崔雪雪 張智慧 吳凌子 栗勇濤 陳爽 陳努 張曉敏

天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼視光學(xué)院 天津醫(yī)科大學(xué)眼科研究所 國家眼耳鼻喉疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心天津市分中心 天津市視網(wǎng)膜功能與疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384

自身免疫性葡萄膜炎是一類嚴(yán)重威脅視力且發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚的炎癥性眼病。由CD4+T細(xì)胞功能紊亂引起的眼內(nèi)炎癥反應(yīng)被認(rèn)為在葡萄膜炎的發(fā)生和發(fā)展過程中起到關(guān)鍵作用。人和實(shí)驗(yàn)小鼠組織特異的炎癥部位均有白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A+γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)+CD4+T細(xì)胞存在，這種細(xì)胞具有低細(xì)胞毒性、高致病性以及對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)低敏感性等特征[1]，已成為治療多種自身免疫性疾病，如炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、復(fù)發(fā)性葡萄膜炎的新靶點(diǎn)[2-5]。白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的形成是多種細(xì)胞因子作用的復(fù)雜過程，IL-12和IL-23在其中起到重要作用[6-7]。IL-12(p35和p40的異源二聚體)和IL-23(p19和p40的異源二聚體)具有共同亞基p40，針對p40亞基的單克隆抗體可以抑制IL-12R和IL-23R介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8-9]。Anti-IL-12/IL-23 p40單克隆抗體臨床上已用于治療慢性炎癥性疾病，如銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎和克羅恩病，并顯示出顯著療效[10-13]，但其在自身免疫性葡萄膜炎患者及實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis，EAU)動物模型中的作用研究較少。本研究擬探討IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞在EAU發(fā)病中的動態(tài)變化，以及Anti-IL-12/IL-23 p40抗體對EAU的治療作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康無眼疾6～8周齡C57BL/6N雌鼠66只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司[合格證號：SCXK(京)2016-0006]，飼養(yǎng)于天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院動物房，室溫(23±2)℃，相對濕度為50%～60%，光照強(qiáng)度不超過300 lx，12 h晝夜規(guī)律循環(huán)。實(shí)驗(yàn)小鼠的喂養(yǎng)及使用遵循美國視覺與眼科學(xué)研究協(xié)會制定的ARVO聲明，本研究方案經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批文號：TJYY2019111019)。

1.1.2主要試劑及儀器 光感受器維生素A類結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein，IRBP)651-670(上海生物工程有限公司)；完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；百日咳毒素(美國List Labs公司)；CD4細(xì)胞分離試劑盒(美國英杰生命技術(shù)有限公司)；EZ-press RNA純化試劑盒(美國EZBioscience公司)；FastStart Universal SYBR Green Master(瑞士Roche公司)；抗鼠IL-12/IL-23 p40單克隆抗體、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(16712381，美國Thermo Fisher公司)；大鼠IgG(上海賽默飛世爾科技有限公司)；布雷菲德菌素A、離子霉素(美國Med ChemExpress公司)；佛波酯(英國Abcam公司)；抗鼠APC-CD4單克隆抗體(100412)、抗鼠PE-IL-17A單克隆抗體(506903)、抗鼠FITC-IFN-γ單克隆抗體(505806)、抗鼠Brilliant Violet 421TM-CD3單克隆抗體(100228)(美國Biolegend公司)。小動物成像儀(美國Pleasanton公司)；流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；PCR儀(美國Life Technologies公司)。

1.2 方法

1.2.1EAU模型的建立 采用文獻(xiàn)[14]的方法在小鼠的足墊部、尾根部、軀干共6個(gè)點(diǎn)皮下注射人IRBP 651-670(250 μg/只)和完全弗氏佐劑乳化液(200 μl/只)。免疫前及免疫后24 h分別腹腔內(nèi)注射百日咳毒素0.5 μg作為附加免疫佐劑。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測EAU病程中各時(shí)間點(diǎn)IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例 取24只小鼠，免疫前及免疫后第3、12、18天腹腔內(nèi)注射過量質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%水合氯醛各處死小鼠6只。將脾臟、淋巴結(jié)研磨制備成單細(xì)胞懸浮液，脾臟用紅細(xì)胞裂解液作用5 min，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗2次。眼球需先剔除晶狀體，剪碎，研磨，加入1 mg/ml膠原酶D，在搖床上37 ℃孵育1 h，得到的細(xì)胞用PBS清洗2次。將細(xì)胞用1640完全培養(yǎng)基重懸，以1×106個(gè)/ml細(xì)胞密度接種于96孔板中。用含有佛波酯、離子霉素、布雷菲德菌素A的細(xì)胞刺激液37 ℃孵育5 h。收集細(xì)胞于流式管中，加入抗鼠APC-CD4單克隆抗體2 μl，4 ℃避光孵育30 min。PBS清洗3次，加入2 ml細(xì)胞破膜液，添加抗鼠PE-IL-17A單克隆抗體和抗鼠FITC-IFN-γ單克隆抗體各2 μl的混合液，4 ℃避光孵育30 min，PBS清洗3次。采用流式細(xì)胞儀檢測樣本，根據(jù)細(xì)胞體積和顆粒度，通過前向散射光和側(cè)向散射光設(shè)門確定單核細(xì)胞，依據(jù)CD4、IL-17A、IFN-γ圈出IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞。

1.2.3OCT儀及小動物成像儀檢測IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞高表達(dá)組和IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞低表達(dá)組視網(wǎng)膜表現(xiàn) 取免疫后18 d小鼠6只進(jìn)行全身麻醉。采用頻域光相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)以視盤為中心對小鼠眼底進(jìn)行掃描，觀察是否出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫、炎癥細(xì)胞滲漏、視網(wǎng)膜脫離。采用小動物成像儀采集常規(guī)可見光眼底相，觀察其斑塊樣、融合和線性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎性浸潤情況，以及視網(wǎng)膜下是否有玻璃體積血、視網(wǎng)膜脫離等。觀察后處死小鼠，取小鼠淋巴結(jié)組織，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴結(jié)中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞數(shù)量，從高到低排序，取前3位為IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞高表達(dá)組，后3位為IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞低表達(dá)組，比較2個(gè)組視網(wǎng)膜炎癥程度。

1.2.4蘇木精-伊紅染色法觀察IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞高表達(dá)組和IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞低表達(dá)組視網(wǎng)膜組織形態(tài)改變 取1.2.3部分小鼠，完整取出小鼠眼球，于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛/PBS中固定24 h，石蠟包埋，于視神經(jīng)層面行5 μm厚組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色，觀察視網(wǎng)膜各層或玻璃體腔炎癥細(xì)胞浸潤、視網(wǎng)膜褶皺及脫離情況，以及是否出現(xiàn)視網(wǎng)膜下新生血管等。

1.2.5EAU小鼠Anti-IL-12/IL-23 p40抗體的尾靜脈注射 采用隨機(jī)數(shù)表法將36只小鼠隨機(jī)分成Anti-IL-12/IL-23 p40組和IgG組，每組18只。免疫后第0天起，Anti-IL-12/IL-23 p40組小鼠每3天尾靜脈注射1次Anti-IL-12/IL-23 p40抗體，IgG組每3天尾靜脈注射1次大鼠IgG，均500 μg/只。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組任取6只小鼠，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫后12 d淋巴結(jié)中IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞表達(dá)情況，以及免疫后18 d眼球中IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞、CD3細(xì)胞表達(dá)情況。免疫后第24天，取剩余小鼠眼球制作蘇木精-伊紅染色切片觀察視網(wǎng)膜損傷情況。

1.2.6EAU模型小鼠眼部視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分 Anti-IL-12/IL-23 p40組和IgG組小鼠從免疫后第10天起每隔1 d擴(kuò)瞳后使用直接檢眼鏡進(jìn)行眼底檢查，根據(jù)Caspi分級標(biāo)準(zhǔn)對視網(wǎng)膜表現(xiàn)進(jìn)行評分：正常眼底為0分；視網(wǎng)膜中央出現(xiàn)局灶性損傷<3處為0.5分；視網(wǎng)膜周邊和中央出現(xiàn)<5處但≥1處局灶性損傷為1分；彌漫性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜損傷，有>5處局灶性損傷，且<5處線性損傷為2分；大的融合性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜損傷，視網(wǎng)膜水腫，且有大量局灶性損傷和線性損傷為3分；出現(xiàn)大范圍視網(wǎng)膜脫離為4分[15]。

1.2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+T細(xì)胞的體外誘導(dǎo)分化情況 采用CD4細(xì)胞分離試劑盒行磁珠分選，將免疫前小鼠脾臟、腹股溝淋巴結(jié)經(jīng)研磨后置于紅細(xì)胞裂解液中作用5 min，每1×107細(xì)胞中加入20 μl抗體混合物，4 ℃孵育20 min，隔離緩沖液沖洗1次，添加200 μl提前洗好的陰選磁珠，在搖床上輕搖，室溫孵育15 min，置于磁鐵上2 min，收集的懸浮液即為CD4+T細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前一晚在96孔板上鋪平板結(jié)合型抗鼠CD3(10 μg/ml)抗體，4 ℃孵育過夜。取分離的CD4+T細(xì)胞以每孔2×105細(xì)胞種在96孔板中，用可溶性CD28(2.5 μg/ml)激活細(xì)胞。將細(xì)胞分為Anti-IL-2/IL-23 p40組和IgG組，分別加入Anti-IL-12/IL-23 p40抗體(10 ng/ml)和IgG(10 ng/ml)，并用細(xì)胞因子誘導(dǎo)細(xì)胞分化。Th1分化條件為IL-12(60 ng/ml)和anti-IL-4(300 ng/ml)；Th17細(xì)胞分化條件為轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β(5 ng/ml)、IL-6(10 ng/ml)和IL-23(10 ng/ml)；IL-17A+IFN-γ+細(xì)胞分化條件為IL-12(1 ng/ml)、TGF-β(5 ng/ml)、IL-23(10 ng/ml)和IL-6(10 ng/ml)。取細(xì)胞懸液200 μl/孔，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱中培養(yǎng)4 d，收集上清及細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測2個(gè)組Th1細(xì)胞、Th17細(xì)胞和IL-17A+IFN-γ+T細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況，將剩余的上清液及細(xì)胞儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8酶聯(lián)免疫吸附測定法定量檢測IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)分化后Anti-IL-2/IL-23 p40組和IgG組IL-17和IFN-γ表達(dá)情況 取1.2.7中Anti-IL-2/IL-23 p40組和IgG組細(xì)胞上清，按照鼠IL-17和鼠IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書進(jìn)行檢測，將捕獲抗體鋪在96孔板上，4 ℃孵育過夜，用試劑稀釋劑封閉1 h。加細(xì)胞上清液和小鼠重組IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品，室溫孵育2 h后加入生物素化的山羊抗小鼠IFN-γ抗體，室溫孵育2 h后加入鏈霉親和素室溫避光孵育20 min，加入顯色劑在室溫下孵育20 min。加入終止液，于酶標(biāo)儀上定量檢測波長540 nm或570 nm處各組IL-17和IFN-γ表達(dá)水平。

1.2.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測誘導(dǎo)分化后Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的相對表達(dá)量 取1.2.7中Anti-IL-2/IL-23 p40組和IgG組細(xì)胞，用EZ-press RNA純化試劑盒提取細(xì)胞mRNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物均購自天津金唯智生物科技有限公司。T-bet正向引物序列為5'-TCACTAAGCAAGGACGGCGAATGTT-3'，反向引物序列為5'-GGACATATAAGCGGTTCCCTGGCAT-3'；維甲酸相關(guān)孤核受體γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt,ROR-γt)正向引物序列為5'-ACCTCTTT TCACGGGAGGA-3'，反向引物序列為5'-TCCCACAT CTCCCACATTG-3'。GAPDH正向引物序列為5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，反向引物序列為5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt表達(dá)情況。每組設(shè)置3個(gè)樣本，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 EAU小鼠免疫前后不同時(shí)間點(diǎn)脾臟、淋巴結(jié)、眼球組織中IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞比例比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，免疫前和免疫后第3、12、18天淋巴結(jié)、脾臟、眼球中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(H=9.642、16.531、10.385，均P<0.05)，其中與免疫前相比，免疫后第12天，淋巴結(jié)中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例明顯增多，免疫后第18天，脾臟、眼球中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖1，表1)。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞在免疫前及免疫后不同時(shí)間點(diǎn)EAU小鼠不同組織中表達(dá)比例 與免疫前相比，免疫后第12天，淋巴結(jié)中IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞比例明顯增多，免疫后第18天，脾臟、眼球中IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞比例明顯增多 IL：白細(xì)胞介素；IFN-γ：γ干擾素

2.2 IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組與IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組小鼠視網(wǎng)膜炎癥程度比較

眼底照相結(jié)果顯示，IL-17A+IFN-γ+高表達(dá)組眼底可見大片狀融合性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜損傷，視網(wǎng)膜水腫，且有大量局灶性損傷和線性損傷；IL-17A+IFN-γ+低表達(dá)組眼底呈現(xiàn)彌漫性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜損傷(圖2)。OCT結(jié)果顯示，IL-17A+IFN-γ+高表達(dá)組視網(wǎng)膜水腫、大量炎癥細(xì)胞滲漏和視網(wǎng)膜脫離；IL-17A+IFN-γ+低表達(dá)組視網(wǎng)膜輕度水腫，少量炎癥細(xì)胞滲漏(圖3)。蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示IL-17A+IFN-γ+高表達(dá)組視網(wǎng)膜各層及玻璃體腔大量炎性細(xì)胞浸潤、視網(wǎng)膜高度褶皺及大面積視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜各層分界不清；IL-17A+IFN-γ+低表達(dá)組視網(wǎng)膜各層及玻璃體腔有少量炎性細(xì)胞浸潤，視網(wǎng)膜中度褶皺，視網(wǎng)膜各層分界清晰(圖4)。

圖2 IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組與IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組小鼠眼底照相 IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組小鼠眼底可見大片狀融合性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜損傷，表現(xiàn)為嚴(yán)重的視網(wǎng)膜水腫，同時(shí)可見多個(gè)局灶性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜損傷和線性損傷；IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組眼底呈現(xiàn)彌漫性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜損傷 A：IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組 B：IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組

圖3 IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組與IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組小鼠眼底OCT圖像 IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組小鼠視網(wǎng)膜水腫增厚；可見大量炎性細(xì)胞滲漏和視網(wǎng)膜脫離；與IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組小鼠比較，IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組視網(wǎng)膜輕度水腫，少量炎性細(xì)胞滲漏 A：IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組 B：IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組

圖4 IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組與IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組小鼠視網(wǎng)膜組織病理圖(HE ×100，標(biāo)尺=100 μm) IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組視網(wǎng)膜各層及玻璃體腔大量炎性細(xì)胞浸潤、視網(wǎng)膜高度褶皺及大面積視網(wǎng)膜脫離，視網(wǎng)膜各層分界不清；IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組視網(wǎng)膜各層及玻璃體腔有少量炎性細(xì)胞浸潤，視網(wǎng)膜中度褶皺，視網(wǎng)膜各層分界清晰 A：IL-17A+ IFN-γ+高表達(dá)組 B：IL-17A+ IFN-γ+低表達(dá)組

2.3 Anti-IL-12/IL-23 p40組與IgG組視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分及炎癥情況比較

IgG組和Anti-IL-12/IL-23 p40組不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組別=15.045，P=0.03；F時(shí)間=99.764，P<0.01)，其中免疫后第12、14、16、18、20、22、24天視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分均低于IgG組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)(表2)。

蘇木精-伊紅染色結(jié)果顯示，IgG組視網(wǎng)膜出現(xiàn)重度炎性細(xì)胞浸潤及廣泛視網(wǎng)膜褶皺伴脫離。Anti-IL-12/IL-23 p40組視網(wǎng)膜各層出現(xiàn)中度炎癥細(xì)胞浸潤及中度視網(wǎng)膜褶皺(圖5)。

圖5 IgG組和Anti-IL-12/IL-23 p40組視網(wǎng)膜組織病理改變(HE ×100，標(biāo)尺=100 μm) A：IgG組視網(wǎng)膜各層分界不清，出現(xiàn)重度炎癥細(xì)胞浸潤，廣泛的視網(wǎng)膜褶皺伴脫離 B：Anti-IL-12/IL-23 p40組視網(wǎng)膜各層出現(xiàn)中度炎癥細(xì)胞浸潤，中度視網(wǎng)膜褶皺 圖6 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)2個(gè)組IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞比例比較 A：各組免疫后第18天眼球CD3細(xì)胞表達(dá)情況 與IgG組相比，aP<0.01(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=9) B、C：各組免疫后第18天眼球IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞比例流式細(xì)胞分析(B)及量化比較(C) 與IgG組相比，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=6) D、E：各組免疫后第12天淋巴結(jié)IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞比例流式細(xì)胞分析(D)及量化比較(E) 與IgG組比較，aP<0.05(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，n=6) IL：白細(xì)胞介素；IFN-γ：γ干擾素

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，Anti-IL-12/IL-23 p40組免疫后第18 d眼球中CD3+細(xì)胞和IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例分別為(13.58±4.70)%和(1.52±0.29)%，分別低于IgG組的(90.11±8.07)%和(4.95±0.68)%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.304、8.080，均P<0.05)。免疫后第12 d Anti-IL-12/IL-23 p40組淋巴結(jié)中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比例為(0.33±0.18)%，低于IgG組的(4.83±0.45)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.974，P<0.001)(圖6)。

2.4 2個(gè)組Th1、Th17和IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞分化比例、IL-17A和IFN-γ及其轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與IgG組相比，Anti-IL-12/IL-23 p40組Th1、Th17、IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞百分比明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.876、0.634、7.025，均P<0.01(表3)。ELISA檢測結(jié)果顯示，與IgG組相比，Anti-IL-12/IL-23 p40組IL-17和IFN-γ質(zhì)量濃度明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.580、46.412，均P<0.001)(表4)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Anti-IL-12/IL-23 p40組T-bet、ROR-γt mRNA相對表達(dá)量明顯低于IgG組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.097、7.526，均P<0.05)(表5)。

表2 免疫后不同時(shí)間點(diǎn)2個(gè)組視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分比較(x±s,分)Table 2 Comparison of retinal scores between two groups at different time points after immunization (x±s,score)組別樣本量免疫后不同時(shí)間點(diǎn)視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分第10天第12天第14天第16天第18天第20天第22天第24天IgG組60.08±0.200.83±0.411.67±0.522.33±0.412.83±0.522.67±0.412.08±0.381.75±0.27Anti-IL-12/IL-23 p40組60.00±0.000.17±0.26a0.83±0.41a1.67±0.41a2.08±0.38a2.00±0.45a1.50±0.45a1.17±0.41a 注:F組別=15.045,P=0.03;F時(shí)間=99.764,P<0.01.與各自時(shí)間點(diǎn)IgG組比較,aP<0.01(重復(fù)測量兩因素方差分析,SNK-q檢驗(yàn)) IL:白細(xì)胞介素 Note:Fgroup=15.045,P=0.03;Ftime=99.764,P<0.01.Compared with IgG group at corresponding time points,aP<0.01 (Two-way repeated measures ANOVA,SNK-q test) IL:interleukin

表3 2個(gè)組Th1、Th17和IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T細(xì)胞分化比例比較(x±s,%)Table 3 Comparison of the differentiation percentage ofTh1,Th17 and IL-17A+ IFN-γ+ CD4+ T cells between twogroups (x±s,%)組別樣本量Th1細(xì)胞比例Th17細(xì)胞比例IL-17A+IFN-γ+ CD4+T細(xì)胞比例IgG組329.80±1.1521.27±0.915.43±0.89Anti-IL-12/IL-23 p40組313.20±0.498.71±0.661.67±0.27t值 22.8760.6347.025P值<0.001<0.0010.002 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) IL:白細(xì)胞介素;IFN-γ:γ干擾素 Note:(Independent samples t test) IL:interleukin;IFN-γ:interfer-on-γ

表4 2個(gè)組IL-17A和IFN-γ質(zhì)量濃度比較(x±s,pg/ml)Table 4 Comparison of IL-17A和IFN-γ concentrationbetween two groups (x±s,pg/ml)組別樣本量IL-17AIFN-γIgG組347.28±4.77794.67±8.08Anti-IL-12/IL-23 p40組318.08±3.80399.33±12.34t值9.58046.412P值<0.001<0.001 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) IL:白細(xì)胞介素;IFN-γ:γ干擾素 Note:(Independent samples t test) IL:interleukin;IFN-γ:interfer-on-γ

表5 2個(gè)組T-bet和ROR-γt mRNA相對表達(dá)量比較(x±s)Table 5 Comparison of relative expression of T-bet andROR-γt mRNA between two groups (x±s)組別樣本量T-betROR-γtIgG組30.005 4±0.001 90.010 1±0.001 7Anti-IL-12/IL-23 p40組30.000 9±0.000 40.001 3±0.001 1t值6.0977.526P值0.0400.002 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) ROR:維甲酸相關(guān)孤核受體;IL:白細(xì)胞介素 Note:(Independent samples t test) ROR:retinoid-related orphan nuclear receptor;IL:interleukin

3 討論

IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞具有很強(qiáng)的致病性[16]。在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中，IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞可優(yōu)先穿過人血-腦屏障，且在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型中，IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞可在小鼠發(fā)病的效應(yīng)期內(nèi)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積存[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在EAU免疫第3天各類組織IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞浸潤均很少，隨著疾病進(jìn)展IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞不斷增多，免疫第12天引流淋巴結(jié)中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞顯著增多，而眼球和脾臟中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞則于EAU免疫第18天達(dá)峰值。以上結(jié)果表明，在EAU模型誘導(dǎo)的第12天左右，引流淋巴結(jié)中的免疫反應(yīng)被激活，淋巴結(jié)中出現(xiàn)大量IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞，同時(shí)外周免疫組織中的IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞開始循環(huán)，浸潤到脾臟、眼特異的炎癥組織部位，因此免疫第12天以后，隨著疾病進(jìn)程的加劇，淋巴結(jié)中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞減少，而脾臟和眼球中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞逐漸增多。陳爽等[18]研究EAU模型小鼠視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分，發(fā)現(xiàn)炎癥起始于造模后第9～12天，炎癥高峰期為造模后第16～18天。本研究表明，眼球中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞于炎癥起始期開始出現(xiàn)，于炎癥高峰期達(dá)峰值。此外，本研究發(fā)現(xiàn)EAU進(jìn)程中IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞占比多的小鼠眼球視神經(jīng)層面病理切片、視網(wǎng)膜影像圖顯示發(fā)病更重。因此，本研究推斷IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞多，表明EAU發(fā)病更重。

IL-12和IL-23共有p40亞基的單克隆抗體可以抑制IL-12R和IL-23R介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此p40亞基對IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的形成有重要作用。本研究試圖通過中和IL-12/IL-23信號，抑制IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的分化，探討其對EAU進(jìn)程的作用。本研究結(jié)果表明，EAU模型小鼠尾靜脈注射Anti-IL-12/IL-23 p40抗體后，Anti-IL-12/IL-23 p40組小鼠的視網(wǎng)膜表現(xiàn)評分及視網(wǎng)膜損害表現(xiàn)均減輕，包括炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)量、視網(wǎng)膜褶皺數(shù)量、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管數(shù)量和視網(wǎng)膜脫離面積均減少，且第18天眼球中CD3細(xì)胞比例也明顯低于對照組。本研究進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證Anti-IL-12/IL-23 p40對T細(xì)胞炎性因子的作用。CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)中，與IgG組相比，Anti-IL-12/IL-23 p40組可明顯抑制CD4+T細(xì)胞群中Th1、Th17、IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的分化，表明Anti-IL-12/IL-23 p40可以通過抑制小鼠體內(nèi)IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的浸潤減輕EAU模型小鼠的眼部及病理表現(xiàn)，并延遲EAU的發(fā)生。本研究更進(jìn)一步探討了Anti-IL-12/IL-23 p40對EAU治療作用的具體機(jī)制。T-bet和RoR-γt分別是Th1和Th17細(xì)胞獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄因子。本研究發(fā)現(xiàn)，Anti-IL-12/IL-23 p40能分別使IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞T-bet、ROR-γt基因表達(dá)減少。因此，本研究推斷Anti-IL-12/IL-23 p40對EAU的治療作用部分可能是通過抑制Th1、Th17轉(zhuǎn)錄因子T-bet、ROR-γt表達(dá)，從而抑制IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞分化來實(shí)現(xiàn)的。但本研究未檢測其他相關(guān)基因的變化，我們將在接下來研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。

在IBD實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，Th17細(xì)胞向IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)變需要T-bet和STAT4的表達(dá)[2]。同樣在EAE模型中研究表明，由轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Runx1和Runx3來啟動Th17細(xì)胞向IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞分化。Chen等[19]采用干眼小鼠模型證實(shí)IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞群來自Th17前體并發(fā)揮致病作用。然而，一項(xiàng)新的研究證明Th1細(xì)胞能夠在TGF-β和IL-6的影響下轉(zhuǎn)分化為Th17細(xì)胞，上調(diào)RUNX1的表達(dá)，增加ROR-γt啟動子中RunX1結(jié)合位點(diǎn)以及IL-17啟動子中RunX1和ROR-γt結(jié)合位點(diǎn)的可及性[20-22]。因此，目前還沒有明確向IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞分化的路線，或者這個(gè)亞群是否代表穩(wěn)定的CD4+T細(xì)胞亞群。本研究中，雖然Anti-IL-12/IL-23p40能有效減輕EAU的眼部病理變化，但并未被完全抑制，我們認(rèn)為是Anti-IL-12/IL-23 p40治療后仍存在IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞所致。

IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞在EAU中的升高可被認(rèn)為是生物制劑的一個(gè)選擇性靶點(diǎn)。未來我們希望誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞，以在過繼轉(zhuǎn)移疾病實(shí)驗(yàn)中評估其誘發(fā)疾病的能力，相信采用生物制劑靶向IL-17A+IFN-γ+CD4+T細(xì)胞的可塑性將為未來潛在的葡萄膜炎治療策略提供有價(jià)值的工具。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明崔雪雪：直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、起草文章；張智慧、吳凌子、栗勇濤、陳爽、陳努：直接參與選題、醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)；張曉敏：直接參與選題、對文章知識性內(nèi)容的審閱和智力性內(nèi)容的修改及定稿