呂楊蘭

三明市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，福建 三明 365000

氯雷他定為抗組胺藥，主要用于緩解過敏性鼻炎有關(guān)的癥狀。藥物制劑常因本身沒有抑菌特性或者抑菌效力比較弱，使用過程中易造成微生物的污染，因此，大部分藥物一般為獨(dú)立包裝，使用過程中不容易引起污染，而本次試驗(yàn)所用檢品為多劑量糖漿劑，患者使用過程中需要多次開啟，增加了污染的概率。為了避免微生物污染所帶來的危害，廠家一般會(huì)在藥物制劑中添加適宜的抑菌劑［1］。

2020 年版《中國藥典》四部通則0116 糖漿劑中有規(guī)定［2］，如果制劑處方中需要加入抑菌劑，除了另有規(guī)定外，其抑菌效力需符合通則1121 項(xiàng)下的規(guī)定?？梢?，對(duì)氯雷他定糖漿劑抑菌效力的測(cè)定是其質(zhì)量控制中的一項(xiàng)重要指標(biāo)［3-4］。廠家根據(jù)其特性添加了不同濃度的苯甲酸鈉作為抑菌劑。受該藥廠的委托，建立測(cè)定氯雷他定糖漿劑抑菌效力的方法，并檢驗(yàn)廠家提供的三批藥品是否符合要求，進(jìn)而對(duì)廠家確定出適宜的抑菌劑及合理添加量提供幫助。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

YXQ-50G 壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），BS1360-Ⅱ-A2 生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司），SPX-150B-Z 細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），LRH-325A霉菌培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 菌種

大腸埃希菌［CMCC（B）44102］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］，上述標(biāo)準(zhǔn)菌株全部來自中國食品藥品檢定研究院，工作用菌株為凍干粉，第0 代。

1.3 供試品

氯雷他定糖漿劑樣品1（批號(hào)2004F-01-082，規(guī)格60 mL，抑菌劑0.8 mg/mL）；氯雷他定糖漿劑樣品2（批號(hào)2004F-01-083，規(guī)格60 mL，抑菌劑1.2 mg/mL）；氯雷他定糖漿劑樣品3（批號(hào)20210301，規(guī)格60 mL，抑菌劑1 mg/mL）。以上樣品使用的抑菌劑均為苯甲酸鈉。

1.4 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)210123）；胰酪大豆胨瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)135025-202103）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào) 1095501）；沙氏葡萄糖瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)135013-201703）；pH7.0 氯化鈉-蛋白胨緩沖液（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)1093561）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)210129）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）（北京三藥科技開發(fā)公司，批號(hào)2010132）。經(jīng)驗(yàn)證培養(yǎng)基的適用性符合規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌落計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.1.1 菌懸液的制備取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌的凍干粉適量加入到TSB 培養(yǎng)基，33 ℃培養(yǎng)24 h 備用。取白色念珠菌凍干粉適量加入SDB，23 ℃培養(yǎng)48 h 備用。取黑曲霉的沙氏葡萄糖固體斜面培養(yǎng)物，加5 mL 含0.05%（mL/mL）吐溫-80 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下霉菌孢子［5-6］，作為原液備用。

2.1.2 菌落計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證在進(jìn)行抑菌效力檢查前，首先應(yīng)確保菌落計(jì)數(shù)方法的可行性。此次計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證按照《中國藥典》2020 年版四部通則“1105”微生物計(jì)數(shù)法進(jìn)行［2］。（1）試驗(yàn)組。取樣品10 mL 加至90 mL 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，制成1∶10 供試液。取“2.1.1”項(xiàng)下制備好的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌菌液各0.1 mL分別加入至1∶10供試液9.9 mL，混勻，使得每毫升稀釋液中細(xì)菌菌數(shù)均應(yīng)不大于100 cfu，立即取1 mL 此稀釋液注入平皿，傾注胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基；另取上述白色念珠菌及黑曲霉試驗(yàn)菌液各0.1 mL 分別加入至1∶10 供試液9.9 mL，混勻，使得每毫升稀釋液中霉菌菌數(shù)均應(yīng)不大于100 cfu，立即分別取1 mL 此稀釋液注入平皿，傾注沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每種菌平行制備2 個(gè)平皿。分別按規(guī)定溫度及時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)定其菌落數(shù)。（2）菌液對(duì)照組。取試驗(yàn)組相同的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌及黑曲霉5 種菌懸液各0.1 mL 分別加入至pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液9.9 mL，混勻。分別取1 mL 注入平皿，傾注胰酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每種菌平行制備2 個(gè)平皿。按規(guī)定溫度及時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)定其菌落數(shù)。（3）供試液對(duì)照組。取試驗(yàn)組項(xiàng)下的1∶10 供試液1 mL 注入平皿，傾注胰酪蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基平行制備2 皿.按規(guī)定溫度及時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)定供試液本底菌數(shù)。（4）陰性對(duì)照試驗(yàn)。取pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液1 mL，按試驗(yàn)組操作。

2.1.3 結(jié)果回收率計(jì)算試驗(yàn)組平均菌落數(shù)減去供試液對(duì)照組平均菌落數(shù)的差與菌落對(duì)照組平均菌落數(shù)的比值。經(jīng)過驗(yàn)證，每株菌落回收率均大于50%，符合2020 年版《中國藥典》要求［2］，平皿法即可作為菌落計(jì)數(shù)方法。

2.2 抑菌效力試驗(yàn)

2.2.1 接種菌液菌數(shù)測(cè)定在進(jìn)行抑菌效力試驗(yàn)前，接種的菌懸液需要進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定。用0.9%無菌氯化鈉溶液將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、白色念珠菌和黑曲霉的孢子菌懸液分別進(jìn)行10 倍稀釋，取10-5、10-6、10-7三個(gè)稀釋級(jí)的稀釋液各1 mL 至平皿中，每個(gè)稀釋級(jí)平行制備2 個(gè)平皿，分別加入胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或者沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，用平皿法測(cè)定菌數(shù)。結(jié)果見表1。

表1 試驗(yàn)菌菌液計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/mL）

2.2.2 供試品接種本次廠家提供的氯雷他定糖漿劑的包裝，容量足夠用，無需另換其他容器，同時(shí)包裝容器也能夠保證按無菌操作要求接入試驗(yàn)菌及后續(xù)試驗(yàn)，為了使接種的菌懸液與樣品充分混合均勻，分別取3 個(gè)批次的樣品（包裝規(guī)格60 mL）各兩瓶，移去10 mL 樣品后，每批樣品分別接種3 種細(xì)菌(大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌)和2 種真菌(白色念珠菌、黑曲霉)，分別依次接種菌懸液各500 μL，使其最終菌懸液的濃度為105～106cfu/mL。置20 ℃避光儲(chǔ)存。

2.2.3 存活菌數(shù)測(cè)定廠家提供的三批藥品均為口服制劑，按照《中國藥典》2020 年版口服制劑抑菌效力標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷［2］，5 種供試菌分別于接種后的14 d、28 d 測(cè)定其供試樣品中存活菌數(shù)，按照菌落計(jì)數(shù)法適用性試驗(yàn)所確定的方法，測(cè)定供試品中所含的菌數(shù)是否滿足要求。計(jì)算l mL 供試品各試驗(yàn)菌在14 d，28 d 各間隔時(shí)間的菌數(shù)減少值，并換算成1 g 值（見表2）。

表2 抑菌效力測(cè)試結(jié)果

2.2.4 口服制劑抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)《中國藥典》2020 年版四部制劑通則“1121 抑菌效力檢查法”的規(guī)定［2］，口服制劑藥品取樣時(shí)間間隔為14 d 和28 d。細(xì)菌數(shù)量換算成lg 值后，在14 d 時(shí)減少的lg值要不小于3；真菌數(shù)量換算成lg 值后，在14 d 減少的lg 值要不小于1。細(xì)菌和真菌在28 d 數(shù)量相對(duì)于14 d 來看，數(shù)量增加不超過0.5 lg 視為未增加。

三批藥品在第14 天，細(xì)菌菌數(shù)跟初始加入的菌數(shù)比，下降的lg 值均大于3，真菌菌數(shù)跟初始加入的真菌數(shù)比，下降的lg 值均大于1；在第28 天，三批藥品的細(xì)菌數(shù)和真菌數(shù)與第14 天相比，減少的lg值為0，無增加；根據(jù)上述抑菌效力判斷標(biāo)準(zhǔn)，該廠家提供的三批次藥品均通過抑菌效力挑戰(zhàn)試驗(yàn)。

3 討論

抑菌劑也被稱為防腐劑，在制劑中添加抑菌劑的時(shí)候，不僅要考慮抑菌效果，還要同時(shí)考慮抑菌劑的毒性［7］?！吨袊幍洹?020 年版糖漿劑中規(guī)定添加苯甲酸的用量不得過0.3%（其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計(jì)）［2］，這個(gè)范圍很寬泛，本試驗(yàn)結(jié)果雖然表明該廠提供的藥品制劑通過了抑菌效力測(cè)試，但對(duì)于抑菌劑添加量的確定還需要廠家進(jìn)一步摸索試驗(yàn)［8］。

另外，廠家提供的是糖漿劑，糖漿劑本身是含有高濃度的蔗糖水溶液，這類口服制劑還可選用魯氏酵母菌，該菌可耐受高糖高鹽高滲環(huán)境，如果該抑菌效力測(cè)定中加入魯氏酵母菌作為試驗(yàn)菌株，將更加全面、科學(xué)［9］。

抑菌劑的添加是為了保證用藥安全，防止在使用期間藥品被微生物污染，但添加抑菌劑的量及抑菌劑的種類，都需要生產(chǎn)企業(yè)嚴(yán)格把關(guān)，不能只為了抑菌效力達(dá)標(biāo)，而盲目添加［10-11］。另外，全面了解各類抑菌劑的特性及影響因素，合理科學(xué)地添加才能保證用藥安全。