劉輝 李元朋 楊菁茹 任雨潔 王偉偉 蔡鳳梅 夏益敏 王佳 王卉芳

1西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院病理科，西安 710004；2西安市人民醫(yī)院 西安市第四醫(yī)院眼科，西安 710004

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)主要通過飛沫、密切接觸或氣溶膠等途徑傳播，引起人體呼吸道感染和肺部炎癥，可迅速發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒血癥休克及多器官衰竭。國際病毒分類學委員會宣布COVID-19病毒的英文名為severe acute respiratory syndrome coronavirus 2(SARS-CoV-2)，研究顯示SARS-CoV-2與SARS-CoV相似，與宿主細胞上的血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)受體具有很高的親和性，可利用包膜上刺突蛋白(S蛋白)靶向結合宿主細胞上的ACE2受體，并通過宿主細胞跨膜絲氨酸蛋白酶2(transmembrane serine protease 2，TMPRSS2)進一步切割激活，介導病毒進入宿主細胞，ACE2和TMPRSS2在COVID-19感染過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。結膜和角膜等眼表組織直接暴露于外界，SARS-CoV-2是否可以通過眼表感染人體需要更多實驗數(shù)據(jù)支持。本研究擬探討ACE2和TMPRSS2在人眼部結膜組織中的表達及其臨床意義，以期為SARS-CoV-2是否可以通過眼表組織感染人體提供更多病理學資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本來源及分組 收集2019年6月至2020年6月于西安市人民醫(yī)院眼科切除的人體結膜組織標本50例(正常結膜組織10例，結膜乳頭狀瘤15例，結膜色素痣15例，結膜囊腫10例)作為試驗組，年齡23～75歲，平均48.3歲，并收集10例人角膜組織作為對照組，年齡28～61歲，平均44.7歲。本研究正常結膜取材自結膜良性病變周邊正常結膜組織，角膜組織均取材自因外傷摘除眼球組織，角膜組織保存完好。本研究方案經(jīng)西安市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號：20190022)，病理標本使用均得到患者知情同意，患者自愿簽署知情同意書。所有切片均由2位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師重新閱片，收集所有病例的臨床資料。

1.1.2主要試劑及儀器 兔單克隆ACE2抗體(ab108252)、兔單克隆TMPRSS2抗體(ab109131)(美國Abcam公司)；LEICA免疫組織化學顯色試劑盒(100203040113)(德國徠卡生物系統(tǒng)有限公司)。LEICA BOND-MAX全自動免疫組化儀(德國徠卡生物系統(tǒng)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組織化學法測定ACE2和TMPRSS2的表達 所有組織均經(jīng)質量分數(shù)10%中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚切片，采用EnVision法染色，使用LEICA BOND-MAX全自動免疫組化機，具體操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，ACE2采用腎組織作為陽性對照，TMPRSS2采用前列腺癌組織作為陽性對照，陰性對照均采用磷酸鹽緩沖液代替一抗進行。ACE2抗體稀釋比例為1∶ 200，TMPRSS2抗體稀釋比例為1∶ 1 000。

1.2.2免疫組織化學結果判斷 ACE2和TMPRSS2陽性結果判讀標準為ACE2和TMPRSS2陽性染色定位于細胞漿和細胞膜，呈棕黃色顆粒，按照著色程度未著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比<10%為0分，10%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。每張切片根據(jù)其著色程度得分和陽性細胞百分比得分相乘所得分值分為4級：0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)[4]。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料數(shù)據(jù)以頻數(shù)表示，2個組間等級資料的比較采用Mann-Whitney秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ACE2在人結膜組織中的表達

ACE2在試驗組50例結膜組織中呈中-強陽性表達(++～+++)，陽性表達率為100%，主要定位于細胞膜和細胞質，表達于正常結膜上皮細胞、結膜色素痣上皮細胞、結膜乳頭狀瘤上皮細胞和結膜囊腫囊壁細胞(圖1A～D)，ACE2在結膜上皮的表層細胞和中間層細胞呈陽性表達，基底層細胞和杯狀細胞不表達(圖1E)，在正常結膜、結膜乳頭狀瘤、結膜色素痣和結膜囊腫中的表達均無顯著差異。對照組中ACE2僅表達于正常角膜表層細胞，基底層細胞未見表達(圖1F)。

圖1 ACE2在人結膜組織中的表達 A：ACE2在正常結膜組織中呈陽性表達(EnVision ×200，標尺=50 μm) B：ACE2在結膜色素痣結膜上皮中呈陽性表達(EnVision ×200，標尺=50 μm) C：ACE2在結膜乳頭狀瘤中呈陽性表達，在杯狀細胞中不表達(箭頭)(EnVision ×200，標尺=50 μm) D：ACE2在結膜囊腫囊壁的表層細胞中呈強陽性表達(EnVision ×400，標尺=20 μm) E：ACE2在正常結膜組織中的杯狀細胞不表達(箭頭)(EnVision ×400，標尺=20 μm) F：ACE2在角膜組織中的表層上皮細胞呈弱陽性表達，中間層及基底層細胞未見表達(EnVision ×400，標尺=20 μm)

2.2 TMPRSS2在人結膜組織中的表達

TMPRSS2在試驗組50例結膜組織中呈弱-強陽性表達(+～+++)，陽性表達率為100%，主要定位于細胞質，表達于正常結膜上皮細胞、結膜色素痣上皮細胞、結膜乳頭狀瘤上皮細胞和結膜囊腫囊壁細胞，TMPRSS2在結膜上皮細胞全層表達并表達于杯狀細胞(圖2)，在正常結膜、結膜乳頭狀瘤、結膜色素痣和結膜囊腫中的表達均無明顯差異。

圖2 TMPRSS2在人結膜組織中表達 A：TMPRSS2在正常結膜組織中表面上皮及杯狀細胞(箭頭)均呈陽性表達(EnVision ×200，標尺=50 μm) B：TMPRSS2在結膜色素痣的結膜上皮細胞中呈陽性表達(EnVision ×200，標尺=50 μm) C：TMPRSS2在結膜乳頭狀瘤中呈陽性表達(EnVision ×200，標尺=50 μm) D：TMPRSS2在結膜乳頭狀瘤杯狀細胞呈陽性表達(箭頭)(EnVision ×400，標尺=20 μm)

2.3 ACE2和TMPRSS2在不同患者結膜組織與角膜組織中表達比較

所檢測的60例患者均無感染SARS-CoV-2的病史，ACE2和TMPRSS2在不同結膜組織中表達強度比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。ACE2和TMPRSS2在角膜組織中均為弱陽性表達，二者在正常結膜組織、結膜乳頭狀瘤、結膜色素痣和結膜囊腫中中度陽性和強陽性表達例數(shù)增多，二者在正常結膜、結膜乳頭狀瘤、結膜色素痣、結膜囊腫中不同強度等級表達例數(shù)與角膜組織比較，差異均有統(tǒng)計學意義(ACE2:Z=-3.473、-4.183、-3.970、-3.873，均P<0.01；TMPRSS2:Z=-4.119、-4.472、-4.443、-4.147，均P<0.001)(表1，2)。

表1 ACE2在不同結膜組織與角膜組織中的表達Table 1 ACE2 expression in corneal and different conjunctival tissues組織例數(shù)不同強度等級的表達例數(shù)++++++角膜101000正常結膜10262結膜乳頭狀瘤15195結膜色素痣152103結膜囊腫10181 注:ACE:血管緊張素轉換酶 Note:ACE:angiotensin-converting enzyme

表2 TMPRSS2在不同結膜組織與角膜組織中的表達Table 2 TMPRSS2 expression in corneal and different conjunctival tissues組織例數(shù)不同強度等級的表達例數(shù)++++++角膜101000正常結膜10064結膜乳頭狀瘤150105結膜色素痣15096結膜囊腫10073 注:TMPRSS:跨膜絲氨酸蛋白酶 Note:TMPRSS:transmembrane serine protease

3 討論

SARS-CoV-2主要通過飛沫、密切接觸或氣溶膠等途徑傳播，眼表直接接觸外界空氣，是否可以作為COVID-19感染途徑目前存在爭議。Deng等[5]在恒河猴結膜接種SARS-CoV-2后1 d，其結膜拭子即呈陽性，1～7 d內其鼻拭子和咽拭子均呈陽性，說明恒河猴可以通過結膜途徑感染SARS-CoV-2，并可以從結膜轉移到鼻腔和呼吸道等組織，感染后7 d尸檢結果發(fā)現(xiàn)病毒主要分布于淚腺、視神經(jīng)和結膜組織。Xia等[6]從COVID-19患者淚液和結膜分泌物中檢測到SARS-CoV-2。COVID-19患者可伴有或以結膜癥狀作為首發(fā)表現(xiàn)[7-8]。Chen等[9]在對535例COVID-19患者的研究中發(fā)現(xiàn)27例患者出現(xiàn)結膜充血，4例以結膜充血為首發(fā)癥狀，332例患者曾有過手-眼接觸史且接觸史與結膜充血獨立相關，一些COVID-19患者患有結膜炎、干眼和角膜炎等慢性眼病。Wu等[10]研究發(fā)現(xiàn)，38例COVID-19患者中有12例患者伴有結膜炎，2例結膜組織中檢測到SARS-CoV-2提示SARS-CoV-2通過眼表傳染人體存在可能性。

但目前也有研究者對于SARS-CoV-2是否可以通過眼表感染人體存在質疑，Liang等[11]分析了37例COVID-19患者的結膜拭子樣本，3例患者伴結膜炎癥狀，僅在1例不伴結膜炎的患者結膜拭子樣本中檢測到SARS-CoV-2。Peng等[12]也將結膜炎歸屬為“巧合事件”，認為SARS-CoV-2感染與結膜炎間不存在因果關系。Aiello等[13]回顧性分析SARS-CoV-2與眼部組織及分泌物相關性文獻，發(fā)現(xiàn)有3例伴有結膜炎的患者淚液中SARS-CoV-2檢測陽性、14例伴有結膜炎患者淚液SARS-CoV-2檢測陰性和8例淚液SARS-CoV-2檢測陽性而未合并結膜炎，認為雖然大部分研究存在爭議，但基于患者的結膜分泌物和淚液SARS-CoV-2檢測陽性，仍不能排除COVID-19可能通過眼部作為輔助傳播途徑。

既往部分研究顯示在動物結膜、角膜和淚腺腺泡均存在ACE2和TMPRSS2的表達，Zhou等[14]采用免疫組織化學和Western blot法檢測了人體組織中ACE2和TMPRSS2的表達，發(fā)現(xiàn)二者在結膜和角膜上皮細胞中恒定表達，但在杯狀細胞中不表達，認為SARS-CoV-2可能通過結膜上皮細胞感染人體。Collin等[15]研究也發(fā)現(xiàn)在成人結膜、角膜和角膜緣中存在ACE2和TMPRSS2陽性表達，認為眼表上皮組織為SARS-CoV-2進入人體可能提供了新的途徑。本研究采用免疫組織化學法檢測發(fā)現(xiàn)ACE2和TMPRSS2在人結膜和正常角膜組織中均有不同程度表達，與上述各研究結果一致；本研究還發(fā)現(xiàn)ACE2和TMPRSS2在正常結膜、結膜色素痣、結膜乳頭狀瘤和結膜囊腫中的表達無明顯差異，提示存在被SARS-CoV-2感染的可能性。但Lange等[16]采用RNA測序和免疫組織化學方法檢測38份結膜組織中ACE2和TMPRSS2的表達情況，未發(fā)現(xiàn)在正?；虍惓＝Y膜組織中存在ACE2的表達，與Xiang等[17]的實驗結果一致。Ma等[18]采用逆轉錄PCR技術檢測人結膜、翼狀胬肉細胞系和鼠角膜組織中ACE2和TMPRSS2的表達，結果顯示結膜細胞被SARS-CoV-2感染的概率較低，而翼狀胬肉則更可能被SARS-CoV-2感染，鼠的角膜組織中發(fā)現(xiàn)較高且恒定的ACE2和TMPRSS2表達，提示SARS-CoV-2可能更容易通過角膜組織感染人體。目前大部分研究支持人結膜組織中存在ACE2和TMPRSS2表達的結論，個別實驗結果的差異性可能與所用實驗方法、組織來源及抗體質量等有關，需要進一步研究進行驗證。

綜合本研究結果及相關文獻信息，大部分研究者認為眼部防護對預防冠狀病毒的感染至關重要，特別是醫(yī)療人員在近距離診療COVID-19患者時仍不能排除通過患者淚液和眼部分泌物中存在的SARS-CoV-2發(fā)生交叉感染，有必要配戴護目鏡以防通過眼部接觸感染[19-22]。本研究的局限性在于未獲取COVID-19患者的眼表組織，尚不能得到相關患者眼表組織中ACE2及TMPRSS2的表達結果。雖然目前各研究結果之間存在爭議，但大部分實驗結果顯示人結膜組織中存在ACE2和TMPRSS2的表達，SARS-CoV-2是否能夠通過結膜感染人體有待進一步研究，有可能該感染途徑會增加患者罹患冠狀病毒全身感染的風險。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明劉輝：直接參與選題、醞釀和設計試驗、實施研究、采集及解釋數(shù)據(jù)、起草及修改文章；李元朋、任雨潔：試驗操作及數(shù)據(jù)分析；楊菁茹、王偉偉、夏益敏、王佳：設計試驗、采集數(shù)據(jù)；蔡鳳梅、王卉芳：參與選題，對文章知識性內容的審閱和智力性內容的修改