yùn)動中均明顯減少血漿GHb濃度，說明持續(xù)運(yùn)動與間歇負(fù)重運(yùn)動均能降低機(jī)體的高血糖水平，但兩種運(yùn)動方式對降糖的作用尚未見明顯的差異性。

本實(shí)驗(yàn)T2DM大鼠血漿中Rab5濃度明顯升高，血漿Rab5濃度與骨骼肌Rab5的基因與蛋白表達(dá)呈現(xiàn)不一致性，有關(guān)血漿Rab5濃度改變的文獻(xiàn)相對較少，尤其在T2DM的機(jī)體中。其原因可能是在高血糖狀態(tài)下，機(jī)體代謝紊亂導(dǎo)致血漿Rab5濃度增高，機(jī)體對應(yīng)激狀態(tài)的代償性反應(yīng)，具體原因有待于進(jìn)一步研究。通過8周的持續(xù)運(yùn)動與間歇負(fù)重運(yùn)動均降低血漿Rab5濃度，兩種運(yùn)動方式之間對Rab5濃度的影響沒有明顯的差異。運(yùn)動可使T2DM血漿Rab5濃度趨于正常，這可能與該干預(yù)方式緩解高糖狀態(tài)下機(jī)體代謝紊亂有關(guān)，但還需要后期進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)加以證明。

綜上所述，持續(xù)運(yùn)動和間歇負(fù)重運(yùn)動均能提高T2DM大鼠骨骼肌Rab5的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，增強(qiáng)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)能力，減輕高血糖引起的骨骼肌肌纖維損傷。本研究結(jié)果表明，運(yùn)動可能通過提高骨骼肌Rab5的蛋白表達(dá)，在緩解T2DM大鼠骨骼肌糖代謝穩(wěn)態(tài)失衡過程中發(fā)揮一定的作用，但兩種運(yùn)動方式對其影響未見明顯差異。