王怡如, 蔣笑影, 董若曦, 潘一濱, 韓向暉, 曹永清

(1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院肛腸科, 上海 200032; 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中醫(yī)外科研究所, 上海 200032)

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）包括克羅恩?。–rohn’s disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎，其特征是在遺傳易感個(gè)體的消化道中存在長(zhǎng)期持續(xù)的炎癥。腸纖維化是CD病程中的常見(jiàn)并發(fā)癥，表現(xiàn)為腸腔狹窄和腸壁增厚，在上下消化道均可發(fā)生，以回腸末端、回盲瓣、肛直腸段多見(jiàn)；半數(shù)CD患者存在發(fā)生腸腔狹窄的終身風(fēng)險(xiǎn)，纖維化使器官失去正常結(jié)構(gòu)及功能，嚴(yán)重的狹窄是導(dǎo)致手術(shù)和腸切除的主要原因之一［1-2］。既往認(rèn)為，CD患者的腸纖維化是一個(gè)相對(duì)緩慢的過(guò)程，故腸纖維化動(dòng)物模型多以周期性反復(fù)引發(fā)炎癥建立的慢性纖維化為主。但近期研究顯示，纖維化病變?cè)诓糠諧D患者中迅速發(fā)展，形成狹窄的速度可能比以往認(rèn)為的早得多［3］。因此，對(duì)CD患者急性腸纖維化的研究已成為該領(lǐng)域的重點(diǎn)之一，建立符合CD患者腸纖維化疾病特征的動(dòng)物模型是研究該疾病發(fā)生機(jī)制和治療方法的主要途徑和重要需求。

半抗原化劑2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）灌腸誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型是研究CD 最常用和最具特征性的模型之一［4］，但其誘導(dǎo)的急性腸纖維化模型目前在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)探討?；谶@一廣泛驗(yàn)證的模型基礎(chǔ)，本課題探索了一次性保留灌腸建立急性腸纖維化大鼠模型的改良方法，同時(shí)設(shè)立多組不同藥物劑量和乙醇溶液濃度的配比以觀察誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎癥和纖維化效果差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性SD 大鼠30 只，體質(zhì)量為200～220 g，購(gòu)自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK（浙）2019-0001］，質(zhì)量合格證為20210107Aazz061900 882。大鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心［SYXK （滬） 2020-0009］，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為40%～60%，光/暗每12 h交替，滅菌全價(jià)營(yíng)養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。本研究方案經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（PZSHUTCM201225008），實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

TNBS（批號(hào)SLCG2384）和戊巴比妥鈉（批號(hào)57-33-0） 均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；無(wú)水乙醇（批號(hào)20191017）、苯胺藍(lán)（批號(hào)20190604）、磷鉬酸（批號(hào)20190626）和正丁醇（批號(hào)20190802）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（滬試）；雙蒸水和生理鹽水（即0.9%氯化鈉溶液）（批號(hào)S2005066）購(gòu)自上海百特醫(yī)療用品有限公司；多聚甲醛（批號(hào)202201）購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；伊紅（批號(hào)C201103）、蘇木精（批號(hào)C201204）和BASO糞便隱血雙聯(lián)法試劑組（批號(hào)BA-2020E）購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；Weigert鐵蘇木素（批號(hào)20200407）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二甲苯（批號(hào)2021033102）購(gòu)自上海盛稀化工有限公司。

手術(shù)器械購(gòu)自上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠（金鐘手術(shù)器械）；一次性無(wú)菌注射器購(gòu)自威海潔瑞醫(yī)用制品有限公司；L80 型一次性直腸給藥管購(gòu)自任丘市洪達(dá)氣體有限公司（綠林）；組織包埋機(jī)和石蠟切片機(jī)為德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.3 藥品配制及動(dòng)物分組

將無(wú)水乙醇與雙蒸水按相應(yīng)體積比配制成體積分?jǐn)?shù)為50%和75%的乙醇溶液。5%TNBS 分別與不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇混合配制成體積比為1∶1 的5%TNBS+50%乙醇溶液（A 組）、體積比為1∶1 的5%TNBS+75%乙醇溶液（B 組）、體積比為1∶1 的5%TNBS+無(wú)水乙醇溶液（C 組），以及體積比為2∶1 的5%TNBS+50%乙醇溶液（D組）。4個(gè)不同配比的TNBS/乙醇溶液配制后，在4 ℃冷藏避光保存，使用前再次混勻。

30 只雌性SD 大鼠隨機(jī)分為5 組，每組6 只。對(duì)照組予生理鹽水0.6 mL 灌腸，模型組分為A、B、C、D組，用上述對(duì)應(yīng)配比的溶液各0.6 mL灌腸。

1.4 一次性保留灌腸法建立炎性腸纖維化大鼠模型

各組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，第7 天起禁食不禁水24 h，第8 天造模前稱重。造模麻醉前再次促進(jìn)大鼠排便。造模時(shí)，先用2%戊巴比妥鈉溶液按每只大鼠0.3～0.4 mL 的用藥量進(jìn)行腹腔注射麻醉。麻醉起效后參考Morris法［5］進(jìn)行一次性灌腸操作，改良方法：用1 mL 注射器連接圓頭灌腸軟管（長(zhǎng)8 cm，內(nèi)徑2 mm）制作灌腸器；麻醉后的大鼠以俯臥位提起大鼠尾部，暴露肛門，灌腸管蘸取少許造模藥液潤(rùn)滑管壁，插入肛門約8 cm 處，緩慢勻速推注藥液0.6 mL；退出灌腸管后立即用木夾子夾閉大鼠肛門，并將大鼠呈頭低位尾部固定于籠網(wǎng)；保持肛門夾閉狀態(tài)，計(jì)時(shí)30 min 后取下夾子將大鼠放回籠中，待其自然蘇醒（圖1）。

圖1 大鼠保留灌腸示意圖Figure 1 Schematic diagram of retention enema

1.5 造模后動(dòng)物一般情況觀察

記錄造模后7 d內(nèi)大鼠每日精神及活動(dòng)狀態(tài)、體質(zhì)量變化、糞便性狀及便血、死亡情況，并參照Murano等［6］方法進(jìn)行大鼠疾病活動(dòng)指數(shù)（disease activity index，DAI）評(píng)分。（1）體質(zhì)量下降：無(wú)，記0 分；1%～5%，記1 分；6%～10%，記2 分；11%～15%，記3 分；＞15%，記4 分。（2）糞便性狀：正常，記0分；松散，記2 分；稀便，記4 分。（3）便血：隱血（-），記0分；隱血（+），記2分；肉眼血便，記4分。DAI=（體質(zhì)量下降分?jǐn)?shù)+糞便性狀分?jǐn)?shù)+便血分?jǐn)?shù)）/3，以造模當(dāng)日體質(zhì)量作為初始體質(zhì)量，與造模后第1 天起每日體質(zhì)量作對(duì)比。

1.6 造模后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材與樣本保存

造模后第7天、第14天，用2%戊巴比妥鈉溶液按每只大鼠0.7～0.8 mL的用藥量腹腔注射麻醉每組一半大鼠。麻醉前不禁食不禁水。麻醉起效后，沿腹中線剖開(kāi)腹腔并觀察腹腔內(nèi)情況；經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后，以脫頸椎法安樂(lè)死大鼠；然后取下肛門至盲腸全段，于造模給藥處（距肛門6～10 cm 范圍）剪斷腸管；沿腸管縱軸剖開(kāi)，必要時(shí)用生理鹽水沖洗腸腔殘留糞便，觀察腸道炎癥最明顯處；測(cè)量后截取該部位結(jié)腸組織，固定于多聚甲醛溶液中，留做病理切片。若全結(jié)腸未見(jiàn)明顯肉眼下大體形態(tài)改變，則截取距肛門1 cm、3 cm、6 cm、9 cm范圍內(nèi)的結(jié)腸腸段0.3 cm作為樣本。

1.7 結(jié)腸組織大體形態(tài)學(xué)觀察

取材時(shí)記錄腹腔積液、病變腸管與周圍組織關(guān)系等，無(wú)張力拉直腸管后測(cè)量從肛門到結(jié)腸盲腸交界處的全結(jié)直腸長(zhǎng)度。然后觀察腸管外壁有無(wú)穿孔、狹窄、膨大、粘連等改變，沿縱軸剖開(kāi)腸管后觀察腸腔面。綜合以上信息，參考Butzner 等［7］方法進(jìn)行大鼠結(jié)腸炎大體損傷指數(shù)（colon macroscopic damage index，CMDI）評(píng)分。（1）結(jié)腸損傷：正常外觀，記0 分；局灶充血但黏膜無(wú)糜爛或潰瘍，記1 分；潰瘍不伴充血或腸壁增厚，記2分；一處潰瘍伴炎癥，記3分；兩處及以上的局灶潰瘍或炎癥，記4 分；主要炎癥損傷處沿腸管縱向延伸范圍＞1 cm，記5 分；損傷范圍＞2 cm，每增加1 cm 再多記1 分，即記6～10 分。（2）結(jié)腸與周圍組織關(guān)系：與周圍組織無(wú)粘連，記0 分；輕度粘連（與周圍組織易于分離），記1分；重度粘連（與周圍組織不易分離），記2 分。評(píng)分由兩位研究者分別獨(dú)立進(jìn)行，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1.8 HE染色和Masson染色

各組炎癥結(jié)腸組織以多聚甲醛溶液固定后，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋、切片、脫水等步驟制作病理切片，同一塊結(jié)腸組織分別切片進(jìn)行HE 染色和Masson 染色，光學(xué)顯微鏡下取腸壁全層視野，觀察黏膜損傷程度、腸壁增厚、炎細(xì)胞浸潤(rùn)深度、纖維化部位等情況，并比較對(duì)照組與模型組的膠原蛋白沉積部位和范圍。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并用Graphpad Prism 8.0 軟件作圖。計(jì)數(shù)資料以率描述，計(jì)量資料以±s描述。資料服從正態(tài)分布時(shí)，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，并以LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。若資料不服從正態(tài)分布，則多組間比較采用Kruskal-Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)，以Dunn 法作進(jìn)一步比較。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模后大鼠一般情況

造模后，模型組大鼠出現(xiàn)不同程度的精神萎靡，表現(xiàn)為反應(yīng)慢、掙扎減弱、喜聚集、蜷縮、鼠毛暗淡，且肛周有稀便污染；持續(xù)1～3 d 后，整體情況隨體質(zhì)量升高逐漸好轉(zhuǎn)。適應(yīng)期及造模當(dāng)日，各組大鼠體質(zhì)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；造模前禁食24 h 后，大鼠體質(zhì)量較前平均下降（18.3±8.7）g。造模完成后，對(duì)照組在進(jìn)食后體質(zhì)量迅速回升，模型組體質(zhì)量持續(xù)下降1～2 d 后才開(kāi)始緩慢回升。與對(duì)照組相比，模型組造模后第1、2天的體質(zhì)量明顯偏低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01，圖2A）。

造模24 h 后，模型組均可見(jiàn)糞便性狀改變，便質(zhì)稀或呈糊狀，伴黏液及血跡。肉眼見(jiàn)血便多數(shù)持續(xù)2～3 d；隱血陽(yáng)性在肉眼血便消失后仍存在1～3 d；稀便持續(xù)時(shí)間每組不等，A 組3～6 d，B 組3～7 d，C組4～7 d，D組模型不穩(wěn)定，持續(xù)1～14 d。造模后24 h各模型組的DAI 評(píng)分均較對(duì)照組明顯升高，其中B 組與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2B）；造模后24 h 各模型組的DAI 評(píng)分均逐漸下降，但各模型組之間DAI 評(píng)分比較的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2B）。

圖2 造模后大鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)（A）和疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分（B）Figure 2 Changes in rat body mass（A）and disease activity index(B)after model establishment

2.2 模型動(dòng)物死亡率

A 組與B 組觀察期內(nèi)大鼠無(wú)死亡。C 組造模后第2天和第6 天各有1 只大鼠死亡，D 組造模后第3 天有2只大鼠死亡，C組與D組死亡率均為33.3%。

2.3 結(jié)腸大體外觀

對(duì)照組結(jié)腸正常，腸管外壁與周圍組織易于分離。模型組各組大鼠可見(jiàn)不同程度的結(jié)腸炎改變，造模給藥處可見(jiàn)局部腸管膨隆，腸段增厚明顯，腸管質(zhì)韌，腸管外壁均未見(jiàn)穿孔，造模部位腸管外壁與周圍器官組織炎性粘連，嚴(yán)重病變腸管外出現(xiàn)脂肪組織蓄積、包裹，不易分離。模型組之間對(duì)比，A 組的結(jié)腸外觀變化總體較輕；B、C組節(jié)段性增厚較明顯，可伴上段腸管擴(kuò)張，出現(xiàn)不完全性腸梗阻；D 組內(nèi)模型差異較大，部分出現(xiàn)明顯的炎性狹窄性病變，部分未見(jiàn)明顯異常（圖3）。

圖3 模型建立后的大鼠結(jié)腸組織Figure 3 Colonic tissue of rats after model establishment

2.4 結(jié)腸長(zhǎng)度及形態(tài)學(xué)改變

對(duì)各組大鼠結(jié)腸長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)圖4A。對(duì)照組大鼠結(jié)腸長(zhǎng)度為16～18 cm，各模型組結(jié)腸長(zhǎng)度總體均較對(duì)照組縮短，其中A、B、C 三組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D組結(jié)腸長(zhǎng)度變化與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，A、B、C 三組間對(duì)比的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

縱向剖開(kāi)腸管觀察腸管內(nèi)壁，第7 天時(shí)模型組見(jiàn)造模部位腸壁出現(xiàn)嚴(yán)重炎性損傷，壞死組織色黑，附著于腸腔內(nèi)表面，與周圍組織分界明顯；第14 天時(shí)局部腸段仍有增厚，壞死組織較前部分脫落，黏膜見(jiàn)一處或多處縱深潰瘍，結(jié)腸皺襞紊亂或消失，非藥物作用部位的黏膜肉眼觀大致正常。模型組之間比較，第7 天時(shí)，B 組和C 組造模效果相近，腸壁損傷及腸壁增厚明顯，病變范圍大；A 組炎癥范圍及程度較輕；D 組大鼠結(jié)腸肉眼未見(jiàn)明顯損傷。第14 天時(shí)，B組和C 組造模部位腸壁增厚仍較明顯；A 組也可見(jiàn)腸壁裂隙樣潰瘍，腸壁增厚程度較前兩組輕；D 組腸壁見(jiàn)較大范圍凹陷的潰瘍面，但腸壁增厚程度輕于B 組和C組。

對(duì)各組結(jié)腸炎大體損傷程度進(jìn)行評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)圖4B。模型組CMDI評(píng)分均較對(duì)照組升高，其中A組炎癥范圍、腸壁增厚程度總體較輕，D 組內(nèi)大鼠病變程度差異較大，A、D 兩組與對(duì)照組相比的CMDI 評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B組、C組造模處組織損傷及纖維化明顯，與對(duì)照組的CMDI評(píng)分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 造模后大鼠結(jié)腸長(zhǎng)度（A）和結(jié)腸炎大體損傷評(píng)分（B）Figure 4 The length of rat colon after model establishment(A)and colon macroscopic damage index(B) in rats after model establishment

2.5 結(jié)腸組織病理學(xué)改變

2.5.1 HE染色

光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)為造模部位黏膜裂隙樣潰瘍、缺損、壞死或脫落，隱窩表現(xiàn)為異常縮小、擴(kuò)大或分支；炎細(xì)胞浸潤(rùn)達(dá)腸壁深層，黏膜下層和漿膜層亦可見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常對(duì)照組相比，模型組腸壁有不同程度增厚，以黏膜下層增厚明顯，黏膜肌層和固有肌層也可見(jiàn)增厚，部分切片可見(jiàn)管壁組織變性的血管。總體而言，A組炎癥程度較輕，B組和C組較重，D組炎癥程度輕重不一（圖5A）。

2.5.2 Masson染色

Masson 染色使膠原纖維及黏液藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)和肌纖維紅染，細(xì)胞核呈棕黑色。對(duì)照組與模型組對(duì)比明顯。對(duì)照組藍(lán)染區(qū)域主要集中在黏膜下層，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，生理狀態(tài)下膠原纖維含量豐富，肌層及漿膜層組織內(nèi)無(wú)明顯藍(lán)染。模型組以黏膜下層、肌層彌漫性藍(lán)染和厚度增加最為明顯，部分樣本漿膜層亦出現(xiàn)類似表現(xiàn)。炎細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積呈透壁性，深達(dá)腸壁各層。第7天時(shí)，A組、B組和C組黏膜下層、肌層及漿膜層增厚，組織內(nèi)均出現(xiàn)彌漫性藍(lán)染的膠原沉積，其中A、B兩組黏膜下纖維化最為明顯；C組漿膜層也出現(xiàn)明顯增厚及膠原沉積；D 組與對(duì)照組無(wú)明顯差異。第14 天時(shí)，A 組標(biāo)本造模部位的黏膜下層和肌層均出現(xiàn)膠原彌漫性沉積增多；B組和C組病變分別與其第7天樣本相似；D組腸壁增厚，漿膜層膠原彌漫性沉積增多，肌層纖維化嚴(yán)重，組織間分界模糊（圖5B）。

圖5 造模后大鼠結(jié)腸HE（A）和Masson（B）染色結(jié)果（×100）Figure 5 HE staining（A）and Masson staining（B）of rats’colons after model establishment(×100)

3 討論

由于腸纖維化在CD發(fā)展過(guò)程中難以預(yù)測(cè)，僅靠臨床人體研究進(jìn)展困難或滯后，動(dòng)物模型可以極大地補(bǔ)充和擴(kuò)展腸纖維化在CD中的研究，具有無(wú)可替代的重要作用。腸纖維化模型有限，現(xiàn)已開(kāi)發(fā)出化學(xué)誘導(dǎo)型、微生物型、免疫介導(dǎo)型、基因靶向型、自發(fā)型、輻射誘導(dǎo)型和手術(shù)干預(yù)型等七大類［8-9］。不同類型的疾病模型沒(méi)有絕對(duì)的優(yōu)劣和固定標(biāo)準(zhǔn)，它們具有不同的關(guān)鍵特征、潛在機(jī)制和優(yōu)缺點(diǎn)，允許人們從多個(gè)側(cè)面增進(jìn)對(duì)疾病機(jī)制的認(rèn)識(shí)并加以互補(bǔ)，研究人員可根據(jù)模型特點(diǎn)，按照病因?qū)W、免疫學(xué)、發(fā)病機(jī)制、藥物篩選等不同研究方向和用途選用恰當(dāng)?shù)哪Ｐ停?0-11］。

CD 的炎癥及纖維化均涉及先天和后天性免疫機(jī)制［2］。盡管目前CD 的炎癥治療已取得顯著進(jìn)展，但抗感染治療不能減少纖維化，也尚無(wú)抗纖維化藥物可用［8，12］。在應(yīng)用廣泛的化學(xué)誘導(dǎo)型模型中，TNBS因其誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥與CD 疾病特征和免疫機(jī)制具有相似性，故在CD 的免疫研究和藥物篩選上占據(jù)重要地位［13］。TNBS是一種接觸性致敏的化學(xué)性半抗原物質(zhì)，與乙醇配制成溶液后使用，由乙醇破壞腸黏膜屏障完整性，繼而使TNBS得以滲入腸壁，與組織蛋白結(jié)合形成抗原后誘發(fā)免疫反應(yīng)，引起結(jié)腸炎癥［13］。

以往認(rèn)為，CD的腸纖維化是在相對(duì)緩慢的慢性炎癥過(guò)程中產(chǎn)生［3，12］。鑒于此，TNBS誘導(dǎo)的腸纖維化模型多為慢性模型，通過(guò)周期性重復(fù)給藥方案來(lái)建立，需在6～8周甚至更長(zhǎng)的周期內(nèi)定期反復(fù)給藥［8，14］，故成模周期長(zhǎng)、效率低、鼠齡老化嚴(yán)重、動(dòng)物死亡或產(chǎn)生耐受等不足限制了其應(yīng)用。同時(shí)，近期研究顯示，CD的腸纖維化進(jìn)程既不完全依賴于炎癥，也不一定是一個(gè)緩慢的過(guò)程［3］，CD腸纖維化和狹窄可以在短期內(nèi)發(fā)生，所以急性形成的腸纖維化動(dòng)物模型對(duì)病程研究也具有重要意義。本研究證實(shí)TNBS一次性造模即可導(dǎo)致急性腸纖維化發(fā)生，打破了TNBS難以在短期內(nèi)誘導(dǎo)腸纖維化的以往觀點(diǎn)［9］。

以往文獻(xiàn)中有關(guān)TNBS誘導(dǎo)造模的操作方法通常是向大鼠或小鼠結(jié)腸內(nèi)滴注一定配比的TNBS溶液并采用倒置體位保持1～3 min。但在實(shí)踐中這種方法失誤可能性較大。本課題組反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件，認(rèn)為成模的關(guān)鍵在于TNBS 溶液與腸壁有效接觸且作用時(shí)間充足，才能在特定的藥物配比下產(chǎn)生預(yù)期的效果。故本研究中采用了改良的一次性保留灌腸法，通過(guò)延長(zhǎng)藥物的有效作用時(shí)間，不僅成功建立了纖維化明顯、成模率穩(wěn)定的急性纖維化模型，還提高了造模效率。

本研究還通過(guò)設(shè)立不同藥物配比的分組來(lái)觀察模型效果的差異。嘗試不同TNBS 溶液配比的必要性在于，TNBS的有效劑量接近動(dòng)物的致死量，需要給予亞致死量的TNBS 來(lái)使結(jié)腸炎癥最大化［10，15］。造模條件不足，則出現(xiàn)成模率低、炎癥輕、自愈快、同一造模條件下組內(nèi)模型間異質(zhì)性大等問(wèn)題；造模條件過(guò)度，則導(dǎo)致動(dòng)物極度虛弱或死亡率升高。本實(shí)驗(yàn)中4 個(gè)模型組給藥體積相同，A、B、C 組按照TNBS/乙醇為1∶1的比例使用了相同劑量的TNBS和50%、75%和100%的乙醇溶液來(lái)配制；結(jié)果顯示A、B 兩組無(wú)動(dòng)物死亡，A 組總體纖維化評(píng)價(jià)較B 組輕，B、C 兩組均產(chǎn)生了中重度的腸纖維化，但C組有33.3%的死亡率。D組按照TNBS/乙醇為2∶1 的比例，使用了2 倍劑量的TNBS 和50%的乙醇溶液；結(jié)果顯示組內(nèi)成模效果差異較大，且同樣有33.3%的死亡率。以上結(jié)果說(shuō)明高劑量的TNBS和高濃度的乙醇均具有較強(qiáng)的致死性，而乙醇濃度過(guò)低會(huì)使破壞黏膜屏障的效果降低，導(dǎo)致模型不穩(wěn)定，而A、B兩組的配比在保留灌腸中使用相對(duì)安全有效。對(duì)于實(shí)際使用而言，雖然A、B兩組纖維化程度有輕重差異，但均具有應(yīng)用價(jià)值：A 組造模條件適用于針對(duì)CD疾病早期、纖維化總體較輕的研究，B組適合于CD纖維化明顯的疾病中晚期研究。

纖維化的特征是富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)，在通常含有較少結(jié)締組織的組織中過(guò)度蓄積［3］。富含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)及間質(zhì)樣細(xì)胞在正常腸組織中主要存在于黏膜下層，二者在病變局部增生不僅導(dǎo)致黏膜下層過(guò)度纖維化，還導(dǎo)致黏膜肌層及固有肌層增厚，這被認(rèn)為是CD 腸纖維化的組織學(xué)特征［16］。在本組模型中，造模部位出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的病變，腸段的腸壁增厚；HE染色顯示炎細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)于腸壁的各層結(jié)構(gòu)中；Masson 染色顯示，TNBS/乙醇誘導(dǎo)的腸纖維化模型的纖維化和增厚主要發(fā)生在黏膜下層和肌層，漿膜層亦可有明顯的膠原纖維彌漫性增多。Zidar 等［17］在人類CD 樣本上觀察到的結(jié)果與上述結(jié)果一致；該學(xué)者認(rèn)為，CD的纖維化發(fā)病機(jī)制可能與其他器官的纖維化相當(dāng)，可能是腸壁對(duì)其深層結(jié)構(gòu)中存在的炎癥產(chǎn)生（過(guò)度）反應(yīng)的結(jié)果，纖維化的部位即是間充質(zhì)細(xì)胞聚集的部位。本模型模擬了CD“透壁性”炎癥和深層組織纖維化的表征，在組織病理學(xué)水平上具有應(yīng)用于CD纖維化研究的參考價(jià)值。

使用TNBS 也存在一定不足，這是由于TNBS 誘導(dǎo)模型受多方面因素的影響。（1）動(dòng)物對(duì)藥物反應(yīng)的異質(zhì)性：TNBS 能否誘發(fā)結(jié)腸炎首先與動(dòng)物有關(guān)。TNBS可用于大鼠、小鼠和兔，不同種屬和品種品系的動(dòng)物具有不同的易感性和耐藥性，病程進(jìn)展和持續(xù)時(shí)間也有差異，選擇對(duì)TNBS敏感的品種品系能增加模型的成功率。常見(jiàn)的IBD 模型動(dòng)物有SD、Wistar 大鼠和BALB/c、SJL/J、WT、C57BL/6J 小鼠［18］。需要注意的是，某些動(dòng)物（如C57BL/6 小鼠）對(duì)腸道瘢痕形成抵抗力較強(qiáng)，可誘發(fā)炎癥但不一定能引起實(shí)質(zhì)性纖維化［4，7］。（2）微生物背景：微生物在腸道炎癥模型建立和最終發(fā)生纖維化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3，19］，誘導(dǎo)和維持腸道炎癥依賴腸道菌群的存在，“無(wú)菌無(wú)結(jié)腸炎”的觀點(diǎn)現(xiàn)已被廣泛接受［11］。動(dòng)物攜帶的微生物不同，可能使同樣的濃度方案出現(xiàn)不同輕重的炎癥。預(yù)實(shí)驗(yàn)有益于個(gè)體化調(diào)整濃度和劑量方案。以上為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中不可避免的差異。（3）鼠齡：鼠齡小對(duì)TNBS敏感性較高，但由于鼠齡與體質(zhì)量正相關(guān)，體質(zhì)量過(guò)輕的動(dòng)物對(duì)藥物耐受性較差，容易死亡。禁食24 h 的大鼠體質(zhì)量在200 g以上時(shí)造模后存活率更高。（4）性別：動(dòng)物模型會(huì)因性別不同出現(xiàn)差異［20］，故在同一實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)使用同性別的動(dòng)物。綜上，相同品種品系、來(lái)源、批次、周齡及相同的飼養(yǎng)環(huán)境能較好地控制模型條件的均質(zhì)性，但即使嚴(yán)格控制了以上所有條件，仍存在出現(xiàn)造模失敗或動(dòng)物死亡的可能性，所以適量計(jì)劃額外數(shù)量的動(dòng)物是有必要的。

另外，TNBS 灌腸的操作技術(shù)也可能引起造模失誤，故總結(jié)下述細(xì)節(jié)以供參考。（1）麻醉前充分促排糞便。糞便會(huì)吸附藥液，影響藥物與腸壁接觸。禁食24 h 不能使糞便排空，而延長(zhǎng)禁食時(shí)間會(huì)使大鼠體質(zhì)量和耐受性進(jìn)一步下降，使死亡率升高。除用棉簽刺激肛門外，也可手指沿腹中線在大鼠下腹部向肛門方向輕輕推壓助排。進(jìn)管時(shí)若遇阻澀感說(shuō)明腸腔仍有糞便存留。（2）充分的麻醉是順利完成保留灌腸的保障。（3）使用圓頭側(cè)開(kāi)口灌腸管可避免銳器導(dǎo)致腸穿孔的風(fēng)險(xiǎn)。（4）避免用石蠟油潤(rùn)滑灌腸管，以減少石蠟油黏附于腸壁。蘸取少量灌腸藥液即可潤(rùn)滑。（5）長(zhǎng)時(shí)間保留灌腸時(shí)，大鼠倒置懸掛不能完全避免藥液溢出。灌腸管的插入、藥液的刺激性、藥液體積、給藥速度等因素均可引起大鼠腸道反射使藥液被排出，且溢藥量難以估計(jì)。退出灌腸管后立即夾閉肛門并保持頭低體位可有效避免。有研究者嘗試在小鼠灌腸后使用肛塞［21］，但經(jīng)嘗試不適用于大鼠。本實(shí)驗(yàn)中使用木夾，夾閉力度適中，持續(xù)夾閉30 min 后未觀察到對(duì)大鼠肛門造成明顯損傷。（6）藥物質(zhì)量是關(guān)鍵。同批次的新鮮TNBS和無(wú)水乙醇可保證模型效果，實(shí)驗(yàn)中造模時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)需避免乙醇揮發(fā)的影響。

造模后大鼠體質(zhì)量減輕、腹瀉、肉眼血便及隱血便等與腸炎程度有良好的相關(guān)性，體外觀測(cè)相關(guān)癥狀即能體現(xiàn)模型的嚴(yán)重程度和進(jìn)展。造模后24 h 通過(guò)觀察體征變化判斷造模效果，再進(jìn)行隨機(jī)分組，可減少模型異質(zhì)性對(duì)研究結(jié)果的影響。

綜上所述，本研究建立了一種運(yùn)用改良一次性保留灌腸技術(shù)建立急性腸纖維化模型的方法，該方法簡(jiǎn)便、周期短、造模效果穩(wěn)定、腸壁纖維化表現(xiàn)明顯，動(dòng)物死亡率低。而且這一方法建立的大鼠模型中腸纖維化的組織學(xué)特點(diǎn)與臨床上CD 腸纖維化具有相似性，因此本研究中的操作方法及藥物配比可推廣應(yīng)用于該領(lǐng)域的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，具有良好的參考價(jià)值。同時(shí)，模型大鼠急性腸纖維化的分子學(xué)機(jī)制值得進(jìn)一步研究探討。

［醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement］

本研究所涉及的所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均已通過(guò)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)（PZSHUTCM201225008）。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行。

All animal experiments involved in this study have been reviewed and approved by the Experimental Animal Ethics Committee of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Approval Letter No. PZSHUTCM201225008). All experimental procedures were performed in accordance with the requirements of laws and regulations related to experimental animals, including the guidelines such as

Animal Management Regulations(01/03/2017),Laboratory Animal:Guideline for Ethical Review of Animal Welfare(GB/T 35892—2018)and ARRIVE 2.0.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

王怡如參與課題設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)收集整理、統(tǒng)計(jì)分析、可視化處理和論文寫作與修改；蔣笑影和董若曦參與實(shí)驗(yàn)操作、數(shù)據(jù)收集；潘一濱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)、統(tǒng)計(jì)指導(dǎo)、論文理論部分的關(guān)鍵性修改指導(dǎo)；韓向暉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)、論文實(shí)驗(yàn)部分的關(guān)鍵性修改指導(dǎo)；曹永清負(fù)責(zé)課題策劃、論文修改指導(dǎo)及定稿。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。