人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）源自于遷移的神經(jīng)嵴細(xì)胞，于2000 年首次從人牙髓中分離和鑒定，具有高度增殖、自我更新和多向分化等間充質(zhì)干細(xì)胞的特性

。其取材方便、易于擴增保存、活性高，能在特定條件下分化為多種組織細(xì)胞，是干細(xì)胞治療中極有潛力的細(xì)胞來源

，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。牛磺酸上調(diào)基因1（taurine upregulated 1，TUG1）是一種長鏈非編碼RNA，位于第22 號染色體上，最早由學(xué)者Young 等

從小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是視網(wǎng)膜細(xì)胞發(fā)育和光感受器形成的重要參與者。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TUG1 可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

以及牙周膜細(xì)胞

成骨向分化。但TUG1在hDPSCs的增殖及成骨/成牙本質(zhì)向分化過程中的表達(dá)水平和功能作用尚未見報道。本研究旨在通過感染慢病毒構(gòu)建沉默TUG1 的hDPSCs，探究TUG1對hDPSCs 的增殖及成骨/成牙本質(zhì)分化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

α-MEM 培養(yǎng)基（Procell，中國），青霉素-鏈霉素、胰酶細(xì)胞消化液、堿性磷酸酶（alkaline phospha-tase，ALP）顯色試劑盒（Beyotime，中國），胎牛血清（vivacell，意大利），地塞米松、維生素C、茜素紅染色液（Solarbio，中國），β-甘油磷酸鈉（Macklin，中國），Ⅰ型膠原酶（Biofroxx，德國），CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1 抗體（Ebioscience，美國），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Abcam，英國），兔抗人DPSS 抗體（Abcam，英國），兔抗人DMP-1抗體（Abcam，英國），兔抗人Runx2 抗體（Abcam，英國），兔抗人OCN 抗體（Abcam，英國），兔抗人OPN抗體（Abcam，英國），山羊抗兔二抗（Proteintech，美國），4%多聚甲醛（Biosharp，中國），CCK-8 試劑盒（Dojindo，日本），氯化十六烷吡啶（Sloarbio，中國），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，中國），ALP測定試劑盒（南京建成，中國），SteadyPure 快速RNA 提取試劑盒、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄預(yù)混型試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS 預(yù) 混 型qPCR 試 劑 盒（Accurate，中國）。

1.2 hDPSCs 的分離培養(yǎng)和鑒定

本研究已取得西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批號：20220531002）。牙髓組織來源于西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科，采用酶消化組織塊法提取hDPSCs?；颊呒凹覍僦橥夂螅纬蛘蟀纬那澳パ?，于無菌條件下劈開牙齒，取出牙髓，立即用含青霉素-鏈霉素的PBS 梯度沖洗，剪碎牙髓組織，加入Ⅰ型膠原酶（3 g/L），15 min 后加入完全培養(yǎng)基，低速離心后棄上清液，將消化后的組織塊接種于培養(yǎng)瓶底后倒置培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO

條件下培養(yǎng)，4 h 組織塊貼壁后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，每隔3 d 換液，細(xì)胞長至瓶底80%后傳代。取第3 代hDPSCs 流式細(xì)胞儀檢測表面標(biāo)志物CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1。取 第3 代hDPSCs 于6 孔板，成骨誘導(dǎo)7 d 進(jìn)行ALP 染色，成骨誘導(dǎo)21 d 進(jìn)行茜素紅染色觀察。

1.3 qRT-PCR 檢測hDPSCs 中TUG1 的表達(dá)

取第3 代hDPSCs 于6 孔板，分別于成骨誘導(dǎo)0、7、14 d 提取細(xì)胞總RNA，測得RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，實時定量擴增，檢測成骨過程中TUG1的表達(dá)變化，實驗重復(fù)3 次。

1.4 慢病毒轉(zhuǎn)染

慢病毒sh- TUG1 載體pSLenti-U6-shRNA（TUG1）-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 由上海和元技術(shù)股份有限公司提供，sh-TUG1 序列為：5′-GCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTT-3′；取第3 代的hDPSCs 接種至6 孔板中，待細(xì)胞長至50%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書，慢病毒滴度為3.78×10

TU/mL，通過轉(zhuǎn)染預(yù)實驗測定其感染復(fù)數(shù)為40；加入5 mg/L 聚凝胺提高轉(zhuǎn)染效率，12 h 后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，確認(rèn)感染成功后加入4 mg/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。根據(jù)病毒轉(zhuǎn)染情況將細(xì)胞分為3 組：①空白對照組（NC 組）：未轉(zhuǎn)染處理的hDPSCs；②陰性對照組（sh-NC 組）：感染無序列質(zhì)粒載體慢病毒的hDPSCs；③實驗組（sh-TUG1組）：感染sh-TUG1 慢病毒的hDPSCs。

1.5 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖活性

按試劑盒步驟分別提取成骨誘導(dǎo)7 d 時3 組細(xì)胞總RNA，測得RNA 濃度，去除基因組DNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，實時定量擴增，檢測成牙本質(zhì)及成骨分化相關(guān)的基因牙本質(zhì)涎磷蛋白（dentin sialoph-osphoprotein，DSPP），牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白-1（dentine matrix protein 1，DMP-1），Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2），骨鈣素（osteo-calcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的基因表達(dá)，實驗重復(fù)3 次。目的基因的相對表達(dá)量使用2

方法計算得出。引物序列見表1。

式中：Q為加熱器加熱功率，W；M1為熱箱外壁熱流系數(shù)，W/K；M2為試件框熱流系數(shù)，W/K；Δθ1為熱箱外壁內(nèi)外表面面積加權(quán)溫度平均溫度之差，K；Δθ2為試件框熱側(cè)冷測表面面積加權(quán)平均溫度之差，K；S1為填充用絕熱板的面積，m2；Δ1為填充用絕熱板的熱導(dǎo)率,W/(m2·K)；Δθ3為填充用絕熱板表面的平均溫差，K；A為試件面積，m2；Δt為熱箱與冷箱空氣平均溫度之差，K.

1.6 ALP 染色及定量檢測

MRI的T2像雖較CT敏感，但在LA的早期單純依靠肉眼觀察尚無法分辨出明顯信號改變，近年來新的磁共振成像技術(shù)開始用于LA的早期診斷。

將NC 組、sh-NC 組和sh-TUG1 組細(xì)胞分別接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)7 d，按ALP 顯色試劑說明書配置染液，染色15 min，在倒置顯微鏡下觀察。將成骨誘導(dǎo)7 d 的細(xì)胞裂解，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白質(zhì)濃度，ALP 定量試劑盒檢測樣本內(nèi)細(xì)胞ALP 活性，實驗重復(fù)3 次。

1.7 茜素紅染色及定量檢測

hDPSCs 具有多向分化潛能，可以在特定條件下分化為牙本質(zhì)

、牙周組織

、骨

、神經(jīng)組織

和皮膚組織

等多種組織細(xì)胞，可用于牙本質(zhì)及骨組織再生等研究領(lǐng)域，目前已成為組織再生與工程領(lǐng)域的研究熱點。

1.8 qRT-PCR 檢測成牙本質(zhì)及成骨分化相關(guān)基因mRNA 水平

將NC 組、sh-NC 組和sh-TUG1 組細(xì)胞分別接種于96 孔板，每孔2×10

個。在1、3、5、7 d 進(jìn)行CCK-8檢測。去除原培養(yǎng)基，添加CCK-8 混合工作液，在避光條件下孵育1 h，酶標(biāo)儀在450 nm 處測定吸光度值，實驗重復(fù)3 次。

基于靈敏度分析的參數(shù)模型修正基本思路是通過構(gòu)造理論模型與實際結(jié)構(gòu)之間在相同條件下動態(tài)特性的誤差，然后選擇修正參數(shù)進(jìn)行修正，以盡量縮小理論模型與實際結(jié)構(gòu)之間的誤差為目的，最終獲得一個較為精確的有限元模型。要實現(xiàn)此目標(biāo)，首先初始模型需要建立得盡量準(zhǔn)確，避免結(jié)構(gòu)上的誤差；其次要設(shè)法提高試驗數(shù)據(jù)的精度；同時要開發(fā)穩(wěn)定高效的修正算法。目前，使用較多的算法是二次規(guī)劃優(yōu)化算法，其在仿真算例的應(yīng)用中，收斂速度快、修正效率高、修正結(jié)果準(zhǔn)確可信。但在解決工程實際問題時，由于目標(biāo)函數(shù)的構(gòu)建問題，無法得到一個較為準(zhǔn)確的有限元模型。

1.9 Western blot 檢測hDPSCs 成牙本質(zhì)及成骨分化相關(guān)蛋白含量

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d，ALP 染色及定量檢測結(jié)果顯示sh-TUG1 組著色較NC 組（

= 0.002）和sh-NC組（

= 0.006）淺，而NC 組和sh-NC 組間無明顯差異（圖5），說明沉默TUG1 后hDPSCs 早期ALP 活性減弱。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

hDPSCs 成骨誘導(dǎo)0、7、14 d，分別收集細(xì)胞提取總RNA 進(jìn)行qRT-PCR 檢測TUG1 含量相對變化，結(jié)果顯示，TUG1 的含量在成骨誘導(dǎo)過程中逐漸增加，相較于0 d，成骨誘導(dǎo)7 d（

= 0.001）、14 d（

＜0.001）時，TUG1 mRNA 表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖2）。

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs 的分離培養(yǎng)和鑒定

組織塊培養(yǎng)5～7 d 后顯微鏡下可見細(xì)胞沿組織塊邊緣爬出（圖1a），呈放射狀生長；傳至第3 代時觀察細(xì)胞呈長梭形，胞核明顯，呈旋渦狀生長（圖1b）。流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)來源的表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD133、STRO-1，低表達(dá)造血組織來源的表面標(biāo)志物CD45（圖1c）。ALP 和茜素紅染色顯示成骨誘導(dǎo)后的ALP 活性強（圖1d）且具有礦化結(jié)節(jié)生成能力（圖1e）。

2.2 TUG1 在hDPSCs 成骨分化過程中上調(diào)

用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計量資料的組間比較采用單因素方差分析，

＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 病例診斷及監(jiān)測 80年代開始，對臨床診斷為瘧疾、疑似瘧疾、疑似感冒及其他原因不明的發(fā)熱病人（稱“四熱病人”）采血涂片鏡檢［2］，以血檢瘧原蟲陽性者統(tǒng)計發(fā)病率。2006年以后診斷依據(jù)根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)之瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS259-2006）。

3)白城站20種天氣模態(tài)下逐日降水量預(yù)測模型的MAE為0.08～7.94 mm,RMSE為0.25～11.86 mm。降水量越大,模型的MAE和RMSE也越大。在第4類最不容易發(fā)生降水的天氣模態(tài)下,MAE和RMSE都不超過1 mm。在第1類最容易發(fā)生降水的天氣模態(tài)下,最大逐日降水量都超過60 mm,MAE為7～8 mm,RMSE為11～12 mm。

2.3 構(gòu)建沉默TUG1 的hDPSCs

熒光顯微鏡觀察慢病毒感染hDPSCs 48 h 后，細(xì)胞表達(dá)綠色熒光（圖3a、3b），表明慢病毒成功感染hDPSCs，qRT-PCR 證實感染慢病毒后TUG1 沉默效率高于60%（

＜0.001）（圖3c）。

2.4 沉默TUG1 抑制hDPSCs 的增殖

通過CCK-8 法檢測細(xì)胞的增殖能力（圖4），與NC 組相比，sh-NC 組hDPSCs 的增殖能力未發(fā)生明顯變化（

＞0.05），在5 d（

= 0.001 0）、7 d（

=0.001 1）、9 d（

= 0.004 0）時，sh-TUG1 組hDPSCs的增殖能力減弱（

＜0.05）。

2.5 沉默TUG1 后抑制hDPSCs 的ALP 活性及礦化結(jié)節(jié)的形成

在成骨誘導(dǎo)7 d 時，提取3 組細(xì)胞蛋白并測定其濃度，SDS- PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗，（DSPP，1∶500；DMP-1，1∶1 000；RUNX2，1∶2 000；OCN，1∶1 000；OPN，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000），4 ℃振蕩過夜。TBST 潤洗3 遍后加入二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h，顯影成像，Image J（National Institute of Mental Health，美國）軟件分析結(jié)果，實驗重復(fù)3 次。

成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d，茜素紅染色及定量檢測結(jié)果顯示NC 組（

= 0.005）和sh-NC 組（

= 0.005）礦化結(jié)節(jié)形成能力明顯高于sh-TUG1 組，而NC 組和sh-NC 組間無明顯差異（圖6）。說明沉默TUG1 后hDPSCs 晚期礦化結(jié)節(jié)形成能力減弱。

2.6 沉默TUG1 后hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平下調(diào)

成骨誘導(dǎo)7 d，qRT-PCR 和Western blot 技術(shù)檢測各組細(xì)胞中成牙本質(zhì)分化相關(guān)基因（DSPP、DMP-1）以及成骨分化相關(guān)基因（Runx2、OCN、OPN）的mRNA 和蛋白含量變化（圖7），和NC 組相比，sh-NC 組細(xì)胞內(nèi)成牙本質(zhì)及成骨分化相關(guān)基因的mRNA 和蛋白含量未發(fā)生明顯變化（

＞0.05）；相較NC 組和sh-NC 組，sh-TUG1 組成牙本質(zhì)及成骨分化相關(guān)基因的mRNA 和蛋白表達(dá)降低（

＜0.05）。

3 討 論

將NC 組、sh-NC 組和sh-TUG1 組細(xì)胞分別接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。成骨誘導(dǎo)21 d，用0.2%茜素紅染液染色30 min，倒置顯微鏡下觀察。超純水清洗3 次，加入氯化十六烷基吡啶溶液，避光30 min，將上清液置于96 孔板中，酶標(biāo)儀在562 nm 處測定吸光度值，實驗重復(fù)3 次。

lncRNA 是一類長度超過200 bp、不編碼蛋白質(zhì)的RNA

。近年來，高通量測序技術(shù)的進(jìn)步提高了對細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 及其復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識。lncRNA 可參與多種生物學(xué)過程，如染色質(zhì)調(diào)控和基因表達(dá)

。在胚胎干細(xì)胞中l(wèi)ncRNA 具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、維持細(xì)胞的多向分化潛能的作用，也可能參與細(xì)胞的更新和分化

。此外，大量研究已證明lncRNA 在間充質(zhì)干細(xì)胞骨形成調(diào)控中的不同作用，例如，lncRNA XIXT 通過miRNA-30a-5p 上調(diào)RUNX2，從而誘導(dǎo)hBMSCs 成骨緩解骨質(zhì)疏松。lncRNA HOTAIRM1 通過調(diào)節(jié)JNK/AP-1 信號介導(dǎo)的RUNX2 表達(dá)來促進(jìn)成骨分化

。

TUG1 是一個7.1 kb 的lncRNA，首次在發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，對?；撬崽幚矸磻?yīng)上調(diào)

。研究發(fā)現(xiàn)TUG1 在人類多種癌癥中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，是一個新發(fā)現(xiàn)的致癌基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 會顯著抑制主動脈瓣鈣化疾病下破骨細(xì)胞的形成，且TUG1 通過miR-204-5p 上調(diào)RUNX2 基因表達(dá)，促進(jìn)主動脈瓣鈣化疾病中的成骨細(xì)胞分化

。Teng 等

發(fā)現(xiàn)TUG1 在骨質(zhì)疏松癥中下調(diào)，影響骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。Lu 等

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TUG1 通過調(diào)控AMPK/mTOR/自噬通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化。Hao 等

發(fā)現(xiàn)TUG1 促進(jìn)了成骨前體細(xì)胞的增殖，且通過miR-545-3p 上調(diào)CNR2 促進(jìn)成骨前體細(xì)胞的成骨分化。Liu 等

發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 后成骨經(jīng)典通路Wnt/β-catenin 通路重要標(biāo)志物Runx2、Frizzled-2、Axin2和β-catenin 表達(dá)下調(diào)。以上這些研究表明TUG1在干細(xì)胞成骨分化過程中起著重要作用。但TUG1 在hDPSCs 成骨/成牙本質(zhì)向分化過程中的表達(dá)水平和作用尚未見報道。

本研究成功分離并鑒定hDPSCs，發(fā)現(xiàn)TUG1 在hDPSCs 成骨分化中明顯增加。為驗證TUG1 對hDPSCs 增殖和成骨/成牙本質(zhì)分化的調(diào)控作用，利用慢病毒感染技術(shù)體外成功構(gòu)建沉默TUG1 的hDPSCs。發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 后hDPSCs 增殖被抑制。通過ALP 和茜素紅染色及定量檢測發(fā)現(xiàn)在成骨誘導(dǎo)條件下，沉默TUG1 抑制hDPSCs 的早期ALP 活性和晚期礦化結(jié)節(jié)形成能力。通過qRT-PCR 檢測驗證了TUG1 抑制hDPSCs 內(nèi)DSPP、DMP-1、Runx2、OCN 和OPN 等基因的表達(dá)。DSPP 是牙本質(zhì)中最豐富的非膠原蛋白

，DMP-1 為成牙本質(zhì)細(xì)胞分化早期的標(biāo)志

，均在牙本質(zhì)的形成及礦化中起到重 要 作 用。Runx2 是 成 骨 分 化 早 期 標(biāo) 志

。Sheng 等

發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1 通過RUNX2 促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)展，Du 等

發(fā)現(xiàn)沉默lncRNA TUG1 通過Runx2/ANPEP 增強氧化低密度脂蛋白處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)動脈粥樣硬化血管損傷的修復(fù)。OPN 和OCN 分別是成骨分化中晚期和晚期的標(biāo)志

。Teng 等

發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，骨質(zhì)疏松患者血漿中TUG1 表達(dá)明顯降低，miR-23b 表達(dá)明顯增加。此外，miR-23b 表達(dá)增加可抑制RUNX2、骨鈣素和骨橋蛋白的表達(dá)。在本實驗中發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 抑制了hDPSCs 向成牙本質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞的分化。

2.2 中耕除草 應(yīng)根據(jù)豆苗生育狀況及田間雜草多少而定進(jìn)行2～3次中耕。第一次中耕以第一片真葉出現(xiàn)時為宜，中耕深度不宜超過3.5厘米；第二次中耕可在出現(xiàn)3～4片復(fù)葉，子葉發(fā)黃時進(jìn)行，深度為4.5厘米；第三次中耕一般在苗高20厘米左右時，開花前進(jìn)行，宜淺耕，并結(jié)全培土，培土高度以略高于子葉節(jié)為準(zhǔn)。

本實驗探討了TUG1 在hDPSCs 成骨過程中的表達(dá)水平以及對增殖和成骨/成牙本質(zhì)分化的影響，但TUG1 對hDPSCs 增殖和分化的調(diào)控機制及體內(nèi)實驗仍有待進(jìn)一步研究。

繪本，顧名思義就是“畫出來的書”，也就是指圖文相互有機結(jié)合的書籍。現(xiàn)在市面上的繪本圖書以兒童閱讀為主，內(nèi)容涉及也很廣，文學(xué)、科學(xué)、教育等等。近年來，市場上出現(xiàn)了成人繪本，以臺灣繪本家?guī)酌椎淖顬榛馃?，還有錢海燕、寂地等都是以成人繪本創(chuàng)作為主的。這些成人繪本中有很大一部分屬于治愈系繪本。

【

】 Jiang YX performed the experiments and wrote the article. Sun LH collected the data. Zhang H assisted in the da-ta statistics. Li ST assisted in the experimental design. Feng H designed the experiments and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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