李夢佳，王 宏，董臣林，李 博，李 萍#

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院藥學部，北京 100050； 2.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院/北京市中醫(yī)藥研究所北京中醫(yī)藥循證醫(yī)學中心，北京 100010)

牙周炎是一種牙周組織感染性疾病，該病是由于牙菌斑生物膜引起的，會造成牙齒支持組織的破壞，進而引起附著喪失、牙槽骨逐步吸收，最終造成牙齒松動，以致牙齒脫落[1]。近年來的研究結(jié)果表明，牙周炎還與多種全身重大慢性疾病的發(fā)生發(fā)展呈現(xiàn)密切的關(guān)系，從而影響全身健康[2-6]?？傮w上，牙周炎的治療原則是通過齦下刮治和根面平整等機械方法，清除菌斑、牙石等病原刺激物[1]。但有些病原刺激物存在于臨床無法觸及的區(qū)域，故單純通過機械方法無法將其徹底清除。因此，臨床上通常局部或全身使用抗菌藥物，抑制病原菌的生長，作為牙周炎治療的輔助用藥。然而，抗菌藥物反復使用導致的一些不良反應(yīng)卻不容忽視，探索牙周炎的其他治療藥物及方法十分必要。近年來，中醫(yī)藥在牙周疾病的治療中應(yīng)用廣泛。出自《景岳全書》之“新方八陣”的玉女煎一方，由熟地黃、知母、石膏、麥冬和牛膝5味中藥組成，具有清胃瀉火、養(yǎng)陰增液的功效，在臨床上常被用于口腔潰瘍、牙周炎和糖尿病等疾病的治療[7]。研究結(jié)果表明，單用玉女煎或與西藥聯(lián)合應(yīng)用均能顯著改善牙周炎患者的牙周探診深度、菌斑指數(shù)和出血指數(shù)等牙周指標，提高患者的生活質(zhì)量，且其不良反應(yīng)少，有較大的臨床應(yīng)用價值[8-11]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，預測玉女煎治療牙周炎的成分及靶點并探究其作用機制，為玉女煎治療牙周炎的進一步臨床研究提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 玉女煎相關(guān)化學成分查找及靶點數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建

通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，https://tcmsp-e.com/)分別查找熟地黃、牛膝、知母、麥冬和石膏5味中藥的化學成分，設(shè)定類藥性(DL)≥0.18、口服生物利用度(OB)≥30%為條件，篩選各味中藥的活性成分并收集其相關(guān)靶點蛋白。由于數(shù)據(jù)庫缺少“麥冬”的相關(guān)成分信息，故采用中藥分子機制生物信息學分析工具BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)進行檢索，以Score cutoff≥20作為條件，得到麥冬的活性成分及靶點蛋白。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www. uniprot.org)對靶點蛋白進行基因名規(guī)范化，最終構(gòu)建出玉女煎成分的靶點數(shù)據(jù)庫。

1.2 牙周炎相關(guān)靶點的獲取

通過人類孟德爾遺傳綜合數(shù)據(jù)庫(https://omim.org)、治療靶點數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd)、DrugBank數(shù)據(jù)庫(https://www.drugbank.ca)和GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org)，以“periodontitis”為關(guān)鍵詞查找牙周炎疾病靶點，運用Uniprot數(shù)據(jù)庫對基因名稱進行標準化。

1.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物靶點基因與疾病靶點基因取交集，即為玉女煎治療牙周炎的潛在作用靶點。運用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將交集靶點導入STRING 11.0(https://www.string-db.org/)分析平臺，物種設(shè)置為“Homo sapiens”(人類)，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)并進行可視化。將結(jié)果以TSV格式導入Cytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，對其進行拓撲結(jié)構(gòu)分析、篩選核心靶點。

1.5 基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析

將玉女煎治療牙周炎的潛在靶點通過Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html)進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并將排序靠前的結(jié)果進行可視化分析。

1.6 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

運用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建玉女煎治療牙周炎的成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 玉女煎成分及其靶點信息的獲取

玉女煎組方的5味中藥共收集到活性成分51個，其中熟地黃2個，知母15個，牛膝20個，麥冬18個，其中有2個共有成分。因在數(shù)據(jù)庫中未能檢索出石膏的化學成分，故合并去重后共得到430個靶點基因。

2.2 玉女煎作用于牙周炎的靶點預篩選及藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

經(jīng)檢索得到牙周炎治療靶點1 267個，與玉女煎的預測靶點取交集，得到玉女煎治療牙周炎的130個潛在靶點，見圖1。玉女煎治療牙周炎藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖見圖2。圖2中，圓形分別代表玉女煎中的4味中藥(SDH代表熟地黃，NX代表牛膝，ZM代表知母，MD代表麥冬)，矩形代表活性成分，菱形代表共有活性成分，綠色六邊形代表作用靶點。經(jīng)Network Analyzer計算分析后得出該網(wǎng)絡(luò)圖共有165個節(jié)點，359條邊，平均度值為4.32，推測出玉女煎治療牙周炎的活性成分信息，具體見表1。其中槲皮素(quercetin，度值為84)、山柰酚(kaempferol，度值為35)、漢黃芩素(wogonin，度值為31)、豆甾醇(stigmasterol，度值為30)、黃芩素(baicalein，度值為24)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，度值為17)等成分度值較高，推測上述化合物可能是玉女煎治療牙周炎的關(guān)鍵成分。

表1 玉女煎活性成分信息Tab 1 Active components of Yunv decoction

圖1 玉女煎活性成分靶點與牙周炎治療相關(guān)靶點韋恩圖Fig 1 Venn diagram of targets of active components of Yunv decoction and periodontitis treatment-related targets

圖2 玉女煎治療牙周炎藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Network of drug-components-targets of Yunv decoction in the treatment of periodontitis

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

玉女煎治療牙周炎的潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)見圖3，圖中節(jié)點的大小及其顏色的深淺與其度值成正比。選取度值排名前12的靶點為玉女煎治療牙周炎的關(guān)鍵靶點，具體為Jun原癌基因(JUN)、腫瘤壞死因子(TNF)、RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Akt1)、P53抑癌基因(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、白細胞介素6(IL-6)、轉(zhuǎn)錄因子p65(RELA)、雌激素受體α(ESR1)、原癌基因c-Fos(FOS)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、C-X-C基序趨化因子配體8(CXCL8)和熱休克蛋白90α家族A類成員1(HSP90AA1)，見表2。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 3 Network of protein-protein interaction

表2 玉女煎治療牙周炎的潛在靶點信息(度值排序居前12位)Tab 2 Information of potential targets of Yunv decoction in the treatment of periodontitis (top 12，ranking by degree)

2.4 GO功能與KEGG通路富集分析

GO功能與KEGG通路富集分析結(jié)果見圖4—5。玉女煎參與調(diào)節(jié)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合和蛋白質(zhì)特殊結(jié)構(gòu)域結(jié)合等分子功能，作用于膜筏、細胞外基質(zhì)和細胞內(nèi)囊泡等細胞組分，參與細胞炎癥反應(yīng)、脂多糖應(yīng)答和血管生成等生物過程。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGE)-其受體(RAGE)信號通路、EB病毒感染、TNF信號通路和IL-17信號通路等信號通路可能是玉女煎治療牙周炎的關(guān)鍵通路。

圖4 玉女煎作用靶點GO功能富集分析Fig 4 GO functional enrichment analysis of targets of Yunv decoction

圖5 玉女煎作用靶點的KEGG通路富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis of targets of Yunv decoction

2.5 玉女煎治療牙周炎“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

將KEGG通路富集分析中，校正后P值排序居前20位的條目作為重要通路，利用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。由圖6可見，該網(wǎng)絡(luò)有139個節(jié)點，715條邊；其中菱形節(jié)點代表藥物成分，矩形節(jié)點代表通路，六邊形節(jié)點代表靶點，邊代表相互作用關(guān)系。度值的大小與在網(wǎng)絡(luò)中的重要程度成正比。其中，Akt1、RELA、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS2)、JUN、胱天蛋白酶3(CASP3)和TNF等靶點度值排在前列，說明上述靶點可能在玉女煎治療牙周炎過程中發(fā)揮重要的作用。以上結(jié)果可以得出，玉女煎的各成分通過多靶點、多信號通路來治療牙周炎。

圖6 玉女煎治療牙周炎的成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig 6 Network of component-target-pathway of Yunv decoction in the treatment of periodontitis

3 討論

中醫(yī)將牙周炎歸為“牙宣”“齒動”和“齒豁”等范疇，該病主要由胃火上炎、腎陰虧虛和氣血不足等原因引起，故治療主要以滋陰補腎、清瀉胃火和補氣養(yǎng)血為原則[12]。玉女煎方中，知母具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效，熟地黃、麥冬具有清熱養(yǎng)陰的功效，牛膝能夠補腎益髓，石膏能夠瀉火除煩，諸藥合用，共同發(fā)揮補腎、滋陰、清熱和增液的功效。研究結(jié)果表明，玉女煎能改善牙周癥狀，提高患者生活質(zhì)量，對牙周炎有顯著的治療效果[8,13-14]。牙周炎在牙周疾病中較為常見，菌斑微生物是其始動因素，在應(yīng)對感染引發(fā)的免疫反應(yīng)過程中，宿主產(chǎn)生的酶、細胞因子和炎癥介質(zhì)等可破壞牙周支持組織[15]。故臨床上主要通過控制菌斑、殺滅微生物、促進牙周支持組織再生與重建和減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生等方式治療牙周炎。

玉女煎中槲皮素、山柰酚、漢黃芩素、黃芩素和豆甾醇等成分在牙周炎的治療中發(fā)揮了重要作用。槲皮素作為天然的黃酮類化合物，其對牙周炎的治療有獨特的抗菌、抗炎作用[16]。槲皮素對牙周關(guān)鍵病原菌牙齦卟啉單胞菌和放線菌等有顯著療效[17]；還可以干擾核因子κB(NF-κB)通路，影響炎癥反應(yīng)的進程[18]。此外，槲皮素對受損牙周組織的保護和修復也有影響。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予槲皮素后，牙周炎鼠模型的平均骨吸收明顯減少，槲皮素還能降低ROS水平，上調(diào)膠原蛋白的表達，促進傷口愈合，恢復牙周軟組織[19-20]。山柰酚作為同時存在于知母和牛膝中的黃酮類成分，能夠抑制TNF-α釋放，增加IL-10的表達和分泌，發(fā)揮明顯的抗炎作用[21-22]。牙周支持組織的重建也是牙周炎治療的目標之一。黃芩素和漢黃芩素是存在于牛膝中的兩類黃酮類成分，能促進人牙周膜細胞的增殖和基質(zhì)礦化，使破骨細胞的分化得到抑制，進而使成熟破骨細胞不斷凋亡[23-24]。此外，黃芩素還能通過調(diào)節(jié)NF-κB通路來抑制脂多糖誘導的炎癥因子的產(chǎn)生[25]。豆甾醇作為植物甾醇的典型代表之一，不僅在抗腫瘤、抗炎方面具有良好的作用，而且在降低膽固醇、改善記憶等方面也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢[26]。以上結(jié)果表明，玉女煎治療牙周炎的活性成分中，度值排序靠前的多種成分均來自牛膝，猜測牛膝可能在牙周炎的治療過程中發(fā)揮重要的作用。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)分析，推測玉女煎治療牙周炎的主要靶點包括JUN、TNF、Akt1、TP53、MAPK14和IL-6等。TNF-α可以激活下游的信號通路，參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細胞凋亡及免疫反應(yīng)等過程[27]。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α在牙周炎炎癥反應(yīng)的啟動、牙槽骨吸收和結(jié)締組織附著喪失中起到核心作用[28]。NF-κB信號通路能夠被TNF-α激活，TNF-α能促進炎癥因子如IL-6、IL-8等的釋放，影響機體炎癥反應(yīng)的進程[29]。TNF-α能使破骨細胞不斷生成且使破骨細胞活性不斷提升，進而達到牙槽骨的吸收的目的[30]。此外，TNF-α還可促進基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的分泌，加速膠原纖維的分解破壞和基質(zhì)細胞的凋亡，抑制牙周組織的修復再生等，進而使牙周炎的癥狀加深加重[31]。應(yīng)用抗TNF-α受體治療，可使牙周炎患者的牙槽骨吸收減少近50%，其他臨床指標也得到改善[15,32]。作為炎癥細胞因子之一的IL-6，與牙周疾病的發(fā)展過程也呈現(xiàn)關(guān)聯(lián)性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在慢性牙周炎中，IL-6介導炎癥反應(yīng)，促進IL-1、MMP等細胞因子的大量釋放，通過直接降解膠原或激活纖溶蛋白酶級聯(lián)來破壞結(jié)締組織，也可以激活MMP和內(nèi)源性抑制劑之間的失衡，導致炎癥牙周組織的細胞外基質(zhì)病理性降解，加劇牙周組織損傷，導致牙齒脫落[33-34]。此外，IL-6還可以促進破骨細胞分化因子的產(chǎn)生，抑制牙周膜的再生，其濃度的變化與牙周炎的炎癥程度有一定相關(guān)性[35-36]。Akt1作為廣泛分布于組織中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞增殖等多種生物學過程[37]。JUN屬于原癌基因，TP53為抑癌基因，兩者之間作用拮抗，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[38]

玉女煎治療牙周炎的通路主要包括AGE-RAGE信號通路、癌癥通路、EB病毒感染、TNF信號通路和IL-17信號通路等。AGEs與細胞膜上的RAGE結(jié)合啟動下游信號級聯(lián)反應(yīng)，與動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、衰老以及某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[39]。研究結(jié)果表明，AGEs和RAGE與口腔炎癥性疾病關(guān)系密切，牙周炎患者牙齦上皮RAGE的表達較健康人明顯增加[40]。AGEs通過RAGE及其下游NF-κB、MAPK和Akt等信號通路，通過影響炎癥反應(yīng)，調(diào)控成骨分化、細胞凋亡、增殖和自噬等過程，在口腔疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著復雜的作用[41]。TNF信號通路與炎癥、細胞凋亡密切相關(guān)，不僅可以使NF-κB等因子的表達上調(diào)，達到募集白細胞的效果，而且能實現(xiàn)炎癥級聯(lián)放大等效應(yīng)，還能影響牙周骨穩(wěn)態(tài)失衡，影響牙周炎的發(fā)展進程[42]。EB病毒感染與慢性牙周炎關(guān)系十分密切，可能通過促進牙周致病菌的黏附和侵襲、直接破壞牙周組織、誘發(fā)炎癥反應(yīng)和干擾免疫系統(tǒng)等方面促進牙周炎的發(fā)生發(fā)展[43]。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，探討了玉女煎治療牙周炎的有效成分及分子機制。由于中藥成分及其作用的復雜性，還需要開展體內(nèi)外實驗對結(jié)果進行驗證，以期為牙周炎的中醫(yī)藥治療提供理論依據(jù)。