陳佳琦, 呂龍寶, 張飛燕, 李 瑞, 李乙江, 李麗紅, 張曉迪

(中國科學(xué)院昆明動物研究所,昆明 650223)

藥物臨床前的評價研究離不開實(shí)驗(yàn)動物的條件技術(shù)支撐。為探究藥物的有效性和安全性，為人類臨床試驗(yàn)提供參考，需要開展各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，包括藥效學(xué)（pharmacodynamics）、藥代動力學(xué)（pharmacokinetics）和毒代動力學(xué)（toxicokinetic）等評價研究。作為動物離體器官、組織、細(xì)胞的“捐獻(xiàn)者”，以身試病、以身試藥、以身試毒的“受難者”，實(shí)驗(yàn)動物為人類及動物的健康作出了巨大貢獻(xiàn)和犧牲。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展與社會文明的進(jìn)步，如何處理動物實(shí)驗(yàn)引發(fā)的倫理學(xué)問題，已成為藥物研發(fā)中的一個重要課題。

以替代（replacement）、優(yōu)化（refinement）和減少（reduction）為核心的3R原則為緩和與化解實(shí)驗(yàn)動物倫理矛盾提供了一種可行的解決理論。3R原則是現(xiàn)代科學(xué)研究中使用動物的基本原則［1］。世界范圍內(nèi)，已有上百個國家制定了實(shí)驗(yàn)動物福利相關(guān)的法律法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)，這些法律及標(biāo)準(zhǔn)的核心均是3R原則。歐盟2010年頒布的《保護(hù)實(shí)驗(yàn)動物2010/63/EU 號指令》也明確了3R原則的指導(dǎo)性地位［2］。我國修訂中的《實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例》《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》《實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查指南》等法規(guī)及標(biāo)準(zhǔn)中也明確了3R原則。因此，3R原則是實(shí)驗(yàn)動物福利倫理的核心體現(xiàn)。

生物分析技術(shù)的進(jìn)步，開啟了微量血樣分析的時代，也帶動了微量采血法的發(fā)展。微量采血法是指血液樣本不超過50 μL［3］的采集程序。該技術(shù)最大的特征是樣品體積的微小化，例如利用Gyrolab免疫實(shí)驗(yàn)平臺，血液樣本的體積可縮小至4 μL［4］。在藥物非臨床研究中應(yīng)用微量采血法，被認(rèn)為是貫徹3R原則的重要實(shí)踐，得到了國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會（International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）的認(rèn)可［5］。因此，本文聚焦于藥物非臨床研究領(lǐng)域，介紹了微量采血法的最新研究進(jìn)展以及應(yīng)用的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)，以期推動該技術(shù)更廣泛的應(yīng)用，促進(jìn)藥物研發(fā)與動物福利倫理的協(xié)調(diào)發(fā)展。

1 不同微量采血法的最新進(jìn)展

非臨床研究中，有幾種常用的微量采血法。實(shí)際應(yīng)用過程中，方法的選擇應(yīng)考慮到每種方法的適用條件和特點(diǎn)（表1）。

表1 非臨床研究中幾種常見的微量采血法Table 1 Common approaches for blood microsampling in non-clinical studies

1.1 干血斑（dried blood spot，DBS）

DBS，即將約15 μL 的全血樣品直接滴到卡紙上，樣品在常溫干燥后，通過使用打孔器獲得相同尺寸的濾紙片，用于樣品的提取和分析。DBS 因具有微創(chuàng)、簡單、易于存儲和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，五十多年來一直是臨床上新生兒遺傳代謝性疾病篩查的常用采血方法。2004 年，Beaudette 和Bateman［6］將DBS 引入到非臨床研究中，并證明了其在藥物發(fā)現(xiàn)階段的潛力后，DBS技術(shù)迅速推廣。Clark 等［7］開發(fā)了一套高靈敏度的通用性分析方法，可使90%測試化合物的定量下限為1 ng/mL，并將其應(yīng)用于小鼠藥代動力學(xué)研究，得到了更高質(zhì)量的藥代動力學(xué)特征。Barfield 等［8］將DBS 首次用于非臨床安全性評價研究，觀察到從犬血DBS 樣品中獲得的乙酰氨基酚毒代動力學(xué)特征與液態(tài)基質(zhì)血樣的相當(dāng)。

近來，研究人員對DBS 的研究熱情因其在臨床應(yīng)用中暴露出來的生物分析問題而有所降低。DBS 的生物分析問題均與基質(zhì)為全血有關(guān)。具體來說，血細(xì)胞比容（hematocrit，HCT）會影響斑點(diǎn)的大?。?］和目標(biāo)分析物的提取，進(jìn)而在定量生物分析中引入系統(tǒng)誤差［10］。這對于遺傳均一性良好的實(shí)驗(yàn)動物來說，可能并不是太大的問題，但在開發(fā)紅細(xì)胞增多癥、貧血、癌癥等疾病的藥物時，應(yīng)特別關(guān)注。業(yè)界在過去幾年內(nèi)也提出了幾種解決方案：一是通過基于鉀離子濃度或血紅蛋白濃度［11］來估計(jì)和校準(zhǔn)DBS樣品中的HCT；二是改變?yōu)V紙材料，如采用疏水紙，減少血紙互作［12］；三是通過濾紙片預(yù)打孔［13］或?yàn)V紙片周圍增設(shè)濾紙環(huán)［14］，配備“計(jì)量芯片”［15］等技術(shù)收集和存儲準(zhǔn)確體積的血液。這些技術(shù)的改進(jìn)，大大促進(jìn)了DBS的應(yīng)用和發(fā)展。

1.2 干血漿斑（dried plasma spot，DPS）

DPS 與DBS 相似，唯一不同的是滴在卡紙上的是血漿樣品。DPS 保留了DBS 的許多優(yōu)點(diǎn)（穩(wěn)定性好，保存和運(yùn)輸方便），同時解決了DBS最大的問題（HCT效應(yīng)）。缺點(diǎn)是血液需要離心處理，且所需血量要加倍。在一項(xiàng)以犬為模型的研究中，Li 等［16］分析了不同方法（通過移液器或SAFE-TEC）制備的DPS 樣品中利托那韋的濃度，結(jié)果顯示與液態(tài)血漿中的藥物濃度一致，試驗(yàn)樣品再分析（incurred sample reanalysis）的結(jié)果也表明DPS 技術(shù)可穩(wěn)定檢測。之后，Li 等［17］的對比研究顯示從大鼠尾靜脈連續(xù)采血制備DPS 樣品或液態(tài)血漿中多乙酰氨基酚及其代謝產(chǎn)物對乙酰氨基酚葡糖苷酸（APAP-gluc）和對乙酰氨基酚硫酸結(jié)合物（APAP-sulf）的濃度，與從舌下靜脈采集的血漿中濃度不相上下，且連續(xù)收集毒代動力學(xué)樣品并未增加動物的應(yīng)激水平，從而證明了DPS 在大鼠毒代動力學(xué)研究中的實(shí)用性。

相較于其他微量采血技術(shù)，DPS 在非臨床研究中的應(yīng)用很少，可能與干燥基質(zhì)的驗(yàn)證負(fù)擔(dān)以及復(fù)雜的操作程序有關(guān)。該技術(shù)最新的改進(jìn)主要是提高了操作和分析的自動化水平，包括在DBS 的基礎(chǔ)上增加紅細(xì)胞過濾膜［18-20］以簡化采樣程序，引入微流體過濾和自動計(jì)量技術(shù)［21］以快速獲得準(zhǔn)確體積的血漿，以及開發(fā)與現(xiàn)有DBS機(jī)器人技術(shù)兼容的DPS卡［19-20］。

1.3 固定體積采血法（volumetric absorptive microsampling，VAMS）

VAMS 是采樣設(shè)備的吸頭不完全浸入全血、血漿或血清中，通過毛細(xì)作用準(zhǔn)確收集特定體積血樣的方法。干燥后，血樣被運(yùn)送到生物分析實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。VAMS 也是DBS 的一個改進(jìn)版，幾乎擁有DBS 的全部優(yōu)點(diǎn)，且不用考慮HCT的影響［22-23］，操作更方便，更適合自動化處理。經(jīng)多項(xiàng)方法驗(yàn)證，已有文獻(xiàn)報告證明了VAMS 應(yīng)用于非臨床研究的可行性［24-26］。VAMS的首次實(shí)際應(yīng)用是Denniff 等［27］對乙酰氨基酚的大鼠毒代動力學(xué)研究。這項(xiàng)研究中，VAMS 樣品和液態(tài)稀釋血樣表征的藥-時曲線下面積很接近，但藥峰濃度之間出現(xiàn)了40%的差異，差異的原因可能與樣本量小有關(guān)，而與采血方法無關(guān)。Thiry 等［28］通過優(yōu)化生物分析方法，將VAMS成功應(yīng)用于4種伊曲康唑制劑的生物利用率的評估實(shí)驗(yàn)中。

值得一提的是，雖然VAMS 在基質(zhì)選擇上比DBS更為靈活，但選擇全血為基質(zhì)時同樣面臨需要關(guān)聯(lián)全血濃度和血漿濃度的問題，選擇其他基質(zhì)類型，需要利用其他設(shè)備來制備血漿或血清，操作較為復(fù)雜。

1.4 毛細(xì)管微量采血法（capillarymicrosampling，CMS）

CMS 是指用毛細(xì)管準(zhǔn)確收集固定體積全血、血漿或血清的方法。典型的過程是將毛細(xì)管的一端浸入血液中，通過毛細(xì)作用準(zhǔn)確收集全血，完成后可直接進(jìn)行低溫保存，也可進(jìn)行稀釋、分離血漿或血清等預(yù)處理。CMS 被視為最有潛力的微量采血法，因?yàn)樗藰悠妨康臏p少外，與常規(guī)采樣并沒有本質(zhì)區(qū)別［29-31］?；|(zhì)的形式未發(fā)生改變，避免了進(jìn)行“干基”和“濕基”之間的橋連研究，且CMS 多用于制備應(yīng)用最廣泛的血漿樣品，不需要全血和血漿數(shù)據(jù)之間建立聯(lián)系的復(fù)雜過程。與普通DBS 相比，CMS 所采樣品體積更準(zhǔn)確［30］，與基質(zhì)的生理特性（如HCT）無關(guān)。受DBS的啟發(fā)，人們很快將CMS 應(yīng)用到非臨床研究中，評估了小鼠、大鼠和犬等物種的藥代動力學(xué)、毒代動力學(xué)參數(shù)，結(jié)果證明該技術(shù)給出的結(jié)果與常規(guī)方法有高度可比性［31-36］。

CMS 的缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，分離血漿或血清時需要切割毛細(xì)管，存在扎傷風(fēng)險。不過有研究者提出了一種帶觸變性凝膠（離心時在血細(xì)胞和血漿間形成物理屏障）的毛細(xì)管［37］，這種改良的毛細(xì)管省去了切割步驟，提高了操作的便利性和安全性。

2 微量采血法的應(yīng)用優(yōu)勢

2.1 動物福利方面

微量采血法有助于3R原則中“優(yōu)化”的實(shí)現(xiàn)。由于所需血量很少，根據(jù)實(shí)驗(yàn)性質(zhì)可選擇動物的疼痛、組織損傷及壓力最小且操作更簡單的采血部位和程序。常用的采血部位通常是大鼠、小鼠的側(cè)尾靜脈、隱靜脈，兔的耳緣靜脈，犬、猴的頭靜脈。對于嚙齒類動物和兔來說，可大幅縮短采血前通過加熱或施加化學(xué)刺激物等措施促進(jìn)血管擴(kuò)張的時間［38］。對于所有動物而言，采血過程中不需要或僅需要很小程度的身體限制，保證了人員安全，避免了動物應(yīng)激。在Powles-Glover等［38］的研究中，高達(dá)62%的大鼠在未進(jìn)行任何身體限制的情況下被成功實(shí)施了微量采血法。常用的采血針規(guī)格為23 G，故對動物身體的損傷極?。?9］。另外，由于操作簡單方便，采樣程序可直接在動物設(shè)施中進(jìn)行。

除了“優(yōu)化”，微量采血法也有利于“減少”的實(shí)現(xiàn)。非臨床研究中，對動物數(shù)量影響最大的是藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究。常規(guī)嚙齒類動物的藥代動力學(xué)研究設(shè)計(jì)，一般在24 h 內(nèi)設(shè)6～12 個采血時間點(diǎn)，每個時間點(diǎn)每個組至少3 只動物，以充分解析藥物的動力學(xué)性質(zhì)。由于血容量和采樣部位等［40］的限制，每個組需要24～36 只小鼠或者6～9 只大鼠［41-42］。毒代動力學(xué)與藥代動力學(xué)類似，但是給藥劑量更高。常規(guī)嚙齒類動物的安全性評價中，為避免干擾毒理學(xué)終點(diǎn)，毒代動力學(xué)樣本是由主要研究動物之外的衛(wèi)星動物提供的，這使得動物用量更大。微量采血法結(jié)合靈敏的生物分析技術(shù)，使血樣體積微小化，允許在特定時間內(nèi)對同一動物同一位點(diǎn)進(jìn)行多次采樣，因此可以大幅減少動物的用量。據(jù)報告，與傳統(tǒng)采樣相比，微量采血法可減少66%～95%［28，43-50］的動物用量，當(dāng)然具體減少幅度取決于研究類型、物種、采血方案等因素。

2.2 科學(xué)方面

微量采血法允許重新設(shè)計(jì)非臨床研究方案，以更少的動物獲得足夠多的優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)，提高了研究的轉(zhuǎn)化價值?！岸唷斌w現(xiàn)在檢測指標(biāo)、藥-時曲線數(shù)量的增加［48］，以及可獲得常規(guī)方法難以采集的信息，實(shí)現(xiàn)信息的最大化。“優(yōu)質(zhì)”來源于兩個方面：一是不易造成動物過度的應(yīng)激反應(yīng)，對藥代動力學(xué)或毒代動力學(xué)參數(shù)的干擾較小，這在肝提取率較高的藥物研發(fā)中尤為重要；二是對于嚙齒類動物，同一個體的藥理學(xué)或毒理學(xué)效應(yīng)可直接與藥物暴露關(guān)聯(lián)，而且每只嚙齒類動物都可能擁有完整的藥代動力學(xué)/毒代動力學(xué)特征，個體間的變異系數(shù)降低了。Joyce 等［47］研究了微量采血法所得藥代動力學(xué)參數(shù)的個體間變異系數(shù)，結(jié)果顯示傳統(tǒng)采血的高達(dá)150%，而微量采血法的不超過30%。

2.3 成本方面

微量采血法可有效節(jié)約成本。隨著動物用量減少，藥物、動物、實(shí)驗(yàn)用品和實(shí)驗(yàn)人員等直接成本大幅下降，尤其在藥物量十分有限的發(fā)現(xiàn)階段和利用昂貴的轉(zhuǎn)基因小鼠［34，47］開展的研究中。另一方面，以較低的成本獲得充足的優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)，意味著可以用少量的資源開展實(shí)驗(yàn)，從而快速做出決策，這對藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目都相當(dāng)有利。例如，在藥物發(fā)現(xiàn)階段早期，篩選具有合適的生物利用率的化合物，可采用連續(xù)微量采血法將6 種化合物的藥代動力學(xué)研究同時進(jìn)行，這樣的動物用量可減少80%，藥物材料可減少75%，研究時間減少40%［47］。當(dāng)然，成本的節(jié)約程度取決于具體的研究類型、物種、采血方案等［51］。

3 微量采血法的應(yīng)用挑戰(zhàn)

目前，微量采血法的發(fā)展面臨著兩個挑戰(zhàn)。一是提升檢測微小體積樣本中目標(biāo)分析物的能力。樣品體積的減少，制備和運(yùn)輸方式等的改變，可能會給檢測的準(zhǔn)確度和靈敏度造成不利影響。絕大多數(shù)目標(biāo)分析物與高靈敏度的分析方法（液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法LC-MS/MS 和Gyrolab 免疫實(shí)驗(yàn)平臺）兼容，可使用10 μL或更少的樣品就達(dá)到足夠的靈敏度，而對于藥物為肽類和核酸類等具有特殊分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的物質(zhì)，可能還需要開發(fā)靈敏度更高的生物分析方法。二是毒理學(xué)解釋的能力。嚙齒類動物的非臨床安全性評價中，收集毒代動力學(xué)血樣可能會對主要研究動物的器官功能和臨床病理參數(shù)產(chǎn)生影響。有研究人員對此進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果表明：在正常及某些特殊生理狀態(tài)（如妊娠）的嚙齒類動物上實(shí)施微量采血法，對毒理學(xué)評價終點(diǎn)的影響是微乎其微的［32，37，43-45，52-53］。當(dāng)然，為支持微量采血法的更廣泛應(yīng)用，還需要繼續(xù)開展相關(guān)的配套研究，如針對具有特殊分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的物質(zhì)，開發(fā)靈敏度更高的生物分析方法，進(jìn)一步探索各種毒性研究中對主要研究動物實(shí)施微量采血法收集毒代動力學(xué)樣本的影響等。

4 小結(jié)

在藥物非臨床研究中，微量采血法能提高動物福利，減少動物的用量，獲得足夠、優(yōu)質(zhì)數(shù)據(jù)，降低研發(fā)成本，是值得推廣的一項(xiàng)新技術(shù)。但是，未來還需要繼續(xù)開展該方法及其相關(guān)的配套研究，以促進(jìn)其更廣泛的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)科學(xué)進(jìn)步與動物福利倫理進(jìn)步并行。

[作者貢獻(xiàn)Author Contribution]

陳佳琦負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱和整理，以及文章撰寫與修改；呂龍寶負(fù)責(zé)文獻(xiàn)查閱和整理，并對文章撰寫提供指導(dǎo)，以及對全文進(jìn)行修改；張飛燕參與文章思路及整體內(nèi)容的討論和全文修改；李瑞負(fù)責(zé)臨床前研究和生物分析相關(guān)知識的討論和梳理；李乙江、李麗紅：提供文章整體內(nèi)容的修改建議；張曉迪參與文章思路及整體內(nèi)容的討論。

[利益聲明Declaration of Interest]

所有作者均聲明本文不存在利益沖突。