張笑瑞, 曹 靜, 吳倩倩, 康 康, 陳國(guó)元, 吳寶金

(1. 中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái),上海 200031; 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,上海 200031)

腸淋巴系統(tǒng)參與機(jī)體免疫細(xì)胞運(yùn)輸［1］、體液平衡［2］、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)［3］、腸道飽腹感信號(hào)的傳遞［4］和膳食脂質(zhì)的運(yùn)輸［5］。在病理狀態(tài)下，淋巴液中會(huì)出現(xiàn)腫瘤細(xì)胞和病毒等特異性生物標(biāo)志物［6-7］，其含量顯著高于外周血［8-9］，通過分析淋巴液有助于了解病理機(jī)制并進(jìn)行早期診斷。自1948年Bollman等［10］首次建立了大鼠腸系膜淋巴液引流技術(shù)以來，越來越多的研究者利用該技術(shù)開展各種研究。但在引流腸系膜淋巴液時(shí)，動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間處于麻醉或被限制的狀態(tài)［11-13］，導(dǎo)致動(dòng)物腸系膜淋巴液流速和淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降［14］，部分實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物還需接受胃或十二指腸插管手術(shù)以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生額外的損傷，這些因素均會(huì)影響腸系膜淋巴系統(tǒng)的研究和該方法的應(yīng)用。

近年來，有研究者采用一種大鼠膽汁輔助回流裝置，實(shí)現(xiàn)了膽汁的實(shí)時(shí)連續(xù)收集，被廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)疾病方面的研究［15］。本文采用這種膽汁輔助回流裝置，建立大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)大鼠在清醒自由狀態(tài)下實(shí)時(shí)、長(zhǎng)期收集淋巴液，且能避免手術(shù)應(yīng)激、全身麻醉或動(dòng)物受限對(duì)腸系膜淋巴液形成和組成的影響，從而為腸系膜淋巴系統(tǒng)功能的深入研究提供一種創(chuàng)新的腸系膜淋巴液采集的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠16 只，8 周齡，體質(zhì)量（250±9）g，購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（滬）2018-0004、SCXK（滬）2019-0001］，質(zhì)量合格證號(hào)為20180004058749、20211221Aazz061900169。所有大鼠均飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障設(shè)施［SYXK（滬）2018-0007］，自由飲食，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，噪聲≤60 dB，生活照明20 lx（12/12 h明暗循環(huán)）；全部大鼠每籠不超過3只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。本研究中所有實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（IACUC No.SIBCB-S118340-2112-045），手術(shù)操作均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》在超凈工作臺(tái)中完成。

1.2 儀器與試劑

體視顯微鏡（SZX16）為日本Olympus 公司產(chǎn)品；微量注射泵（XFP01-BD）為蘇州訊飛科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；全自動(dòng)血液分析儀XN-1000 為日本SYSMEX（希森美康） 公司產(chǎn)品；大鼠2 通道VAB 系繩（VABR2T/25）、大鼠2 通道血管通路按鈕（VABR2B/25R22）、大鼠2 通道VAB 回路連接器（VABR2L）、PinPort 進(jìn)樣器（PNP3M）、2 通道轉(zhuǎn)子（375/D/25LT）、多軸平衡臂（MCLA/MED）、 大鼠采樣籠器具（MTANK/WF） 和 聚 氨 酯（polyurethane，PU） 導(dǎo) 管（BTPU-027、BTPU-040）均購自美國(guó)Instech公司，硅膠導(dǎo)管（3 Fr、5 Fr） 購自美國(guó)SAI 公司。舒泰50（Zoletil 50） 購自法國(guó)Virbac 公司；醫(yī)用組織膠水（1469SB）購自美國(guó)3M 公司；全血稀釋液CELLPACK DCL，溶血?jiǎng)㎜ysercell WNR和LysercellTM WDF，血細(xì)胞分析用染色液Fluorocell WNR、Fluorocell WDF 和Fluorocell PLT，清洗液和校準(zhǔn)品（XN CAL/XN CAL PF）均購自日本SYSMEX（希森美康）公司；體外診斷試劑干片購自美國(guó)Ortho公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組與模型制備

將16 只雄性SD 大鼠隨機(jī)分為2 組（8 只/組）：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。麻醉狀態(tài)下，實(shí)驗(yàn)組行腸淋巴管及頸靜脈雙插管手術(shù)，建立大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流技術(shù)模型；對(duì)照組行腸系膜淋巴管及十二指腸雙插管手術(shù)，建立傳統(tǒng)引流模型。圖1 示大鼠腸系膜淋巴液收集裝置，圖2示大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流模型建立過程圖。

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備

（1）動(dòng)物術(shù)前準(zhǔn)備：大鼠術(shù)前0.5 h口服灌胃玉米油（5 mL/kg），隨著小腸脂質(zhì)的吸收產(chǎn)生乳白色的乳糜微粒，定位腸系膜淋巴管［16］。

（2）制備大鼠頸靜脈套管：將5 Fr硅膠管套至PU管（BTPU-027）形成固定扣。制備大鼠腸系膜淋巴管套管：將3 Fr硅膠導(dǎo)管套至PU管（BTPU-040）。用酒精燈加熱PU管尖端，使其成圓弧狀（圖1A）。

圖1 大鼠腸系膜淋巴液收集Figure 1 Collection of rat intestinal lymphatic fluid

1.3.2 實(shí)驗(yàn)組模型制備

（1）腸系膜淋巴管插管：在腹中線上腹部2/3處做3～4 cm的正中切口，打開腹膜腔。用無菌紗布將胃腸臟器推至左腹側(cè)腹膜下固定，暴露出左腎靜脈和下腔靜脈區(qū)域，此時(shí)可觀察到與腸系膜動(dòng)脈（鮮紅色、有波動(dòng)感）并行的乳白色腸系膜淋巴管（圖2A）。在體視顯微鏡下分離腸系膜淋巴管（直徑0.5～1 cm），并用動(dòng)脈夾和結(jié)扎線臨時(shí)阻斷通路。在淋巴管上方45°角做切口，插入淋巴導(dǎo)管并下行1 cm，此時(shí)可見導(dǎo)管中的淋巴液流動(dòng)，分別固定1 cm 固定扣和淋巴管腸端。取出紗布，將導(dǎo)管呈C 型緊貼于腹壁內(nèi)側(cè)，并將導(dǎo)管4 cm、5.5 cm 和7 cm 處的固定扣固定于腹壁內(nèi)肌肉（圖2B），臟器位置還原至原始狀態(tài)。將導(dǎo)管另一端引導(dǎo)并接入頸部VAB的淋巴管端口。

（2）頸靜脈插管：在頸腹部左側(cè)鎖骨區(qū)域的皮膚上做0.5 cm 的切口，暴露頸外靜脈，并用動(dòng)脈夾和結(jié)扎線臨時(shí)阻斷通路（圖2C）。在血管上方45°角做切口，根據(jù)大鼠頸部血管走勢(shì)，插入靜脈導(dǎo)管并下行3.5 cm 到達(dá)左鎖骨下靜脈處，分別固定導(dǎo)管3.5 cm 處固定扣和頸淺靜脈近心端（圖2D）。將導(dǎo)管另一端引導(dǎo)并接入VAB的頸靜脈端口。完成插管后，將VAB和VAB回路連接器相連（圖2E，圖2F），縫合創(chuàng)口。

圖2 大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流模型建立過程圖Figure 2 Establishment of auxiliary reflux model of mesenteric lymph

（3）清醒活動(dòng)裝置連接：將VAB、2 通道VAB 系繩、轉(zhuǎn)子、多軸平衡臂、采樣籠盒連接，將收集導(dǎo)管放置在淋巴插管的高度（圖1B，圖1C）。

1.3.3 對(duì)照組模型制備

（1）腸系膜淋巴管插管：手術(shù)位置同實(shí)驗(yàn)組，在腸系膜淋巴管上穿刺并插入導(dǎo)管，組織膠水固定。插管成功后將導(dǎo)管的另一端穿出體外，以收集淋巴液。

（2）十二指腸插管：在幽門下方約2 cm 的十二指腸上穿刺并插入導(dǎo)管，組織膠水固定后，將導(dǎo)管另一端傳出體外連接至微量注射泵，將大鼠放置固定器內(nèi)（圖1E）。

1.4 淋巴液流量測(cè)定

對(duì)照組大鼠在術(shù)后連續(xù)1 h收集腸系膜淋巴液，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后恢復(fù)7 d 后連續(xù)1 h 收集腸系膜淋巴液。收集過程中以3 mL/h 的速度將林格液分別注入十二指腸和頸靜脈管中，對(duì)大鼠進(jìn)行補(bǔ)液［17］。測(cè)量單位小時(shí)內(nèi)收集的淋巴液體積，計(jì)算腸系膜淋巴液流量。

1.5 淋巴液細(xì)胞成分測(cè)定

定量提取20 μL 淋巴液與120 μL CELLPACK DCL稀釋液，混勻。使用全自動(dòng)血液分析儀XN-1000 檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)（total number of white blood cells，WBC）、中性粒細(xì)胞數(shù)（number of neutrophil，NEUT#）、淋巴細(xì)胞數(shù)（number of lymphocyte，LYM#）、單核細(xì)胞數(shù)（number of monocyte，MONO#）、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)（number of eosinophilia，EOS#）、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)（number of basophil，BASO#）、中性粒細(xì)胞比例（percentage of neutrophil，NEUT/%）、淋巴細(xì)胞百分率（percentage of lymphocyte，LYM/%）、單核細(xì)胞比例（percentage of monocyte，MONO/%）、嗜酸性粒細(xì)胞百分比（percentage of eosinophilia，EOS/%）和嗜堿性粒細(xì)胞百分比（percentage of basophil，BASO/%）。

1.6 淋巴液生化成分測(cè)定

收集的淋巴液靜置30 min后離心（5 min，3 000 r/min），取得上清液，檢測(cè)電解質(zhì)指標(biāo)K+、Na+、Cl-、Ca2+、Mg2+和P3+，物質(zhì)代謝指標(biāo)尿素（urea，UREA）、肌酐（creatinine，CRE）、尿酸（uric acid，URIC）、葡萄糖（glucose，GLU）、三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，CHO）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL），蛋白水平指標(biāo)總蛋白（total protein，TP）和白蛋白（albumin，Alb），以及酸堿指標(biāo)二氧化碳（CO2）。

1.7 麻醉方法

使用舒泰50 以50 mg/kg 的劑量肌內(nèi)注射給SD 大鼠，觀察大鼠呼吸頻率降低、肌肉舒張和無疼痛反射后，將其仰臥位置于手術(shù)臺(tái)上，四肢用膠帶固定。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)分析和繪圖使用GraphPad Prism 8.0 軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示。淋巴液流量測(cè)定數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，其余數(shù)據(jù)比較采用多個(gè)樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流技術(shù)模型的效果

行腸淋巴管及頸靜脈雙插管手術(shù)建立的大鼠腸系膜淋巴管-頸靜脈輔助回流模型與清醒活動(dòng)裝置組成了一個(gè)大鼠腸系膜淋巴液引流系統(tǒng)，該系統(tǒng)在術(shù)后第7天仍可以實(shí)時(shí)收集腸系膜淋巴液。并且，在此期間動(dòng)物無異常。

2.2 淋巴液流速測(cè)定

經(jīng)測(cè)定，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腸系膜淋巴液流量為（2.01±0.12）mL/h，對(duì)照組流量為（0.92±0.09）mL/h。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物腸系膜淋巴液流量顯著升高（P＜0.01）。

2.3 淋巴液細(xì)胞成分

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠淋巴液中LYM#和LYM/%顯著升高（P＜0.01，P＜0.05），NEUT/%和MONO/%顯著降低（均P＜0.01），其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠淋巴液細(xì)胞成分Table 1 Lymphocyte composition of rats in the control and experimental group（ ±s）

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠淋巴液細(xì)胞成分Table 1 Lymphocyte composition of rats in the control and experimental group（ ±s）

注：WBC 為白細(xì)胞總數(shù)，NEUT#為中性粒細(xì)胞數(shù)，LYM#為淋巴細(xì)胞數(shù)，MONO#為單核細(xì)胞數(shù)，EOS#為嗜酸性粒細(xì)胞，BASO#為嗜堿性粒細(xì)胞，NEUT/%為中性粒細(xì)胞比例，LYM/%為淋巴細(xì)胞百分率，MONO/%為單核細(xì)胞比例，EOS/%為嗜酸性粒細(xì)胞百分比，BASO/%為嗜堿性粒細(xì)胞百分比。與對(duì)照組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note: WBC, total number of white blood cells; NEUT#, number of neutrophils; LYM#, number of lymphocytes; MONO#, number of monocytes; EOS#, number of eosinophilia; BASO#, number of baso-phils; NEUT/%, percentage of neutrophils; LYM/%, percentage of lymphocytes; MONO/%, percentage of monocytes; EOS/%,percentage of eosinophilia;BASO/%,percentage ofbasophils.Compared to the control group, ★P＜0.05, ★★P＜0.01.

血細(xì)胞分類Blood cell classification WBC/(109·L-1)NEUT#/(109·L-1)LYM#/(109·L-1)MONO#/(109·L-1)EOS#/(109·L-1)BASO#/(109·L-1)NEUT/%LYM/%MONO/%EOS/%BASO/%對(duì)照組Control group(n=8)7.48±3.45 0.79±0.42 2.14±1.03 4.54±2.36 0.01±0.01 0.01±0.01 11.20±4.51 28.23±6.78 60.36±9.81 0.15±0.12 0.06±0.07實(shí)驗(yàn)組Experimental group(n=8)14.01±9.93 0.45±0.20 7.34±4.89★6.21±5.09 0.01±0.01 0.01±0.00 4.35±2.16★★51.99±7.40★★43.44±6.61★★0.14±0.15 0.09±0.14

2.4 淋巴上清液生化指標(biāo)

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠淋巴液中K+、Na+、CO2、UREA顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），TG和P3+顯著降低（均P＜0.01），其他指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠淋巴液生化指標(biāo)Table 2 Comparison of biochemistry indexes of rats in the control and experimental group（ ±s）

表2 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組大鼠淋巴液生化指標(biāo)Table 2 Comparison of biochemistry indexes of rats in the control and experimental group（ ±s）

注：UREA為尿素，CRE為肌酐，URIC為尿酸，GLU為葡萄糖，TG為三酰甘油，CHO 為總膽固醇，HDL 為高密度脂蛋白，TP 為總蛋白，ALB為白蛋白。與對(duì)照組相比，★P＜0.05，★★P＜0.01。Note：UREA，urea；CRE，creatinine；URIC，uric acid；GLU，glucose；TG，triglyceride；CHO，total cholesterol；HDL，highdensity lipoprotein；TP，total protein；ALB，albumin. Compared to the control group，★P＜0.05，★★P＜0.01.

生化指標(biāo)Biochemical indicators Cl-c/(mmol·L-1)K+c/(mmol·L-1)Na+c/(mmol·L-1)P3+c/(mmol·L-1)Ca2+c/(mmol·L-1)Mg2+c/(mmol·L-1)UREA c/(mmol·L-1)CRE c/(μmol·L-1)URIC c/(mmol·L-1)GLU c/(mmol·L-1)TG c/(mmol·L-1)CHO c/(mmol·L-1)HDL c/(mmol·L-1)TP ρ/(g·L-1)ALB ρ/(g·L-1)CO2 c/(mmol·L-1)對(duì)照組Control group(n=8)99.75±1.85 4.75±0.74 136.75±1.48 3.79±0.18 2.65±0.11 0.90±0.13 5.13±0.33 23.56±8.91 37.81±21.46 12.83±3.01 3.63±1.02 1.69±0.16 1.16±0.13 47.05±2.35 24.81±1.91 22.50±2.45實(shí)驗(yàn)組Experimental group(n=8)100.75±1.71 5.74±0.21★★139.63±1.58★★3.49±0.11★★2.66±0.05 0.93±0.07 5.75±0.66★24.61±3.50 51.19±8.85 14.66±1.55 1.57±0.47★★1.62±0.20 1.15±0.15 45.31±1.19 23.51±0.66 27.25±1.09★★

3 討論

3.1 新方法的優(yōu)勢(shì)

文獻(xiàn)［14］報(bào)告，國(guó)內(nèi)外學(xué)者多選擇在動(dòng)物術(shù)后并處于麻醉或束縛的狀態(tài)下收集淋巴液，這雖然縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，且保證了樣本收集的成功率，但會(huì)帶來一些問題：（1）動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下會(huì)出現(xiàn)胃排空減少、小腸毛細(xì)血管通透性改變、淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降，本研究中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的淋巴液流速也證實(shí)了這一點(diǎn)；（2）只能間斷地收集淋巴液，不能準(zhǔn)確計(jì)算出經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)藥物的總量，使模型應(yīng)用受到了限制；（3）為了方便給藥，有學(xué)者還要對(duì)大鼠進(jìn)行十二指腸插管，通過導(dǎo)管持續(xù)輸注脂質(zhì)與藥物來評(píng)價(jià)其經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)移的能力，然而胃內(nèi)分泌物以及神經(jīng)傳導(dǎo)在整個(gè)消化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此在這種病理生理狀態(tài)下獲取的數(shù)據(jù)可能存在偏差；（4）動(dòng)物飲食受到限制，需要通過皮下注射或胃腸插管輸注營(yíng)養(yǎng)液來維持動(dòng)物體液平衡和體能。

本研究中使用的淋巴液收集系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)大鼠在完全清醒、自由活動(dòng)、不限制飲食的狀態(tài)下，實(shí)時(shí)并長(zhǎng)期收集淋巴液、血液或給藥，避免了手術(shù)應(yīng)激、全身麻醉或動(dòng)物受限對(duì)腸系膜淋巴液形成和組成的影響。該模型具有十分顯著的優(yōu)勢(shì)（表3）：（1）在插管完成后，利用VAB 回路連接器建立一條新的淋巴循環(huán)通路，動(dòng)物可以在愈后健康狀態(tài)下開展實(shí)驗(yàn)，避免麻醉、創(chuàng)傷、感染等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)造成干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物經(jīng)淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)更精確和長(zhǎng)期的測(cè)量；（2）通過建立淋巴液-血液循環(huán)通路，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求隨時(shí)阻斷腸系膜淋巴液，同時(shí)結(jié)合全自動(dòng)采血給藥儀，還可以實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化的淋巴液和血液采集或靜脈給藥；（3）由于淋巴引流的管路呈U 型結(jié)構(gòu)且兩端口的液面一致，根據(jù)等高液面壓強(qiáng)相等的原理，此時(shí)導(dǎo)管內(nèi)淋巴液流量等同于腸系膜淋巴管內(nèi)實(shí)際流量，并且在淋巴引流過程中，可以根據(jù)淋巴液流速和血液損耗量精準(zhǔn)補(bǔ)充等滲離子溶液，維持機(jī)體體液平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

表3 大鼠腸系膜淋巴液引流新舊技術(shù)對(duì)比Table 3 Comparison of novel and traditional techniques for intestinal lymphatic drainage in rats

3.2 淋巴液流速及成分的比較分析

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物淋巴液流速顯著升高，這可能與受試動(dòng)物的體質(zhì)量、脂質(zhì)攝入、麻醉或受約束以及感染等生理狀況有關(guān)［14，18］。在細(xì)胞成分檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的LYMPH#和LYMPH/%顯著升高，推測(cè)與動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下，胸腺、脾臟和其他中樞淋巴器官的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降有關(guān)［14］；并且NEUT/%和MONO/%顯著降低，這可能與對(duì)照組動(dòng)物在術(shù)后立即提取淋巴液，機(jī)體存在疼痛應(yīng)激及炎性反應(yīng)有關(guān)［19］。在生化成分檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的電解質(zhì)指標(biāo)K+和Na+顯著升高，而P3+顯著降低，這可能與兩組動(dòng)物對(duì)林格液的吸收方式有關(guān)；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的物質(zhì)代謝指標(biāo)UREA 顯著升高，這主要與對(duì)照組動(dòng)物禁食導(dǎo)致蛋白質(zhì)攝入不足有關(guān)；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物TG顯著降低，這是因?yàn)閷?duì)照組動(dòng)物在術(shù)前口服大量玉米油，經(jīng)消化分解為TG再轉(zhuǎn)運(yùn)至腸系膜淋巴系統(tǒng)；實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物的酸堿指標(biāo)CO2顯著升高，這可能與麻醉狀態(tài)下組織細(xì)胞的代謝有關(guān)，另一個(gè)側(cè)面也提示淋巴液呈堿性環(huán)境，淋巴液的堿性物質(zhì)可對(duì)抗休克所導(dǎo)致的酸中毒，這可能是淋巴液抗休克的作用機(jī)制之一［20］。經(jīng)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)組模型的細(xì)胞成分與生化指標(biāo)均符合大鼠正常生理水平［21］，具有可靠性和可重復(fù)性，可以成功取代之前的模型。

3.3 模型制備的注意事項(xiàng)

在腸淋巴插管的位置選擇上，國(guó)內(nèi)外學(xué)者的描述較為模糊。很多學(xué)者選擇在右腎動(dòng)脈并行的淋巴管處插管，但該處是腸系膜淋巴管和輔助淋巴管的匯集處，因此收集的淋巴液無法準(zhǔn)確評(píng)估脂質(zhì)類藥物經(jīng)腸道淋巴轉(zhuǎn)運(yùn)的真實(shí)情況。也有學(xué)者選擇切斷這一輔助淋巴管的通路，這增加了手術(shù)的難度和風(fēng)險(xiǎn)［17］。本研究中選擇與腸系膜動(dòng)脈并行的淋巴管，手術(shù)難度較低且可以精準(zhǔn)收集全部腸系膜淋巴液。同時(shí)由于淋巴液和淋巴管呈無色透明狀，通過在術(shù)前讓大鼠口服玉米油使其生成乳白色的乳糜微粒［16］，可準(zhǔn)確定位腸系膜淋巴管，這主要是因?yàn)橹|(zhì)降解形成的長(zhǎng)鏈脂肪酸（14 C～24 C）可與其他脂類產(chǎn)物生成乳白色牛奶狀的乳糜微粒［1，20，22］。對(duì)于腹腔內(nèi)導(dǎo)管的處理方式在不同的研究中也有差異。很多人選擇預(yù)留部分導(dǎo)管在腹腔內(nèi)，以防止導(dǎo)管拉扯而脫離淋巴管，但這容易引發(fā)腸道蠕動(dòng)時(shí)與導(dǎo)管發(fā)生纏繞，導(dǎo)致大鼠死亡。本研究中將導(dǎo)管呈C 型走位貼于腹腔內(nèi)壁，結(jié)果提示這是維持動(dòng)物高存活率的又一保障。

腸系膜淋巴管壁非常脆弱，且在分離淋巴管時(shí)極容易破壞周邊淋巴組織，從而導(dǎo)致淋巴液回流到乳糜池受阻。因此，該方法對(duì)于術(shù)者的顯微外科技能要求較高。此外，應(yīng)選擇一套適合的顯微手術(shù)器械和自制導(dǎo)管。顯微器械可精準(zhǔn)分離出血管和淋巴管，減少其周圍組織受損。有學(xué)者將導(dǎo)管的頭端斜切形成尖銳的角度，雖便于插管，但極易劃傷或刺破管壁，且在抽取體液時(shí)，由于導(dǎo)管尖端產(chǎn)生負(fù)壓，極易貼合血管或淋巴管內(nèi)壁，導(dǎo)致導(dǎo)管不通［17］。本研究中自制的導(dǎo)管頭端圓滑，且材質(zhì)選用醫(yī)用級(jí)材料，不易出現(xiàn)組織排異。另外在導(dǎo)管固定方面，有學(xué)者使用醫(yī)用膠水固定插入導(dǎo)管［17］，一方面導(dǎo)管牢固度不明，另一方面膠水會(huì)破壞周邊結(jié)締組織，甚至?xí)绊懢植课⒀h(huán)［16］。在進(jìn)行腹腔手術(shù)時(shí)，復(fù)原腹腔臟器的位置往往容易被忽略，臟器異位可致動(dòng)物死亡［16］。由于腸系膜淋巴結(jié)分布密集，淋巴液內(nèi)成分在經(jīng)過這些多級(jí)淋巴結(jié)后會(huì)如何變化，還有待進(jìn)一步研究。且腸系膜與小腸是一個(gè)有機(jī)整體，而小腸的不同部位其消化吸收功能有一定差異，因此，針對(duì)不同腸段及淋巴結(jié)精準(zhǔn)提取其淋巴液的技術(shù)尚待進(jìn)一步優(yōu)化。

綜上所述，該技術(shù)方法可以在大鼠清醒、正?；顒?dòng)狀況下反復(fù)、實(shí)時(shí)收集腸系膜淋巴液，用于脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、外泌體、電解質(zhì)及免疫細(xì)胞等的定性和定量分析，有助于我們更好地認(rèn)知腸道毛細(xì)淋巴管吸收能力及功能狀態(tài)。因此，本研究為腸系膜淋巴液的采集提供了新的技術(shù)方法，在涉及腸道淋巴的生理功能、脂溶性藥物吸收、腸道疾病診斷及其機(jī)制研究中有很好的應(yīng)用價(jià)值。

［醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement］

本研究涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的審核批準(zhǔn)（IACUC No.SIBCB-S118340-2112-045）。所有實(shí)驗(yàn)操作均遵照中國(guó)科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)發(fā)布的《動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》的條例進(jìn)行。

All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Laboratory Animal Use and Management Committee of the Center for Excellence in Molecular Cell Science，Chinese Academy of Sciences（IACUC No. SIBCB-S118340-2112-045）. All experimental procedures were carried out in accordance with the regulations ofStandard Operating Procedures for Animal Experiment Technology Platformsestablished by Animal Core Facility，Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology，Center for Excellence in Molecular Cell Science，Chinese Academy of Sciences.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

張笑瑞、曹靜和吳倩倩負(fù)責(zé)收集資料、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)及論文撰寫；陳國(guó)元和康康負(fù)責(zé)淋巴液的細(xì)胞學(xué)及生化指標(biāo)分析，并參與論文撰寫；吳寶金提供研究經(jīng)費(fèi)，負(fù)責(zé)研究方案與論文的審核及修改。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。