李思迪, 付 彬, 郭中坤, 林穎杰,2, 張振宇, 米傳靚, 王可洲

(1. 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)院(省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心),濟(jì)南 250002; 2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院),山東省皮膚病性病防治研究所,濟(jì)南 250022)

脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccaride binding protein，LBP）作為一種糖蛋白，是LBP家族成員之一［1］。LBP的相對分子質(zhì)量為60 000，其蛋白質(zhì)部分是相對分子質(zhì)量為50 000 的單鏈多肽［2-3］。LBP 分布廣泛，在嚙齒類動(dòng)物的心、肝、肺等多個(gè)器官中均有表達(dá)，其中在肝臟中的表達(dá)水平較高。人和動(dòng)物血清中的LBP 主要與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 結(jié)合發(fā)揮作用［4］。LPS 又被稱為內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌外膜上的主要成分之一，可以促進(jìn)炎性發(fā)生，引起機(jī)體各種疾病，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致機(jī)體死亡［5］。研究表明，LBP與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。如Heizhati 等［6］在研究LBP 對睡眠結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，血清LBP 高濃度與中年男性高血壓患者睡眠第一階段時(shí)間延長相關(guān)；Pal 等［7］在研究與帕金森病有關(guān)的胃腸道炎性標(biāo)志物時(shí)，發(fā)現(xiàn)LBP 是一種與LPS 神經(jīng)毒性相關(guān)的胃腸道生物標(biāo)志物。He等［8］在研究LPS誘導(dǎo)下LBP編碼基因缺失（Lbp-/-）SD大鼠的轉(zhuǎn)錄水平及其在膿毒癥期間對肝臟的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的活性受到抑制時(shí)，Lbp基因缺失會(huì)影響過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptor，PPAR）信號(hào)通路，從而影響細(xì)菌清除。Li等［9］研究了牛野生型LBP和突變型LBP（67Ala變Thr）對LPS 誘導(dǎo)牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，BMEC）炎性反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)5 μg/mL突變型LBP處理BMEC 導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡率高于野生型LBP，且沒有細(xì)胞毒性。這些相關(guān)研究揭示了LBP與LPS 結(jié)合可導(dǎo)致炎性反應(yīng)的發(fā)生，但對其具體作用機(jī)制的研究還不夠深入。為探索LPS在Lbp基因敲除小鼠體內(nèi)如何誘導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展，本文將外顯子2的全部序列與外顯子3的部分序列特異剪切，建立Lbp基因敲除小鼠模型，為進(jìn)一步研究LBP 蛋白在免疫方面的作用機(jī)制和生理作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠和ICR 小鼠均購自北京唯尚立德生物科技有限公司［SCXK（京）2016-0009］，飼養(yǎng)于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（魯）2019-0007］，飼料購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，并經(jīng)60Co滅菌。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用遵循3R原則，且獲得山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（20181224-01）。

1.2 主要試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用試劑：Cas9 mRNA、Cas9/gRNA 靶點(diǎn)效率檢測試劑盒（VK007）購自北京唯尚立德生物科技有限公司；Hi Scribe T7 ARCA mRNA試劑盒（E2065S）購自美國New England Biolabs 公司；人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）（181223）、血促性素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）（1905152） 購自寧波第二激素廠；pClone007 Blunt Simple VECTOR Kit （OCE20601） 、 金 牌 mix（TSE101）、動(dòng)物組織/細(xì)胞基因組DNA 提取試劑盒（0180331AX）均購自北京擎科生物科技有限公司；Total RNA Kit Ⅱ（R6934-02）購自美國Omega 公司；通用抗體稀釋液（U3635）購自美國Sigma公司；高效抗 體 稀 釋 液 （WA-002） 購 自 美 國 Invent Biotechnologies 公司；高效RIPA 組織/細(xì)胞快速裂解液（R0010）購自北京索萊寶科技有限公司；一抗β-actin（4970S）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP） 標(biāo) 記 的 抗 兔IgG 二 抗（7074S） 均 購 自Cell Signaling Technology 公司；一抗LBP（PA5-79586）購自美國Invitrogen公司。

實(shí)驗(yàn)所用儀器：拉針儀（PN-31） 購自日本Narishige 公司；高速冷凍離心機(jī)（5424R）購自德國Eppendorf 公司；凝膠成像儀（Universal HoodⅡ）購自美國Bio-Rad公司；體視顯微鏡（SMZ745T）購自日本Nikon 公司；PCR 儀（Mastercycler X50s） 購自德國Eppendorf 公司；顯微注射用顯微鏡（IX73P1F）購自日本Olympus 公司；電泳儀（PowerPac?Basic）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 Lbp基因sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì)及制備

根據(jù)數(shù)據(jù)NCBI-Gene ID：16803及Ensembl-Gene：LbpENSMUSG00000016024 可得Lbp基因的序列結(jié)構(gòu)、保守區(qū)域及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等信息，依據(jù)這些信息設(shè)計(jì)小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）的靶點(diǎn)。對Lbp基因的序列進(jìn)行分析后，本實(shí)驗(yàn)選擇剪切2 號(hào)外顯子全部序列及3 號(hào)外顯子部分序列，圖1 為靶點(diǎn)剪切示意圖。靶點(diǎn)設(shè)計(jì)完成后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物活性，篩選出酶切活性較高的sgRNA 靶點(diǎn)備用。同時(shí)參照Hi Scribe T7 ARCA mRNA 試劑盒說明書制備Cas9 mRNA。

圖1 Lbp基因敲除示意圖Figure 1 Lbp gene knockout diagram

1.4 胚胎移植及其前期準(zhǔn)備

準(zhǔn)備4 周齡C57BL/6J 雌鼠和8～12 周齡C57BL/6J雄鼠。雌鼠腹腔注射PMSG 0.1 mL（5 U）/只，48 h 后腹腔注射hCG 0.1 mL（5U）/只，18 h 后取卵子備用。取雄鼠附睪，再從附睪中取出精子。

取出的精子在獲能液中獲能后，選取活力較好的精子滴加到經(jīng)過短暫培養(yǎng)的卵細(xì)胞中，經(jīng)3～4 h 體外受精獲得受精卵。用RNA-free 水配制sgRNA&Cas9 mRNA 混合物（sgRNA 25 ng/μL，Cas9 mRNA 50 ng/μL），借助顯微注射系統(tǒng)將其注射到受精卵內(nèi)。將注射sgRNA&Cas9 mRNA 混合物的受精卵移植到經(jīng)12.5 mg/mL 三溴乙醇腹腔注射麻醉后的假孕ICR 雌鼠輸卵管中，將代孕ICR 雌鼠置于獨(dú)立通氣籠盒（individual ventilated cages，IVC）中飼養(yǎng)，待小鼠出生后鑒定基因型。

1.5 Lbp基因敲除小鼠的獲得及鑒定

將代孕ICR雌鼠生產(chǎn)的仔鼠作為Founder并命名為F0代，F(xiàn)0代出生2 周后，剪小鼠的腳趾進(jìn)行編號(hào)，使用基因組提取試劑盒提取小鼠基因組。使用正向引物（F： CATTTGTTTGGGAACCCC） 和 反 向 引 物（R：AAGGGCTGGAATGCTAATG）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：TSE101 mix 15 μL、上游引物0.6 μL、下游引物0.6 μL、DNA 1.2 μL、ddH2O 2.6 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；98 ℃變性20 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸55 s，共35個(gè)循環(huán)；68 ℃延伸10 min；10 ℃保持。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶切膠回收進(jìn)行平末端克隆、轉(zhuǎn)化、涂板，并挑單克隆測序驗(yàn)證。結(jié)合基因組鑒定和測序結(jié)果：只出現(xiàn)770 bp 左右的目的條帶，且測序顯示單鏈缺失1 457 bp 的判斷為Lbp-/-；只出現(xiàn)2 153 bp 左右的野生型（wild type，WT）條帶，且測序顯示與WT一致的判斷為Lbp+/+；出現(xiàn)770 bp 左右的目的條帶及2 153 bp 左右的WT 條帶，且770 bp 左右目的條帶測序顯示單鏈缺失1 457 bp的 判 斷 為Lbp+/-。 F0 代 后 新 增 引 物 WT-R（TGCCTGACCCAAGAGGTTT），對引物F/R基因鑒定結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證：F/WT-R出現(xiàn)810 bp左右的WT條帶的為Lbp+/+或Lbp+/-，未出現(xiàn)任何條帶的為Lbp-/-。F0 代小鼠進(jìn)行基因組鑒定測序后，選出Lbp+/-小鼠與WT 小鼠交配，生產(chǎn)的后代為F1代；F1代小鼠基因組鑒定測序后，選出Lbp+/-小鼠自交，生產(chǎn)的后代為F2 代；F2 代小鼠基因組鑒定及測序后，選出Lbp+/-小鼠自交，生產(chǎn)的后代為F3 代；F3 代小鼠繼續(xù)進(jìn)行基因組鑒定及測序。

1.6 RT-PCR 測序鑒定Lbp 基因敲除小鼠的mRNA轉(zhuǎn)錄

使用Total RNA Kit Ⅱ試劑盒提取組織總RNA，將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 使用正向引物（F：TGCTCTCTACATTGCTGGGG） 和 反 向 引 物 （R：GGAGGTCCACTGAAATGGTG） 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：TSE101 mix 10 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 3.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；10 ℃保持。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶切膠回收后進(jìn)行平末端克隆、轉(zhuǎn)化、涂板、挑單克隆測序驗(yàn)證。結(jié)合PCR 結(jié)果和測序結(jié)果：只出現(xiàn)121 bp 左右目的條帶，且測序顯示單鏈缺失244 bp 的判斷為Lbp-/-；只出現(xiàn)365 bp左右WT條帶，且測序顯示與WT一致的判斷為Lbp+/+；出現(xiàn)121 bp 左右目的條帶及365 bp 左右WT 條帶，且121 bp 左右目的條帶測序顯示單鏈缺失244 bp的判斷為Lbp+/-。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測Lbp 基因敲除小鼠的LBP蛋白表達(dá)

因NCBI 及MGI 數(shù)據(jù)提示LBP 在肝臟中表達(dá)量較高，故本實(shí)驗(yàn)選取肝臟組織蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。取WT 小鼠、Lbp敲除雜合子鼠（Lbp+/-）及Lbp敲除純合子鼠（Lbp-/-）的肝臟組織，加入預(yù)冷的蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑，組織破碎后冰上反應(yīng)30 min，4 ℃14 000×g離心5 min，取上清液并用改良型Bradford 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。然后加5×蛋白Loading 于100 ℃煮沸10 min，用5%的濃縮膠與8%的分離膠分離蛋白，0.2 A、1.5 V 轉(zhuǎn)膜50 min，5%的脫脂奶粉37 ℃封閉2 h，用預(yù)冷的TBST 洗3 次（每次10 min），加入一抗（β-actin 及兔抗小鼠LBP 抗體均1∶1 000 稀釋）且4 ℃孵育過夜，第二天用預(yù)冷的TBST洗3次（每次10 min），加入二抗（HRP標(biāo)記的抗兔β-actin IgG 以1∶2 000 稀釋，HRP 標(biāo)記的抗兔LBP IgG 以1∶10 000 稀釋）且37 ℃孵育2 h，用預(yù)冷的TBST 洗3次（每次10 min），Immobilon Western 化學(xué)發(fā)光HRP底物（ECL發(fā)光試劑）顯色后凝膠成像儀成像。

2 結(jié)果

2.1 根據(jù)Lbp 基因組結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)CRISPR/gRNA靶點(diǎn)

通過NCBI 及Ensembl 網(wǎng)站查詢可知，Lbp基因有5個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中3 個(gè)可翻譯為蛋白質(zhì)。對該基因蛋白功能保守區(qū)域及基因序列相關(guān)信息分析發(fā)現(xiàn)，2、3號(hào)兩個(gè)公共外顯子位于功能保守區(qū)BPI/LBP/CETP N 端區(qū)，剪切位點(diǎn)位于42～123 aa 處，其蛋白編碼區(qū)的堿基數(shù)為244，非3的倍數(shù)，剪切后造成移碼突變，從而導(dǎo)致蛋白失活。最終我們選擇Lbp-201 作為敲除轉(zhuǎn)錄模板。在2號(hào)外顯子一端與3號(hào)外顯子中間部位設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，靶點(diǎn)序列信息如表1 所示。針對上述設(shè)計(jì)的多個(gè)sgRNA 靶點(diǎn)，使用sgRNA 體外酶切活性檢測試劑盒檢測其體外酶切活性，根據(jù)靶點(diǎn)活性檢測結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇Lbp-L4和Lbp-R1作為首選靶點(diǎn)。

表1 針對Lbp基因的sgRNA靶點(diǎn)名稱及序列Table 1 Namesandsequencesoflipopolysaccaridebinding protein(Lbp)gene-small guide RNA(gRNA)target

2.2 Lbp基因敲除鼠的鑒定

顯微注射后，共獲得65 枚生長活性較好的受精卵，將這些受精卵移植到2只假孕的ICR雌鼠中，分娩后共獲得17只F0代小鼠，基因組鑒定及測序顯示腳趾編號(hào)為3、8、10、12、15的小鼠為陽性雜合子鼠（圖2A、B），陽性率為22.73%。因F0代3號(hào)小鼠770 bp左右目的條帶較為清晰，測序顯示單鏈缺失1 457 bp，故將F0 代3 號(hào)小鼠與WT 的C57BL/6 小鼠交配，共獲得6只F1代，基因組鑒定及測序表明3只小鼠為Lbp+/-。

圖2 F0代及F2代Lbp基因敲除小鼠的基因型鑒定結(jié)果Figure 2 Genotyping results of F0 and F2 lipopolysaccaride binding protein（Lbp）gene knockout mice

F1 代Lbp+/-鼠間自交共獲得12 只F2 代鼠，基因組鑒定及測序表明4 只小鼠為Lbp-/-，5 只為Lbp+/-，3 只為WT。F3 代共獲得122 只小鼠，其中Lbp-/-30 只（14♀+16♂）、Lbp+/-61 只（32♀+29♂）、WT 31 只（14♀+17♂），分別占F3 代總數(shù)的24.59%、50.00%和25.41%，約為1∶2∶1，符合孟德爾遺傳定律且性別比例約為1∶1。

2.3 F2代Lbp基因敲除鼠的mRNA和蛋白鑒定

由Lbp-/-小鼠肝臟組織中mRNA 的RT-PCR 測序結(jié)果可知，Lbp-/-mRNA 缺失244 bp，符合設(shè)計(jì)目的（圖3A、B）。序列剪切后mRNA 發(fā)生移碼突變，拼接成新的mRNA，新序列在剪切位點(diǎn)后第29位（圖4B劃框位置）對應(yīng)LBP 的第71 位氨基酸處引入翻譯終止信號(hào)，導(dǎo)致翻譯提前終止，從而無法進(jìn)行正常翻譯。

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3C 所示，提示Lbp-/-小鼠肝臟不表達(dá)LBP。

圖3 RT-PCR測序和蛋白質(zhì)印跡法分別檢測Lbp基因敲除鼠的mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)情況Figure 3 The expression of mRNA and protein in liver tissues of Lbp gene knockout mice detected by RT-PCR sequencing and Western blotting

2.4 Lbp基因敲除鼠的表型分析

觀察F0、F1、F2、F3 代Lbp-/-、Lbp+/-小鼠的表型發(fā)現(xiàn)，與WT相比，其體質(zhì)量、毛色、窩產(chǎn)仔鼠數(shù)量、對外界刺激的反應(yīng)大小、自發(fā)活動(dòng)等均無明顯差異。后續(xù)腹腔注射不同劑量（10、20、50、100、150 μL）、質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的LPS，觀察不同時(shí)間段Lbp-/-、Lbp+/-及WT小鼠的表型，發(fā)現(xiàn)WT小鼠隨注射劑量的增加，冷顫、發(fā)抖、腹瀉、眼分泌黏液、行動(dòng)遲緩等癥狀加重，甚至出現(xiàn)死亡的現(xiàn)象（150 μL 劑量84 h 死亡）；相同條件下Lbp-/-小鼠的癥狀明顯輕于WT 和Lbp+/-小鼠，且沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

3 討論

LPS 作為一種促炎因子及免疫分子，可以刺激機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。但過高的LPS 會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生不同程度的傷害，導(dǎo)致機(jī)體炎性因子過度釋放，嚴(yán)重時(shí)可引起多器官功能衰竭、敗血癥休克等，危及生命［10-11］。LBP的作用主要與炎性反應(yīng)有關(guān)，其在發(fā)揮作用時(shí)對炎性反應(yīng)有兩方面的影響［12-13］：一是當(dāng)LPS與LBP 的炎性位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，引起相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及炎性介質(zhì)產(chǎn)生，從而起到促炎作用；二是當(dāng)LPS 結(jié)合LBP 的抗炎部位時(shí)，它向靶細(xì)胞傳遞信號(hào)，中和或消除LPS，阻止LPS發(fā)揮作用，從而起到抗炎作用［14］。Lbp-/-小鼠在多種實(shí)驗(yàn)研究中均有重要作用，如：Won等［15］以BALB/cLbp-/-小鼠為背景，討論了低炎性反應(yīng)下與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的致病介質(zhì)；Molinaro 等［16］以MyD88 敲除小鼠為背景，探討了LBP 的表達(dá)對小鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)的影響；宋子晨［17］將SD 大鼠的Lbp基因敲除，研究了LPS 對肝臟線粒體的損害及作用機(jī)制。然而，在LBP 這些相關(guān)研究中，以C57BL/6JLbp-/-小鼠為背景的相關(guān)報(bào)告較少。LBP 與LPS 結(jié)合的具體作用機(jī)制雖有研究，但造成炎性反應(yīng)的因素較為復(fù)雜，LBP 在抗菌、抗炎等方面的作用機(jī)制需要進(jìn)一步揭示［18-20］。

Lbp基因有5 個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其中Lbp-201、Lbp-202、Lbp-203 可翻譯為蛋白質(zhì)，Lbp-202 的序列為1～123 aa，Lbp-203 的序列起始位點(diǎn)為194 aa。本次實(shí)驗(yàn)在設(shè)計(jì)靶點(diǎn)時(shí)考慮到這3 個(gè)序列的差異，因此選擇對Lbp-201的序列進(jìn)行剪切，剪切位點(diǎn)位于功能保守區(qū)的N 端（42～123 aa），剪切后導(dǎo)致Lbp-201、Lbp-202、Lbp-203 均無法正常翻譯，從而達(dá)到LBP 失活的目的。本次實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建Lbp敲除小鼠，通過PCR 鑒定及測序驗(yàn)證，F(xiàn)0 代共獲得5 只Lbp+/-小鼠，F(xiàn)1 代3 只Lbp+/-，F(xiàn)2 代4 只Lbp-/-、5 只Lbp+/-，F(xiàn)3 代30只Lbp-/-、61 只Lbp+/-。F2 代Lbp-/-DNA 測序結(jié)果顯示，1 457 bp 缺失符合預(yù)期，其RNA 測序結(jié)果顯示244 bp缺失符合預(yù)期。

蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lbp-/-小鼠肝臟中LBP不表達(dá)，F(xiàn)3代各小鼠基因型和性別數(shù)值顯示，本次構(gòu)建獲得的Lbp敲除小鼠能夠穩(wěn)定遺傳，且符合孟德爾遺傳規(guī)律。雜合子小鼠繼續(xù)繁育，即可獲得大量可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的純合子敲除鼠。正常情況下Lbp-/-的表型與WT 沒有顯著差異，但注射LPS 后WT 小鼠的炎性反應(yīng)顯著大于Lbp-/-，由此猜測Lbp-/-雖無法正常表達(dá)LBP，但仍會(huì)將LPS信號(hào)傳遞給靶細(xì)胞，引起機(jī)體出現(xiàn)冷顫、發(fā)抖等炎性反應(yīng)，但是此傳遞過程緩慢，引起的炎性反應(yīng)程度輕。

綜上，本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9 技術(shù)成功構(gòu)建了以C57BL/6J為背景的Lbp-/-小鼠，為進(jìn)一步探索LBP對C57BL/6J 小鼠腸道菌群的影響，研究LBP 缺失前后LPS對肝、腎等組織免疫調(diào)節(jié)的影響提供了基礎(chǔ)。

[醫(yī)學(xué)倫理聲明Medical Ethics Statement]

本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循3R 原則，已獲得山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理批準(zhǔn)（20181224-01）。所有實(shí)驗(yàn)過程均遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)法律法規(guī)條例要求進(jìn)行。

The animal experiments involved in this study were carried out in accordance with the principle of 3Rs, and had obtained the ethical approval of Shandong Laboratory Animal Center (No. 20181224-01). All experiment protocols were carried out following the relevant laws and regulations on Laboratory animals.

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

李思迪負(fù)責(zé)論文撰寫及實(shí)驗(yàn)實(shí)施；付彬、郭中坤負(fù)責(zé)論文撰寫及實(shí)驗(yàn)實(shí)施指導(dǎo)；林穎杰負(fù)責(zé)論文實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)；張振宇、米傳靚負(fù)責(zé)論文相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作；王可洲負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施指導(dǎo)、論文撰寫及修改指導(dǎo)。

[利益聲明Declaration of Interest]

本文所有作者均聲明本文不存在利益沖突。