白雨鑫，童榮生，李晉齊

(1.四川省骨科醫(yī)院藥學(xué)部，成都 610072； 2.四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部，成都610072)

虎杖解毒顆粒(無糖型)為四川省人民醫(yī)院的醫(yī)院制劑(批準文號為川藥制字Z20080173)，已在臨床應(yīng)用30余年，清熱、解毒療效顯著，廣受患者好評[1-2]。根據(jù)臨床實際需要，結(jié)合該制劑載藥量的要求，擬研制成無糖顆粒。課題組前期開展了虎杖解毒顆粒(無糖型)成型工藝研究，獲得了穩(wěn)定可行的制備工藝[3]。為保證工藝變更后產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，本研究對虎杖解毒顆粒(無糖型)的質(zhì)量標準進行了研究。根據(jù)《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)通則[4]，測定其粒徑、水分、溶化性和裝量差異，采用薄層色譜法定性鑒別虎杖解毒顆粒(無糖型)中的虎杖、板藍根和川射干3味藥材，采用高效液相色譜法定量測定顆粒中虎杖苷、大黃素的含量，采用加速穩(wěn)定性實驗對顆粒樣品進行穩(wěn)定性考察，以期為虎杖解毒顆粒(無糖型)的質(zhì)量控制提供依據(jù)[5-7]。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀，Waters 2998PDA型檢測器，Empower3色譜數(shù)據(jù)工作站(美國 Waters公司)；BP211D型十萬分之一電子分析天平(德國Sartorius公司)；優(yōu)普ULPHW型純水機(成都超純科技有限公司)；KX-85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)；雙框沖壓型標準藥典篩(浙江紹興市不銹鋼篩廠，1號、3號和5號藥典篩)。

1.2 藥品與試劑

虎杖苷(批號：11575-200502)、L-精氨酸(C6H14N4O2)、大黃素(批號：110756-200110)、大黃素甲醚(批號：110578-200610)、射干苷(批號：111632-200501)、虎杖對照藥材(批號：110980-200902)、板藍根對照藥材(批號：121177-201006)和川射干對照藥材(批號：110264-200902)均購自中國食品藥品檢定研究院；薄層層析硅膠板(青島海洋化工廠分廠)；甲醇、乙腈為色譜純(美國DIKMA公司)；磷酸、乙酸乙酯、石油醚、甲酸乙酯、甲酸甲酯、正丁醇、冰醋酸、濃硫酸、三氯甲烷、丁酮和乙醚為分析純，均購于成都市科龍化工試劑廠；試驗用水超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀評價

本品為棕黃色至棕色顆粒，顆粒大小適中，色澤均勻，氣微香，味微甜，無吸潮、結(jié)塊現(xiàn)象。

2.2 粒度檢查

稱取3批顆粒各50 g，按《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)通則“物理檢查法0982”(第二法雙篩分法)下的方法進行測定。結(jié)果顯示，3批顆粒中不合格顆粒均未超過顆?？偭康?5%，符合藥典規(guī)定。

2.3 溶化性檢查

稱取3批顆粒各10 g，加熱水200 mL(70 ℃)，用磁力攪拌器以固定轉(zhuǎn)速攪拌，攪拌5 min，立即觀察。結(jié)果顯示，3批顆粒全部溶化且無異物，符合藥典規(guī)定。

2.4 水分檢查

稱取3批顆粒各2 g，按《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)通則“水分測定法0832”(第二法烘干法)進行測定。結(jié)果顯示，3批顆粒的含水率均未超過6.0%，符合藥典規(guī)定。

2.5 裝量差異檢查

從3批顆粒中各隨機抽取10袋，去除包裝，分別稱定每袋內(nèi)容物的重量，并與標示重量比較。結(jié)果顯示，3批樣品顆粒的裝量差異<±5%，符合藥典規(guī)定。

2.6 鑒別

參考《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)及大量相關(guān)文獻中資料，應(yīng)用通則“0502薄層色譜法”對方中藥材進行定性鑒別。結(jié)果顯示，虎杖、川射干和板藍根色譜斑點顯色清晰，可作為制劑質(zhì)量鑒別，但白芷、貫眾和青蒿專屬性不佳，未能納入質(zhì)量標準草案鑒別項。

2.6.1 虎杖的薄層鑒定：參照相關(guān)方法[8-11]，將虎杖解毒顆粒(無糖型)研細后過三號篩，稱取過篩粉末0.3 g，加入甲醇20 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h后濾過，揮干濾液，向殘渣中加入硫酸(2.5 mol/L)和氯仿各10 mL，100 ℃條件下加熱回流1 h，放冷，轉(zhuǎn)移液體至分液漏斗中，加入氯仿10 mL振搖，收集氯仿液，重復(fù)2次后合并氯仿液，水浴蒸干，用1 mL氯仿液溶解殘渣，即得供試液。處方中去除虎杖藥材，以原工藝制備陰性樣品，稱取陰性樣品0.3 g、虎杖對照藥材0.1 g，按供試液制備法制得陰性對照溶液、對照藥材溶液。以甲醇為溶劑制備0.5 mg/mL的大黃素對照品溶液、大黃素甲醚對照品溶液。吸取上述5種溶液，各5 μL，在同一硅膠GF薄層板上點樣(樣品液點樣2份)，展開劑選定2種，分別為石油醚-甲酸乙酯-甲酸(V∶V∶V=15∶ 5∶ 1)的上層溶液和石油醚-甲酸甲酯-甲酸(V∶V∶V=15∶ 5∶ 1)的上層溶液[12]。跑板結(jié)束后取出晾干，置紫外燈(365 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品在對照藥材與大黃素、大黃素甲醚對照品的薄層色譜的相同位置上顯示相同顏色的斑點，陰性對照品的相應(yīng)位置沒有斑點，見圖1。

A.展開劑1；B.展開劑2；1.對照藥材；2.陰性對照品；3.大黃素甲醚；4.大黃素；5—6.供試品A. developing solvent 1; B. developing solvent 2; 1. control reference; 2. negative control reference; 3. physcion; 4. emodin; 5-6. samples for test

2.6.2 板藍根的薄層鑒別：參考相關(guān)方法[13-14]，將虎杖解毒顆粒(無糖型)研細后過三號篩，稱取過篩粉末0.5 g，加入稀乙醇20 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h后濾過，揮干濾液，加稀乙醇1 mL溶解殘渣，即得供試液。處方中去除板藍根藥材，以原工藝制備陰性樣品，稱取陰性樣品0.5 g、板藍根對照藥材0.2 g，按供試液制備法制得陰性對照溶液、對照藥材溶液。以稀乙醇為溶劑制備0.5 mg/mL的精氨酸對照品溶液。吸取上述4種溶液，各5 μL，在同一硅膠GF薄層板上點樣(樣品液點樣2份)，展開劑選定2種，分別為正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=19∶ 5∶ 5)和正丁醇-冰醋酸-水(V∶V∶V=22∶ 6∶ 3)，跑板結(jié)束后取出晾干，噴以茚三酮顯色試液，吹風(fēng)加熱至斑點清晰。結(jié)果顯示，日光燈下，供試品在對照藥材與精氨酸對照品的薄層色譜的相同位置上顯示相同顏色的斑點，陰性對照品的相應(yīng)位置沒有斑點，見圖2。

A.展開劑1；B.展開劑2；1.精氨酸；2.陰性對照品；3.對照藥材；4—5.供試品A. developing solvent 1; B. developing solvent 2; 1. arginine; 2. negative control reference; 3. control reference; 4-5. samples for test

2.6.3 川射干的薄層鑒別：參考相關(guān)方法[15]，將虎杖解毒顆粒(無糖型)研細后過三號篩，稱取過篩粉末0.5 g，加甲醇10 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)0.5 h后濾過，揮干濾液，加1 mL甲醇溶解殘渣，即得供試液。處方中去除川射干藥材，以原工藝制備陰性樣品，稱取陰性樣品0.5 g、川射干對照藥材0.5 g，按供試液制備法制得陰性對照溶液、對照藥材溶液。以甲醇為溶劑制備0.5 mg/mL的射干苷對照品溶液。吸取上述4種溶液，各5 μL，在同一硅膠GF薄層板上點樣(樣品液點樣2份)，展開劑選定2種，分別為三氯甲烷-丁酮-甲醇(V∶V∶V=3∶ 1∶ 1)和三氯甲烷-冰醋酸-甲醇(V∶V∶V=8∶ 0.2∶ 2)，跑板結(jié)束后取出晾干，置紫外線燈(254 nm)下檢視。結(jié)果顯示，供試品在對照藥材與射干苷對照品的薄層色譜的相同位置上顯示斑點，陰性對照品的相應(yīng)位置沒有斑點，見圖3。

A.展開劑1；B.展開劑2；1.對照藥材；2.陰性對照品；3.射干苷；4—5.供試品A. developing solvent 1; B. developing solvent 2; 1. control reference; 2. negative control reference; 3. tectoridin; 4-5. samples for test

2.7 含量測定

2.7.1 虎杖苷含量測定：(1)色譜條件。色譜柱為Phenom Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-水(V∶V=15∶ 85)；檢測波長為306 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL。(2)溶液的制備。將虎杖解毒顆粒(無糖型)研細后過三號篩，精密稱定過篩粉末(約0.5 g)入棕色容量瓶中，加甲醇40 mL，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h，放冷再精密定容，搖勻溶液，經(jīng)0.45 μm有機系微孔濾膜濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液[16]。處方中去除虎杖藥材，以原工藝制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。精密稱取干燥后的虎杖苷對照品，加甲醇制得8.83 μg/mL的對照品溶液。(3)系統(tǒng)適用性實驗。取虎杖苷對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，在上述色譜條件下進樣。結(jié)果顯示，虎杖苷色譜峰與其他組分分離良好，與其相鄰色譜峰的分離度>1.5，陰性對照溶液在虎杖苷色譜峰位置上無干擾，虎杖苷保留時間為24.738 min，該法具有良好的專屬性，見圖4。(4)方法學(xué)考察。采用高效液相色譜法，精密吸取上述虎杖苷對照品溶液2、4、6、8、10、14、18和20 μL，進樣測定。結(jié)果顯示，虎杖苷在0.017 6 6～0.176 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 8)。連續(xù)進樣6次，虎杖苷平均含量為1.071 5 mg/g，RSD為0.95%，儀器精密度良好。穩(wěn)定性、重復(fù)性考察結(jié)果的RSD分別為1.22%、1.12%。加樣回收率考察結(jié)果平均值為98.79%，RSD為1.97%。(5)樣品測定。取3批虎杖解毒顆粒(無糖型)樣品，每批取3份，每份0.5 g，制備供試品溶液，進樣測定。計算得出不同批次虎杖苷含量范圍為1.064 2～1.075 6 mg/g，平均含量為1.070 3 mg/g，RSD為0.54%。根據(jù)上述試驗結(jié)果，考慮到藥材的來源、制劑生產(chǎn)和貯藏等因素，暫定本品每袋含虎杖以虎杖苷計，不得少于8 mg/g。

A.虎杖解毒顆粒(無糖型)供試品；B.虎杖苷對照品；C.虎杖苷陰性對照品A. sample of Huzhang antidote granules (sugar-free); B. reference substance of polydatin; C. negative control reference of polydatin

2.7.2 大黃素含量測定：(1)色譜條件。色譜柱為Phenomenex Gemini C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液(V∶V=72∶ 28)；檢測波長為254 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進樣量為10 μL[17]。(2)溶液的制備。將虎杖解毒顆粒(無糖型)研細后過三號篩，精密稱定過篩粉末(約0.5 g)入棕色容量瓶中，加40 mL甲醇，超聲(功率720 W，頻率40 kHz)1 h，放冷再精密定容，搖勻溶液，經(jīng)0.45 μm有機系微孔濾膜濾過，精確量取9 mL續(xù)濾液，揮干濾液，向殘渣中加入硫酸(2.5 mol/L)和氯仿各10 mL，100 ℃條件下加熱回流1 h，放冷，轉(zhuǎn)移液體至分液漏斗中，加入氯仿10 mL振搖，收集氯仿液，重復(fù)2次后合并氯仿液，水浴揮干，用甲醇溶解殘渣并精密定容至10 mL容量瓶中，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液[18]。處方中去除虎杖藥材，以原工藝制備陰性樣品，參照供試品溶液制備方法制得陰性對照溶液。精密稱取干燥后的大黃素對照品，加甲醇制得7.28 g/mL的對照品溶液。(3)系統(tǒng)適用性實驗。取大黃素對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，以上述色譜條件進樣。結(jié)果顯示，大黃素色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度>1.5，大黃素保留時間為16.803 min，陰性對照溶液在該位置上無干擾，該法具備良好專屬性，見圖5。(4)方法學(xué)考察。利用高效液相色譜，精密吸取上述大黃素對照品溶液2、4、6、8、10、14、18和20 μL，進樣測定。結(jié)果顯示，大黃素在0.014 56～0.145 6 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 9)。連續(xù)進樣6次，大黃素平均含量為0.675 9 mg/g，RSD為0.68%，儀器精密度良好。穩(wěn)定性、重復(fù)性考察結(jié)果的RSD分別為1.7%、1.67%。加樣回收率考察結(jié)果平均值為101.53%，RSD為1.63%。(5)樣品測定。取虎杖解毒顆粒(無糖型)樣品3批，每批3份，每份0.5 g，制備供試品溶液，進樣測定。結(jié)果顯示，不同批次的大黃素含量范圍為0.682 4～0.701 2 mg/g，平均含量為0.694 2 mg/g，RSD為1.48%。根據(jù)上述試驗結(jié)果，考慮到藥材的來源、制劑生產(chǎn)和貯藏等因素，暫定本品每袋含虎杖以大黃素計，不得少于5 mg/g。

A.虎杖解毒顆粒(無糖型)供試品；B.大黃素對照品；C.大黃素陰性對照品A. sample of Huzhang antidote granules (sugar-free); B. reference substance of emodin; C. negative control reference of emodin

2.8 虎杖解毒顆粒(無糖型)的加速穩(wěn)定性實驗

為考察顆粒質(zhì)量穩(wěn)定性，將3批樣品(市售包裝)，置溫度為40 ℃±2 ℃，相對濕度為75%±5%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，于第1個月、2個月和3個月取樣，進行含量測定和薄層鑒別，并考察記錄顆粒性狀、粒度、水分、溶化性和裝量差異情況，結(jié)果見表1。與0個月考察結(jié)果進行對比，在實驗期內(nèi)，3批制劑樣品的各項檢查指標均符合規(guī)定，在加速穩(wěn)定性實驗條件下質(zhì)量基本穩(wěn)定[19]。

表1 加速穩(wěn)定性實驗結(jié)果Tab 1 Results of accelerated stability

3 討論

3.1 顆粒劑質(zhì)量檢查

參照《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)，檢查了3批顆粒樣品的粒徑、溶化性、水分和裝量的差異，結(jié)果表明，顆粒質(zhì)量符合規(guī)定。

3.2 薄層色譜法鑒別

為了控制制劑的質(zhì)量，保證療效，對處方中的藥材進行薄層鑒別。為確保鑒別結(jié)果科學(xué)可靠，本研究對方中虎杖、川射干和板藍根均選擇2種不同的展開劑進行分離。結(jié)果顯示，不同展開劑條件下分離效果均理想，斑點清晰，陰性無干擾；并且3批顆粒樣品結(jié)果一致，表明鑒別方法穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性高，可作為該顆粒的質(zhì)量控制方法。

3.3 含量測定

本研究中，虎杖苷和大黃素的含量測定直接參照《中華人民共和國藥典：四部》(2020年版)虎杖的含量測定方法。實驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)虎杖苷采用藥典流動相條件(乙腈-水，V∶V=23∶ 77)時，雜質(zhì)干擾很大，虎杖苷不能與相鄰的色譜峰完全分離。根據(jù)經(jīng)驗和對實驗條件的不斷探索，以乙腈-水(V∶V=15∶ 85)為流動相，以去除其他成分的干擾。

綜上所述，本研究對虎杖解毒顆粒(無糖型)的質(zhì)量進行了考察，建立了虎杖、板藍根和川射干共3味中藥的薄層色譜鑒別法，以及以虎杖苷、大黃素為指標成分的高效液相色譜含量測定方法。加速穩(wěn)定性實驗結(jié)果證明制劑具有較好的穩(wěn)定性，工業(yè)生產(chǎn)后可長期保質(zhì)存放，有效期的最終確立可待繼續(xù)考察。本研究為虎杖解毒顆粒(無糖型)的質(zhì)量研究提供了實驗依據(jù)，建立的方法準確可靠、專屬性強、重復(fù)性好，可用于虎杖解毒顆粒(無糖型)的質(zhì)量控制。