朱云謹(jǐn)， 張彥超， 胡天翼， 李 響， 李 倩， 高 偉， 鄭 立,2??

(1. 自然資源部海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，自然資源部第一海洋研究所， 山東 青島 266061； 2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室， 山東 青島 266237)

在深海熱液生態(tài)系統(tǒng)中，來自海底的高溫還原性熱液與冷的氧化性海水相結(jié)合，形成了地球上獨(dú)特的極端環(huán)境，具有黑暗、靜水壓力高、溫度變化大、有毒物質(zhì)(例如重金屬、甲烷和硫化物)濃度高等特點(diǎn)[1-2]。在如此惡劣的環(huán)境下生存著大量的貽貝、管狀蠕蟲、蝦蟹等大型底棲動(dòng)物[3]，不同于大部分依賴于光合作用的生態(tài)系統(tǒng)，深海熱液生態(tài)系統(tǒng)依賴于化能合成，化能自養(yǎng)微生物為生態(tài)系統(tǒng)提供初級(jí)生產(chǎn)力[4]，有研究提出參與硫化氫氧化的化能自養(yǎng)微生物在熱液生態(tài)系統(tǒng)中維持著主要生產(chǎn)力[5]，氫氣、甲烷和還原性的金屬離子也可以作為化能自養(yǎng)微生物的能量來源[6-7]。

已有研究通過分子生物學(xué)的手段以及顯微鏡技術(shù)發(fā)現(xiàn)在熱液區(qū)動(dòng)物的體內(nèi)和體表存在大量的微生物，并與生物形成共附生關(guān)系，幾乎所有熱液區(qū)的動(dòng)物都依賴于與其共生或者附生的化能自養(yǎng)微生物提供的初級(jí)生產(chǎn)力[8]，這些共附生微生物在宿主的物質(zhì)和能量循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[9]，參與熱液區(qū)的硫代謝，甲烷代謝和氨代謝等過程。熱液動(dòng)物共附生細(xì)菌的多樣性，能量利用，共生機(jī)制方面已經(jīng)有了一些研究，但對(duì)于共附生細(xì)菌促進(jìn)宿主適應(yīng)熱液極端環(huán)境的貢獻(xiàn)方面研究較少。

目前主要在分子和細(xì)胞水平上對(duì)于熱液微生物的極端環(huán)境適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行了研究，有研究發(fā)現(xiàn)微生物通過群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)來調(diào)控自身生理活性以適應(yīng)環(huán)境壓力[10]。群體感應(yīng)是一種通過產(chǎn)生化學(xué)信號(hào)分子進(jìn)行細(xì)胞間交流的機(jī)制，具有細(xì)菌密度依賴性，根據(jù)細(xì)胞密度的變化來調(diào)控基因表達(dá)，調(diào)節(jié)生理代謝[11-12]。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定闕值時(shí)，信號(hào)分子合成酶基因就會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá)，產(chǎn)生更多信號(hào)分子與受體蛋白結(jié)合，啟動(dòng)下游基因表達(dá)，使細(xì)菌產(chǎn)生多種多樣的群體行為[13]，諸如形成生物膜、產(chǎn)生抗生素、發(fā)光等[14-15]。

2005年Johnson等[16]首次在深海熱液環(huán)境中發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)(QS)機(jī)制，他們發(fā)現(xiàn)海棲熱孢菌(Thermogogamaritima)與詹氏甲烷球菌(Methanococusjannaschii)共培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的胞外多糖具有密度依賴性。通過共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)上調(diào)的多肽基因中包含QS系統(tǒng)的一個(gè)多肽，作者基于肽蛋白的QS系統(tǒng)調(diào)控胞外多糖的產(chǎn)生，推測(cè)這可能是熱液生境微生物的生存策略。之后到2015年才從基因?qū)用?，?株深海熱液噴口來源的細(xì)菌和以ε-變形菌綱為主的生物膜中發(fā)現(xiàn)luxS類型的QS系統(tǒng)[17]。然而這些報(bào)道對(duì)深海熱液環(huán)境中細(xì)菌的群體感應(yīng)機(jī)制研究并不全面，作為自然界普遍存在的由?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-Acyl homoserine lactons，AHLs)介導(dǎo)的luxI/R群體感應(yīng)系統(tǒng)是否也存在于熱液環(huán)境中還未見報(bào)道，若存在，QS系統(tǒng)調(diào)控的功能，以及它對(duì)細(xì)菌在熱液環(huán)境的適應(yīng)性上所發(fā)揮的作用也不清楚。

本研究利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法對(duì)西南印度洋天成熱液區(qū)貽貝可培養(yǎng)共附生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了初步研究，并從中篩選出群體感應(yīng)細(xì)菌，對(duì)群體感應(yīng)細(xì)菌的生理生化功能進(jìn)行研究，包括產(chǎn)生的AHLs種類、成膜能力和利用DMSP(β-二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽)的能力，以探討貽貝共附生細(xì)菌在宿主適應(yīng)熱液區(qū)環(huán)境方面的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

本實(shí)驗(yàn)所用深海偏頂蛤(Bathymodiolusmarisindicus，見圖1)于2019年4月16日采集自大洋科考52航次，西南印度洋第三航段的天成(TC)熱液區(qū)，DY52-III-TC01ROV站位，水深2 700 m，經(jīng)、緯度分別為63.923 2°E、27.850 8°S，見圖2。

圖1 采集自西南印度洋天成熱液區(qū)的深海偏頂蛤

圖2 樣品采集站位圖

1.2 培養(yǎng)基

本研究采用2種常規(guī)的培養(yǎng)基2216E和R2A，這2種培養(yǎng)基含有豐富的C源和N源，有利于從可培養(yǎng)細(xì)菌中篩選群體感應(yīng)細(xì)菌，培養(yǎng)基配方參照《海洋微生物學(xué)》(第二版)配制，分離細(xì)菌時(shí)采用10%濃度的培養(yǎng)基組分。

其他實(shí)驗(yàn)試劑和培養(yǎng)基配制方法如下：

(1)20×Salt 溶液：200 mL滅菌蒸餾水中加入(NH4)2SO48 g，MnSO4·H2O 4.8 mg，MgSO40.32 g，CaCl230.2 mg，過濾、除菌，使用孔徑0.22 μm的無菌濾膜和注射器過濾加入滅菌的藍(lán)蓋瓶中。

(2)20×Buffer溶液：蒸餾水中加入KH2PO442.8 g，NaOH 7 g，定容至200 mL，高壓滅菌，待冷卻后調(diào)節(jié)pH到7.0，使用孔徑0.22 μm的無菌濾膜和注射器過濾加入滅菌的藍(lán)蓋瓶中。

(3)AHLs信號(hào)分子檢測(cè)培養(yǎng)基[18]：在100 mL滅菌后的軟瓊脂(0.8%)中加入5 mL 20×Buffer、5 mL 20×Salt、1 mL葡萄糖(50%)、200 μL X-Gal，待冷卻至45 ℃時(shí)加入1 mLAgrobacteriumtumefaciensKYC55指示菌懸液(OD600nm=12)混勻。

(4)DMSP細(xì)菌培養(yǎng)基各成份含量(g/L)[19]：DMSP 8.051 8、NH4Cl 21.396 0、NaH2PO40.003 6、EDTA-Fe 0.042 1、ZnCl20.013 6、MnCl20.197 8、CoCl22.379 3×10-4、維生素B1 0.400 0、維生素B12 0.002 0、維生素H 0.002 0。

1.3 菌株的分離與培養(yǎng)

在船上實(shí)驗(yàn)室取深海偏頂蛤鰓組織塊(見圖1)5 g，加入10 mL無菌海水震蕩，清洗未附著生長(zhǎng)的細(xì)菌，再加入10 mL無菌海水，轉(zhuǎn)移至無菌組織研磨器中，均質(zhì)后轉(zhuǎn)移至無菌試管中，按1∶1、1∶10、1∶100稀釋后，各取200 μL涂布在10%濃度的2216E和10%濃度的R2A固體平板培養(yǎng)基上，于 25 ℃培養(yǎng)14～20 d，觀察長(zhǎng)出的菌落，挑取不同的單菌落接種至含有2216E和R2A固體斜面培養(yǎng)基上，放入4 ℃冰箱保存。

航次結(jié)束后將試管中的菌落帶回實(shí)驗(yàn)室，接種到對(duì)應(yīng)的2216E和R2A固體平板培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，于25 ℃培養(yǎng)3～5 d，根據(jù)不同菌落形態(tài)，包括顏色、形狀、大小和透明度等，挑取不同的單菌落劃線純化，使用30%甘油于-80 ℃超低溫冰箱保種。

1.4 細(xì)菌16S rDNA基因測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育分析

純化細(xì)菌16S rDNA基因測(cè)序由青島擎科生物公司完成，采用裂解法提取細(xì)菌基因組DNA，使用通用引物7F(5’-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3’)和1 540R(5’-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’)進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系(50 μL):PCR mix 46 μL；引物7F、1 540R各1 μL；Tamplate 2 μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性98 ℃ 3 min；擴(kuò)增(35個(gè)循環(huán))：變性98 ℃ 10 s，退火55 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 20 s；最后72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后進(jìn)行16S rDNA基因序列測(cè)定，將得到的16S rDNA基因序列在EZBioCloud(https://eztaxon-e.ezbiocloud.net/)上比對(duì)，并將測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)得到序列號(hào)(MT914193-MT914217)。應(yīng)用MEGA7.0軟件，采取鄰位相接法，Bootstrap方式，Replications設(shè)定為1 000，以AcidianusambivalensDSM 3772作為外緣菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 群體感應(yīng)細(xì)菌的篩選與信號(hào)分子解析

1.5.1 群體感應(yīng)細(xì)菌的篩選 群體感應(yīng)細(xì)菌檢測(cè)的報(bào)告菌株為AgrobacteriumtumefaciensKYC55(由馬里蘭大學(xué)海洋環(huán)境技術(shù)研究所Hill實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。KYC55有著對(duì)中鏈 AHLs 較敏感的特性, 當(dāng)它接觸到外源的 AHLs 時(shí)，會(huì)產(chǎn)生 β-半乳糖苷酶，X-gal 遇到 β-半乳糖苷酶會(huì)被分解，且生成的產(chǎn)物具有藍(lán)色。采用瓊脂擴(kuò)散法，將熱液貽貝可培養(yǎng)共附生細(xì)菌用滅菌牙簽接種到對(duì)應(yīng)的固體平板培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)1～2 d，待形成菌落后，將AHLs信號(hào)分子檢測(cè)培養(yǎng)基(見1.2)倒入長(zhǎng)有待檢測(cè)單菌落的平板，于25 ℃培養(yǎng)12 h，若菌落周圍產(chǎn)生藍(lán)色斑點(diǎn)則為群體感應(yīng)細(xì)菌，說明該菌株能夠產(chǎn)生AHLs信號(hào)分子。

1.5.2 TLC生物自顯影方法分析群體感應(yīng)細(xì)菌AHLs的種類 首先提取AHLs信號(hào)分子，將篩選出的群體感應(yīng)細(xì)菌接種到200 mL的液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)(25 ℃，180 r/min)至OD600nm為0.6～0.8，離心菌液(4 ℃，8 000 r/min，10 min)，取上清液，調(diào)pH范圍為6.9～7.0，使用300 mL乙酸乙酯分2次萃取，將上層萃取液旋蒸濃縮至1 mL，并轉(zhuǎn)移到2.5 mL氣相小瓶中，用氮?dú)獯蹈珊笕芙庠?00 μL的色譜純乙酸乙酯中，放于-20 ℃冰箱保存。

將群體感應(yīng)細(xì)菌的乙酸乙酯提取物在反向TLC硅膠板(TLC aluminium sheets, 20 cm×20 cm, silica Gel 60F254, Merck, USA)上每隔2 cm點(diǎn)樣，以60%甲醇溶液層析4 h，無菌操作臺(tái)上吹干后放置在含有已凝固的軟瓊脂(0.8%)的方形容器內(nèi)，上層倒入AHLs信號(hào)分子檢測(cè)培養(yǎng)基(見1.2)，于25 ℃靜置培養(yǎng)12 h，觀察TLC板上藍(lán)斑的數(shù)量和位置，通過計(jì)算樣品藍(lán)斑的比移值(Rf值)和標(biāo)準(zhǔn)品藍(lán)斑的比移值判斷AHLs種類。比移值(Rf值)是層析原點(diǎn)到藍(lán)斑中心的距離與原點(diǎn)到甲醇溶液層析前沿的距離的比值。AHLs標(biāo)準(zhǔn)品種類包括N-hexanoyl-L-homoserine lactone (C6-HSL)、N-(β-ketocaproyl)-L-Homoserine lactone (OC6-HSL)、N-octanoyl-L-homoserine lactone (C8-HSL)、N-(3-Oxoctanoyl)-L-homoserine (OC8-HSL)、N-(3-Oxodecanoyl)-L-homoserine (OC10-HSL), 均購(gòu)置于 Cayman Chemical公司(Ann Arbor, USA)

1.5.3 GC-MS法分析群體感應(yīng)細(xì)菌AHLs的種類 參照文獻(xiàn)[20-21]，使用Agilent7890A/5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，將群體感應(yīng)細(xì)菌的乙酸乙酯提取物和AHLs標(biāo)準(zhǔn)品一起用于GC-MS檢測(cè)。載氣為高純度氦，流速為1 mL/min，質(zhì)譜條件設(shè)置為電子電離源70 eV、發(fā)射電流500 μA、質(zhì)譜四級(jí)管150 ℃、質(zhì)譜源230 ℃，質(zhì)譜儀在全掃描模式下運(yùn)行，色譜分析采用離子檢測(cè)模式(SIM，m/z=143)，并與標(biāo)準(zhǔn)品色譜峰進(jìn)行對(duì)照。

1.6 群體感應(yīng)細(xì)菌的功能

1.6.1 結(jié)晶紫染色法測(cè)定菌株的成膜能力 參照Z(yǔ)hu等[22]的方法，將群體感應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600nm=0.8左右)，接種10 μL細(xì)菌培養(yǎng)液到裝有1 mL液體培養(yǎng)基的玻璃試管(100 mm×750 mm)中，25 ℃，150 r/min，震蕩培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，1×PBS溶液清洗試管，去除未被黏附的細(xì)菌，加入2 mL結(jié)晶紫溶液(質(zhì)量濃度0.1%)，靜置30 min，對(duì)黏附在試管壁上的生物膜進(jìn)行染色，棄去染色液，1×PBS溶液清洗試管，倒扣試管干燥，加入2 mL 75%酒精洗脫，洗脫液用紫外分光光度計(jì)測(cè)量OD570 nm處的吸光值，以E.coliDH5a為陰性對(duì)照，評(píng)估成膜能力，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)平行。陰性對(duì)照吸光度為ODc，QS菌結(jié)晶紫染色后洗脫液的吸光度為OD，若OD

1.6.2 菌株利用DMSP能力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[23-24]將群體感應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600nm=0.8左右)，取100 μL稀釋的QS細(xì)菌懸液(OD600nm=0.3)加入到含有1.9 mL 5%濃度的DMSP培養(yǎng)基(見1.2)的頂空瓶中，錫箔紙包裹瓶身，每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)平行，設(shè)置加入100 μL滅菌海水為空白對(duì)照，在25 ℃以180 r/min培養(yǎng)12 h，在Agilent7697A型氣相色譜儀中檢測(cè)產(chǎn)生的DMS。以氣相色譜檢測(cè)的DMSP堿解成DMS的峰面積和DMSP物質(zhì)的量的關(guān)系(見式(1))繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過換算菌株降解DMSP的量計(jì)算DMSP的降解率(見式(2)):

(1)

DMSP降解率= DMSP降解量/DMSP添加量× 100%。

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 貽貝共附生細(xì)菌多樣性的分析

從熱液貽貝中分離出可培養(yǎng)共附生細(xì)菌96株，根據(jù)不同菌落形態(tài)(大小、顏色、透明度等)及16S rDNA基因序列確定出25株不同菌株(見表1)，它們分屬于4個(gè)門、5個(gè)綱、14個(gè)屬，其中在2216E培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的有19株，在R2A培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的有6株。

表1 天成熱液區(qū)深海貽貝鰓共附生可培養(yǎng)細(xì)菌鑒定結(jié)果

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析如圖3所示，從門水平來看，這些菌株屬于變形菌門(Proteobacteria，16株)、厚壁菌門(Firmicutes，7株)、放線菌門(Actinobacteria，1株)和擬桿菌門(Bacteroidetes，1株)，分別占可培養(yǎng)共附生細(xì)菌的64%、28%、4%和4%，由此可見變形菌門(Proteobacteria)是優(yōu)勢(shì)菌群。從綱的水平來看，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)為優(yōu)勢(shì)菌群，其中有5株細(xì)菌屬于玫瑰桿菌(Roseobacter)類群， 占可培養(yǎng)共附生細(xì)菌的20%。從屬水平來看，這些可培養(yǎng)細(xì)菌包括橙色單胞菌屬(Aurantimonas)2株、小桿菌屬(Epibacterium)2株、赤桿菌屬(Erythrobacter)2株、玫瑰色鮮艷菌屬(Roseivivax)1株、亞硫酸鹽桿菌屬(Sulfitobacter)2株、鹽單胞菌屬(Halomonas)2株、海桿菌屬(Marinobacter)2株、發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)1株、假交替單胞菌屬(Pseudoalteromonas)2株、微桿菌屬(Marinobacter)1株、芽孢桿菌屬(Bacillus)2株、大洋芽孢桿菌屬(Oceanobacillus)1株、葡萄球菌屬(Staphylococcus)4株和環(huán)桿菌屬(Cyclobacterium)1株。由此可見熱液貽貝共附生細(xì)菌有著較豐富的多樣性。

圖3 熱液貽貝可培養(yǎng)共附生細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 群體感應(yīng)細(xì)菌的信號(hào)分子解析

從熱液貽貝共附生細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)3株群體感應(yīng)細(xì)菌，均生長(zhǎng)在2216E培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度為25 ℃，分別是亞硫酸鹽桿菌屬的SulfitobacterpontiacusTCYB15(MT914198)、S.pontiacusTCYB21(MT914201) 和海玫瑰色鮮艷菌屬的RoseivivaxmarinusTCYB24 (MT914204)，且全部屬于玫瑰桿菌類群。TLC生物自顯影結(jié)果表明，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，通過計(jì)算Rf值，S.pontiacusTCYB15產(chǎn)生C8-HSL(Rf=0.073)和C6-HSL(Rf=0.248)2種信號(hào)分子，S.pontiacusTCYB21和R.marinusTCYB24只產(chǎn)生C8-HSL(Rf=0.073) 一種信號(hào)分子(見圖4)。GC-MS結(jié)果顯示：TCYB15提取物中兩個(gè)峰顯示的保留時(shí)間分別為7.423和8.337，與標(biāo)準(zhǔn)品C6-HSL和C8-HSL一致，TCYB21和TCYB24提取物中一個(gè)峰顯示的保留時(shí)間為8.357，與標(biāo)準(zhǔn)品C8-HSL一致(見圖5)。

(A：C系HSL混標(biāo)，C6-HSL，C8-HSL，C12-HSL；B：OC系HSL混標(biāo)，3-oxo-C6-HSL，3-oxo-C8-HSL，3-oxo-C10-HSL；C：菌株S. pontiacus TCYB15提取物；D：菌株S. pontiacus TCYB21提取物；E：菌株Roseivivax marinus TCYB24提取物。A: Mixture of synthetic HSL standards, C6-HSL, C8-HSL; B: Mixture of synthetic 3-oxo-HSL standards, OC6, OC8, OC10; C: Extracts of strain S. pontiacus TCYB15; D: Extracts of strain S. pontiacus TCYB21; E: Extracts of strain R. marinus TCYB24.)

(A：標(biāo)準(zhǔn)品，C6-HSL；B：標(biāo)準(zhǔn)品，C8-HSL；C：菌株S. pontiacus TCYB15提取物；D：菌株S. pontiacus TCYB21提取物；E：菌株R. marinus TCYB24提取物。A: HSL standard, C6-HSL; B: HSL standard, C8-HSL; C: Extracts of strain S. pontiacus TCYB15; D: Extracts of strain S. pontiacus TCYB21; E: Extracts of strain R. marinus TCYB24.)

2.3 群體感應(yīng)細(xì)菌的功能分析

2.3.1 群體感應(yīng)細(xì)菌的成膜能力 結(jié)晶紫染色結(jié)果表明，陰性對(duì)照菌株E.coliDH5a在試管壁上未留下紫色生物膜，洗脫液吸光值為0.507，菌株S.pontiacusTCYB15，S.pontiacusTCYB21和R.marinusTCYB24均在試管壁上形成紫色生物膜，洗脫液在OD570 nm處的吸光值分別為2.004，1.998和0.905，分別達(dá)到陰性對(duì)照吸光值的3.95倍，3.94倍，1.79倍，經(jīng)過評(píng)估，有3株貽貝共附生群體感應(yīng)細(xì)菌都具有成膜能力，其中亞硫酸鹽桿菌屬的3株S.pontiacusTCYB15和S.pontiacusTCYB21具有中等成膜能力，R.marinusTCYB24具有弱成膜能力(見圖6)。

(A：試管壁上形成的生物膜；B：570 nm處的吸光值； ：顯著性差異分析中P值小于0.01，表示極顯著差異。A: Absorbance at 570 nm;B: Biofilm formed on the wall of the test tube； : The P-value is less than 0.01 in the significant difference analysis, indicating a very significant difference.)

2.3.2 群體感應(yīng)細(xì)菌利用DMSP的能力 本研究以DMSP做為硫源，檢測(cè)QS菌對(duì)其利用能力，結(jié)果顯示，有3株QS細(xì)菌具有利用DMSP的能力。根據(jù)峰面積計(jì)算得出，空白對(duì)照組DMSP基本上沒有降解，菌株S.pontiacusTCYB15的DMSP降解率為63.32%，菌株S.pontiacusTCYB21的DMSP降解率為68.63%，菌株R.marinusTCYB24的DMSP降解率為54.93%。由此可見，亞硫酸鹽桿菌屬的2株細(xì)菌S.pontiacusTCYB15和S.pontiacusTCYB21降解DMSP的能力較強(qiáng)(見圖7)。

(：顯著性差異分析中P值小于0.01，表示極顯著差異。: The P-value is less than 0.01 in the significant difference analysis, indicating a very significant difference.)

3 討論

由于生存環(huán)境的極端性，熱液區(qū)的大多數(shù)微生物是難以培養(yǎng)的[25]，然而依賴于培養(yǎng)的方法對(duì)于菌株生理功能的認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)是必要的[26]，獲得可培養(yǎng)菌株有助于了解熱液區(qū)復(fù)雜的生命過程。因此，本研究對(duì)熱液貽貝鰓中的共附生細(xì)菌進(jìn)行了分離與鑒定，探究貽貝共附生細(xì)菌的種類和功能，并開展了熱液貽貝共附生細(xì)菌中群體感應(yīng)細(xì)菌的功能研究。

本研究以西南印度洋天成熱液區(qū)深海偏頂蛤(Bathymodiolusmarisindicus)為樣品，在25 ℃溫度下使用常規(guī)的2種培養(yǎng)基(2216E，R2A)對(duì)熱液貽貝鰓中的共附生細(xì)菌進(jìn)行了分離純化，經(jīng)16SrRNA基因測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析，得到25株不同的共附生細(xì)菌，它們由變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門組成，變形菌門數(shù)量最多，在綱的水平上，α-變形菌綱、γ-變形菌綱和芽孢桿菌綱為優(yōu)勢(shì)菌群。已有研究發(fā)現(xiàn)，從南海冷泉區(qū)分離得到的純培養(yǎng)深海貽貝附生細(xì)菌分屬于變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，其中變形菌門占大部分[27]。 Dick[1]在研究熱液區(qū)各個(gè)生境中的主要微生物類型時(shí)發(fā)現(xiàn)，熱液動(dòng)物的內(nèi)共生菌主要為γ-變形菌綱和α-變形菌綱，對(duì)海膽和珊瑚附生細(xì)菌的研究也發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱為優(yōu)勢(shì)菌群[28]，由此可見，變形菌門是海洋無脊椎動(dòng)物共附生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門類，這些研究發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果相一致。

多年的研究表明，海洋環(huán)境中存在一類群體感應(yīng)細(xì)菌, 它們通過感應(yīng)信號(hào)分子來調(diào)節(jié)群體生理現(xiàn)象，例如形成生物膜、產(chǎn)生毒素/色素/抗生素、生物發(fā)光、質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和共生等[14-15]。盡管Johnson等[16]發(fā)現(xiàn)深海熱液微生物中存在群體感應(yīng)現(xiàn)象，但并未找到AHLs群體感應(yīng)系統(tǒng)存在的直接證據(jù)，本研究證實(shí)深海熱液微生物中確實(shí)存在群體感應(yīng)(QS)細(xì)菌。從貽貝共附生細(xì)菌中篩選出了3株群體感應(yīng)細(xì)菌：S.pontiacusTCYB15，S.pontiacusTCYB21和R.marinusTCYB24。Tait等[29]在研究AHLs調(diào)節(jié)石莼游動(dòng)孢子的游泳行為時(shí)發(fā)現(xiàn)Sulfitobacter可以產(chǎn)生C4-HSL和C8-HSL兩種信號(hào)分子，其中C8-HSL是海洋細(xì)菌中普遍存在的AHL[30]，本實(shí)驗(yàn)中的3株群體感應(yīng)細(xì)菌也均產(chǎn)生C8-HSL，另外在S.pontiacusTCYB15中同時(shí)檢測(cè)到了C6-HSL，這說明Sulfitobacter能夠產(chǎn)生多樣化的AHLs信號(hào)分子。分子層面上， Ankrah對(duì)同一屬的Sulfitobactersp. strain CB2047基因組草圖的研究發(fā)現(xiàn)，此菌株基因組存在?；?高絲氨酸內(nèi)酯(AHLs)合成酶基因，卻沒有發(fā)現(xiàn)AHLs結(jié)合蛋白基因，他認(rèn)為單一的AHLs合成酶基因在Sulfitobacter中普遍存在[31]。Dai 等[32]于2014年從深海環(huán)境中鑒定出了R.marinus這一新種，但是之后一直未見Roseivivax屬的細(xì)菌可以產(chǎn)生AHLs的報(bào)道，本研究發(fā)現(xiàn)R.marinusTCYB24具有群體感應(yīng)現(xiàn)象尚屬首次報(bào)道。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)這3株群體感應(yīng)細(xì)菌均能形成生物膜，有學(xué)者認(rèn)為生物膜的形成可以增強(qiáng)細(xì)菌抵抗環(huán)境壓力的抗性并黏附周圍海水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以此促進(jìn)微生物的抗逆能力[33-34]。深海熱液環(huán)境中物質(zhì)匱乏、能量形式較為簡(jiǎn)單，且具有多種極端環(huán)境因子，所以從營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的獲取和對(duì)不良環(huán)境的抵御方面來看，3株群體感應(yīng)細(xì)菌的生物成膜特性很可能是微生物群落適應(yīng)深海熱液環(huán)境的主要機(jī)制之一。

海底熱液反應(yīng)區(qū)的海水-巖石相互作用產(chǎn)生了硫化氫和其他硫化物，例如多硫化物，單質(zhì)硫和硫代硫酸鹽等，硫化物和微生物之間的氧化還原反應(yīng)在熱液生態(tài)系統(tǒng)中建立起復(fù)雜的硫代謝網(wǎng)絡(luò)[35]。玫瑰桿菌(Roseobacter)類群的細(xì)菌[36]在海洋硫循環(huán)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，除了通過降解二甲基巰基丙酸內(nèi)鹽(DMSP)產(chǎn)生與氣候調(diào)節(jié)相關(guān)的氣體二甲基巰(DMS)之外[37]，還可以利用其他有機(jī)硫(例如：甲基化硫、巰基甲醇和二甲基硫)作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，另外還具有代謝無機(jī)硫(例如：亞硫化物，硫化物，單質(zhì)硫以及過硫化物)的能力，以降低這些物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的毒性[38-39]。深海熱液環(huán)境中含有大量的硫化物，是海洋中硫元素的重要來源，這為海洋玫瑰桿菌的生存提供了豐富的硫源，值得關(guān)注的是該類群中的細(xì)菌大部分都具有群體感應(yīng)現(xiàn)象，而本研究結(jié)果也表明，分離培養(yǎng)出的3株群體感應(yīng)細(xì)菌均屬于玫瑰桿菌類群，通過DMSP降解能力檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這3株群體感應(yīng)細(xì)菌都能降解DMSP。林鈺等[24]對(duì)馬里亞納海溝可培養(yǎng)細(xì)菌的研究也顯示深海環(huán)境中存在大量DMSP降解菌，這說明深海環(huán)境中存在DMSP形式的硫化物，因此本文作者認(rèn)為熱液環(huán)境中的群體感應(yīng)細(xì)菌，在與生物共附生的過程中，可以利用DMSP作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在硫循環(huán)中發(fā)揮著重要作用。此外，DMSP是生物細(xì)胞內(nèi)一種滲透壓調(diào)節(jié)劑，可以起到在不利滲透壓條件時(shí)保護(hù)生物的作用[40]，群體感應(yīng)細(xì)菌調(diào)節(jié)DMSP的吸收可能是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境壓力的保護(hù)機(jī)制之一。

本研究中篩選出的2株亞硫酸鹽桿菌屬的貽貝共附生群體感應(yīng)細(xì)菌S.pontiacusTCYB15和S.pontiacusTCYB21，由于其來自于高溫、高毒且硫化物和重金屬含量都很高的深海熱液環(huán)境，還具有成膜和利用DMSP的能力，所以下一步研究將對(duì)它們的基因組進(jìn)行測(cè)序和功能注釋，以便解析熱液貽貝在特殊環(huán)境中的生存策略及與宿主和環(huán)境的相互作用關(guān)系。