霍瑞卿 田軍彪 趙敏菡 李芳釗 孫 闊 韓宇帆 （河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 60 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（250±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK-（京）2016-0006。所有動(dòng)物飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院SPF 級(jí)動(dòng)物房，21～25 ℃，自由飲食取水。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物及試劑 化濁解毒活血通絡(luò)方（黃連6 g、茯苓15 g、澤瀉6 g、丹參15 g、赤芍15 g、當(dāng)歸9 g、石菖蒲15 g、郁金15 g、川芎9 g、地龍15 g、甘草6 g，為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒）；鱟試劑（ECK-0882，湛江安度斯生物有限公司）；IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒（SXR087、SXR039，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司）；NF-κB（8242S，CST）；TLR4、Occludin 抗 體（ab13867、ab216327，美 國(guó)Abcam）；ZO-1（40-2300，美國(guó)Thermo Fisher Scientific）；β-actin（bs-0061R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；Eastep Super Total RNA Extraction Kit、GoTaq qPCR Master Mix（LS1040、A6002，Promega）；Primers（260064816，生工上?？偛亢铣刹浚?。

1.1.3 儀器 7170A 型全自動(dòng)生化儀、BX53 型顯微鏡、721 型可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠(chǎng)）；RM2015 型切片機(jī)、CM1950 型冰凍切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；KZ-Ⅱ型勻漿儀（北京Servicebio 公司）；2720 基因擴(kuò)增儀（美國(guó)AB 公司）；CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad）；D3024R 型離心機(jī)（北京DragonLab公司）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型構(gòu)建及分組 60只SPF級(jí)SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）、模型組（MCAO）、化濁解毒活血通絡(luò)方低（TCM-L）、中（TCM-M）、高（TCM-H）組劑量組，每組12 只。改良線(xiàn)栓法建立缺血再灌注損傷模型：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定，頸部皮膚乙醇消毒，頸正中線(xiàn)開(kāi)口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA），穿線(xiàn)備用。夾閉CCA近心端和ICA，ECA近頭端兩條線(xiàn)系死結(jié)，ECA 近心端線(xiàn)系活結(jié)，ECA 近心端兩條線(xiàn)間剪一倒“V”小口，插入線(xiàn)栓，系緊ECA 近心端線(xiàn)，固定線(xiàn)栓，將ECA 提起，解開(kāi)ICA 動(dòng)脈夾，緩慢推送線(xiàn)栓至ICA，線(xiàn)端進(jìn)入1.8 cm 左右感有一定阻力時(shí)停止推進(jìn)，解開(kāi)CCA 動(dòng)脈夾，此時(shí)線(xiàn)栓頭端正好位于大腦中動(dòng)脈（middle artery，MCA）起始部，即導(dǎo)致阻斷，缺血2 h 后拔出線(xiàn)栓［16］。術(shù)后快速對(duì)MCAO 模型大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，0 分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1 分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，病灶對(duì)側(cè)（左側(cè)）前爪不能完全伸展；2 分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)（左側(cè)）轉(zhuǎn)圈；3 分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，行走時(shí)向病灶對(duì)側(cè)（左側(cè)）傾倒；4 分：不能自發(fā)行走并出現(xiàn)意識(shí)障礙。評(píng)分＞1 分即可從神經(jīng)缺損評(píng)分角度認(rèn)為造模成功，每組選取3 只大鼠進(jìn)行TTC 染色，梗死區(qū)腦組織呈白色則為造模成功。

高職院校一線(xiàn)教師大多由高學(xué)歷背景、高研究能力的碩博研究生組成，他們擁有較強(qiáng)的教學(xué)能力和科研能力，能夠承擔(dān)較重的教學(xué)任務(wù)，然而缺乏敏銳的市場(chǎng)洞察力，科研課題偏重基礎(chǔ)理論的研究，應(yīng)用型研究較少。在選擇科研項(xiàng)目時(shí)，重點(diǎn)考慮學(xué)術(shù)水平的高低和項(xiàng)目的新穎性，忽視了研究成果產(chǎn)品化的可行性，導(dǎo)致研究成果與實(shí)際市場(chǎng)需求脫節(jié)。

1.2.2 干預(yù)方法 化濁解毒活血通絡(luò)方低、中、高各劑量組分別灌胃給予6.25、12.5、25 g/kg 化濁解毒活血通絡(luò)方2 ml，假手術(shù)與模型組灌胃給予2 ml生理鹽水，1次/d，連續(xù)3 d。再灌注72 h后戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠，腹主動(dòng)脈采取血液，取腦、結(jié)腸組織，一部分-80 ℃保存，一部分固定于4%多聚甲醛溶液。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 腦缺血再灌注72 h 后采用改良版神經(jīng)功能評(píng)分進(jìn)行大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分［17］。

1.2.4 腦梗死面積測(cè)定 灌胃給藥3 d 后麻醉大鼠，斷頭取腦，生理鹽水沖洗，-20 ℃速凍20 min，置于腦槽中切片，TTC 染色，Image J 軟件測(cè)定腦梗死范圍百分比（%）。

1.2.5 病理學(xué)形態(tài)檢測(cè) 取大鼠腦、結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛液中固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，梯度乙醇脫水，HE 染色，顯微鏡下觀(guān)察大鼠腦、結(jié)腸組織細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.6 TUNEL 檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡 取腦組織常規(guī)石蠟切片，二甲苯浸洗2次脫蠟，5 min/次，梯度乙醇浸洗水化，滴加蛋白酶K 消化增加細(xì)胞通透性，37 ℃孵育20 min，滴加100 μl TUNEL 反應(yīng)混合液加蓋玻片，37 ℃避光孵育1 h，滴加50 μl converterPOD加蓋玻片，37 ℃避光孵育30 min，100 μl DAB 混合液顯色，室溫反應(yīng)10 min，蘇木素復(fù)染3 min后沖洗，鹽酸-乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下統(tǒng)計(jì)凋亡細(xì)胞數(shù)（凋亡細(xì)胞被染色），隨機(jī)挑選5個(gè)視野計(jì)數(shù)并拍照。

1.2.7 LPS 含量檢測(cè) 取100 μl 血清，參照鱟試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)LPS含量。

1.2.8 ELISA 檢 測(cè) 腦 組 織IL-1β、TNF-α 及 血 清DAO 含量 參照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)大鼠腦組織勻漿上清中IL-1β、TNF-α 含量，同時(shí)測(cè)定其總蛋白濃度用以校正，血清中DAO 含量測(cè)定嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.9 Western blot 檢測(cè)腦組織TLR4、NF-κB 及腸組織ZO-1、Occludin蛋白表達(dá) 剪取腦組織、結(jié)腸組織各100 mg，加入RIPA 細(xì)胞裂解液1 ml 裂解，離心10 min，取上清，與上樣緩沖液加熱后進(jìn)行10%SDSPAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗（1∶800 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜，反復(fù)洗膜，加入二抗（1∶5 000 稀釋?zhuān)┦覝胤跤? h；ECL 發(fā)光，凝膠成像儀內(nèi)觀(guān)察蛋白條帶并拍照，以β-actin為內(nèi)參，Image J 軟件定量分析蛋白相對(duì)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。分別計(jì)算TLR4、NF-κB、ZO-1、Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.2.10 RT-PCR 檢 測(cè) 腦 組 織MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表達(dá) 取腦組織100 mg，剪碎，液氮研磨，加入1 ml TRIzol 勻漿，提取總RNA，采用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以此cDNA 作為熒光定量模板，按照特定反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，Real time PCR反應(yīng)采用兩步法反應(yīng)程序，預(yù)變性95 ℃10 min，44 個(gè)循環(huán)：95 ℃15 s，60 ℃60 s，4 ℃保存。引物采用Premier 5 軟件設(shè)計(jì)（表1），以β-actin 為內(nèi)參，Relative Quantification Study 法分析，2-ΔΔCt法計(jì)算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Prism7.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M 組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分降低（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分升高（P＜0.05，表2）。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of neurological deficit score of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺失評(píng)分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of neurological deficit score of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L 0 10.10±1.521）7.70±1.062）8.10±0.992）9.90±1.103）Neurological deficit score

2.2 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠腦梗死面積的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠腦梗死面積顯著增加（P＜0.05）；與MCAO組相比，TCM-H、TCM-M組大鼠腦梗死面積顯著縮?。≒＜0.05，表3、圖1）。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色Fig.1 TTC staining of brain tissue of rats in each group

表3 各組大鼠腦梗死面積比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of cerebral infarct area of rats in each group（±s，n=3）

表3 各組大鼠腦梗死面積比較（±s，n=3）Tab.3 Comparison of cerebral infarct area of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L Infarct volume/%0 28.32±2.321）13.92±0.792）15.29±5.632）22.40±2.50

2.3 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)變化的影響 Sham 組大鼠腦組織未見(jiàn)異常改變，細(xì)胞排列整齊，染色均勻，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，無(wú)變形壞死細(xì)胞；MCAO 組大鼠腦組織缺血區(qū)域可見(jiàn)大量細(xì)胞變性、壞死，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞間隙增大，胞漿染色變淺，細(xì)胞核固縮、深染，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與MCAO 組相比，化濁解毒活血通絡(luò)方各組腦組織病理狀態(tài)有所改善，TCM-H 組改善最為顯著（圖2）。

圖2 各組大鼠腦組織病理學(xué)改變（HE染色）Fig.2 Pathological changes in brain tissue of rats in each group（HE staining）

2.4 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠腦細(xì)胞凋亡率明顯上升（P＜0.05）；與MCAO組相比，TCM-H和TCM-M 組大鼠腦細(xì)胞凋亡率下降（P＜0.05）；與TCM-L 組相比，TCM-H 組大鼠腦細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05，表4、圖3）。

圖3 TUNEL染色法標(biāo)記凋亡陽(yáng)性細(xì)胞Fig.3 Apoptotic positive cells labeled by TUNEL staining

表4 各組大鼠腦細(xì)胞凋亡率（±s，n=3）Tab.4 Apoptosis rate of cells in brain of rats in each group（±s，n=3）

表4 各組大鼠腦細(xì)胞凋亡率（±s，n=3）Tab.4 Apoptosis rate of cells in brain of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L Apoptosis rate/%9.80±0.87 44.05±2.321）24.12±1.802）28.26±1.642）37.72±0.813）

2.5 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠血清LPS、DAO表達(dá)的影響 與Sham組相比，MCAO組大鼠血清LPS、DAO 含量上升（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H 組大鼠血清LPS、DAO 含量下降（P＜0.05）；與TCM-L 組相比，TCM-H 組大鼠血清LPS、DAO 含量下降（P＜0.05，表5）。

表5 各組大鼠血清LPS、DAO含量（±s，n=3）Tab.5 Serum LPS and DAO contents of rats in each group（±s，n=3）

表5 各組大鼠血清LPS、DAO含量（±s，n=3）Tab.5 Serum LPS and DAO contents of rats in each group（±s，n=3）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L LPS/（EU·ml-1）0.06±0.21 0.10±0.131）0.08±0.152）0.08±0.14 0.10±0.103）DAO/（U·L-1）3.96±0.82 6.01±0.971）4.61±0.872）4.66±0.352）5.62±0.433）

2.6 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠結(jié)腸病理形態(tài)學(xué)變化的影響 Sham 組大鼠結(jié)腸黏膜未見(jiàn)明顯損傷。與Sham 組相比，MCAO 組大鼠結(jié)腸黏膜少許破壞，黏膜水腫，絨毛形態(tài)不規(guī)則，局部出現(xiàn)黏膜破損，化濁解毒活血通絡(luò)方治療后上述情況好轉(zhuǎn)（圖4）。

圖4 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色Fig.4 HE staining for colon tissues of rats in each group

2.7 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠結(jié)腸組織ZO-1、Occludin 蛋白表達(dá)的影響 與Sham 組相比，MCAO 組 大 鼠Occludin、ZO-1 蛋 白 表 達(dá) 降 低（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M 組大鼠Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)有所增加，TCM-H組趨于正常（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L 組ZO-1 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，圖5）。

圖5 各組大鼠結(jié)腸Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平比較Fig.5 Comparison of colon Occludin and ZO-1 protein expression levels of rats in each group

2.8 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI大鼠腦組織IL-1β、TNF-α 表達(dá)的影響 與Sham 組相比，MCAO 組大鼠IL-1β、TNF-α 表達(dá)增加（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M組IL-1β、TNF-α表達(dá)減少（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L 組大鼠IL-1β、TNF-α 表 達(dá)增加（P＜0.05，表6）。

表6 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α表達(dá)（±s，n=3，pg/mg）Tab.6 IL-1β and TNF-α expressions of brain tissues of rats in each group（±s，n=3，pg/mg）

表6 各組大鼠腦組織IL-1β、TNF-α表達(dá)（±s，n=3，pg/mg）Tab.6 IL-1β and TNF-α expressions of brain tissues of rats in each group（±s，n=3，pg/mg）

Note：Compared with sham group，1）P＜0.05；compared with MCAO group，2）P＜0.05；compared with TCM-H group，3）P＜0.05.

Groups Sham MCAO TCM-H TCM-M TCM-L IL-1β 35.65±3.97 84.22±3.901）38.46±1.592）47.91±1.372）75.33±3.373）TNF-α 12.62±1.10 39.96±1.011）19.56±1.842）27.21±0.862）36.50±1.663）

2.9 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠腦組織TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)的影響 與Sham 組相比，MCAO 組 大 鼠TLR4、NF-κB 蛋 白 表 達(dá) 增 加（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H、TCM-M 組大鼠TLR4、NF-κB 蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；與TCM-H 組相比，TCM-L組大鼠TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)增加（P＜0.05，圖6）。

圖6 各組大鼠缺血側(cè)腦組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)Fig.6 TLR4 and NF-κB protein expressions in ischemic lateral brain tissue of rats in each group

2.10 化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI 大鼠腦組織MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表達(dá)的影響 與Sham組相比，MCAO 組大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表達(dá)增加（P＜0.05）；與MCAO 組相比，TCM-H 組大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA 表達(dá)減少（P＜0.05）；與TCM-H 組 相比，TCM-L 組大鼠MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表達(dá)增加（P＜0.05，圖7）。

圖7 各組大鼠缺血側(cè)腦組織中MyD88、IRAK、TRAF6 mRNA表達(dá)比較Fig.7 Comparison of MyD88，IRAK，TRAF6 mRNA expressions of cerebral tissues on ischemic side of rats in each group

3 討論

缺血性卒中是指局部腦組織區(qū)域血液供應(yīng)障礙導(dǎo)致腦組織缺血缺氧性病變壞死，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)功能缺失的表現(xiàn)，高發(fā)于50～60歲人群，男性稍多于女性，具有高發(fā)病率、高致殘率、高病死率等特點(diǎn)，常合并動(dòng)脈硬化、高血壓、高脂血癥或糖尿病等危險(xiǎn)因素或全身性非特異性癥狀［18］。神經(jīng)系統(tǒng)的癥狀與閉塞血管供血區(qū)域腦組織及鄰近受累腦組織功能有關(guān)［19］。靜脈溶栓和介入取栓技術(shù)迅猛發(fā)展，為缺血性卒中提供了新的有效治療手段［20-21］。但靜脈溶栓和介入取栓均面臨CIRI 問(wèn)題。CIRI 指在短時(shí)間內(nèi)血液灌注恢復(fù)后，神經(jīng)細(xì)胞凋亡進(jìn)一步加劇病理過(guò)程，導(dǎo)致腦組織進(jìn)一步損傷。因此，治療CIRI 是缺血性卒中治療成功與否的關(guān)鍵。目前，西醫(yī)在CIRI治療方面尚無(wú)有效手段，如何治療CIRI成為缺血性卒中治療的瓶頸。CIRI 包括細(xì)胞自噬、細(xì)胞凋亡、線(xiàn)粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和炎癥損傷等發(fā)病機(jī)制，其中炎癥損傷是CIRI發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)，如何有效控制炎癥損傷對(duì)改善CIRI 至關(guān)重要［22-23］。因此，本文從炎癥相關(guān)通路探討化濁解毒活血通絡(luò)方對(duì)CIRI的保護(hù)作用。

缺血性卒中屬于中醫(yī)中風(fēng)范疇，痰濁、濕熱、瘀毒是其主要致病因素，“濁凝閉阻清竅，瘀毒損傷腦絡(luò)”是其核心病機(jī)。腦卒中后，產(chǎn)生大量自由基、促炎因子不斷聚集導(dǎo)致大腦持續(xù)缺血缺氧，導(dǎo)致血腦屏障破壞，微循環(huán)障礙。同時(shí)，卒中后會(huì)導(dǎo)致胃腸功能應(yīng)激狀態(tài)，腸道菌群紊亂，腸道菌群代謝產(chǎn)物內(nèi)毒素增多，引起腸道屏障破壞，內(nèi)毒素經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)一步促進(jìn)內(nèi)環(huán)境失衡，因機(jī)體無(wú)法清除這些致病因素形成“瘀毒”使腦損傷進(jìn)一步加重?；瘽峤舛净钛ńj(luò)方是田軍彪教授基于以上理論及總結(jié)多年臨床經(jīng)驗(yàn)探索出的治療缺血性卒中的中藥復(fù)方，臨床療效確切?；瘽峤舛净钛ńj(luò)方中黃連清熱燥濕、瀉火解毒，茯苓、澤瀉健脾利水滲濕，赤芍、丹參、當(dāng)歸、川芎活血行氣化瘀，川芎味辛上行頭目，有引藥上行之效，石菖蒲、郁金降氣化痰祛濕，地龍清熱息風(fēng)，甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用健脾祛濕化痰、清熱活血通絡(luò)，既能調(diào)節(jié)腸腑功能又能減輕腦絡(luò)損傷?，F(xiàn)代藥理研究表明，茯苓三萜、丹參酮和小檗堿具有調(diào)節(jié)免疫功能、減輕炎癥損傷、保護(hù)腸道黏膜、維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)作用［24-26］。研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷和地龍水提取液可抑制促炎因子TNF-α、IL-1β表達(dá)從而減輕CIRI［27-28］。

細(xì)菌LPS 是一種細(xì)菌內(nèi)毒素，是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁中發(fā)現(xiàn)的炎癥標(biāo)志物。研究表明，細(xì)菌LPS與缺血性卒中有關(guān)。LIN 等［29］研究表明，缺血性腦卒中患者存在4 種細(xì)菌代謝途徑，其中LPS 合成在缺血性腦卒中患者中明顯富集，與健康對(duì)照組相比，卒中病例中觀(guān)察到LPS合成富集，枸杞多糖可提高腦卒中敗血癥發(fā)生率。卒中后腸道菌群紊亂，菌群代謝產(chǎn)物L(fēng)PS 增多，選擇性增加大鼠結(jié)腸和回腸血管通透性，導(dǎo)致腸道屏障破壞后隨血液循環(huán)進(jìn)入大腦。LPS 可能通過(guò)兩種途徑進(jìn)入大腦，一是通過(guò)血腦屏障薄弱區(qū)域進(jìn)而在腦內(nèi)彌散；二是通過(guò)與血清蛋白結(jié)合被血腦屏障中有特殊轉(zhuǎn)運(yùn)功能的內(nèi)皮細(xì)胞所攝取［30］。

腸道屏障在防止腸腔內(nèi)有害物質(zhì)如細(xì)菌和內(nèi)毒素進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)其他組織、器官中具有重要作用。腸道屏障以機(jī)械屏障最為重要，其結(jié)構(gòu)為完整的腸黏膜上皮細(xì)胞及上皮細(xì)胞間緊密連接。ZO-1和Occludin 是腸道黏膜屏障完整性的標(biāo)志蛋白，DAO 能夠反映腸道機(jī)械屏障完整性和受損程度。缺血性卒中發(fā)生后，由于腸道應(yīng)激狀態(tài)及腸道菌群紊亂導(dǎo)致腸道黏膜屏障破壞，通透性增加。張楓［31］通過(guò)透射電鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注7 d 后，腸道上皮屏障緊密連接超微結(jié)構(gòu)改變，緊密連接條帶變暗，結(jié)構(gòu)疏松，微絨毛紊亂。張芯［32］研究發(fā)現(xiàn)，CIRI小鼠結(jié)腸黏膜通透性增加，血清DAO濃度升高。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CIRI 大鼠血腦屏障通透性增加，經(jīng)化濁解毒活血通絡(luò)方治療后缺血側(cè)梗死腦組織密連接蛋白ZO-1、Occludin表達(dá)增加，血腦屏障通透性降低［33］。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham 組相比，MCAO 組大鼠血清LPS 增加，腸黏膜水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜破損，結(jié)腸組織ZO-1、Occludin表達(dá)降低，腸道屏障破壞，經(jīng)化濁解毒活血通絡(luò)方治療后LPS水平降低，腸道黏膜屏障得以恢復(fù)，與上述研究結(jié)論一致，因此，推測(cè)化濁解毒活血通絡(luò)方減輕CIRI與減少LPS表達(dá)、修復(fù)黏膜屏障有關(guān)。

TLR4/NF-κB 信號(hào)通路與缺血性卒中密切關(guān)系［34］。研究發(fā)現(xiàn)，LPS 能夠與天然免疫識(shí)別受體TLR4 結(jié)合，進(jìn)而介導(dǎo)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)錄［35］。TLR4 被LPS 激活后與MyD88 的TIR 結(jié)構(gòu)域結(jié)合激活MyD88，形成有活性的TLR4/MyD88 復(fù)合物，通過(guò)其氨基端結(jié)構(gòu)域招募IL-1 受體相關(guān)激酶（IL-1 receptor-associated kinase，IRAK）家族成員，使其磷酸化后與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）結(jié)合，促使NF-κB 和NF-κB 抑制因子（inhibitor of nuclear factorκB，IκB）解聚，核定位序列暴露，從而被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)NF-κB 依賴(lài)的基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步促進(jìn)大量炎癥因子轉(zhuǎn)錄并釋放，包括TNF-α、IL-1β，導(dǎo)致腦組織損傷［36-37］。與此同時(shí)，TNF-α 也可刺激單核-巨噬細(xì)胞生成一系列炎癥因子，如IL-1、IL-6、IL-8 等，引起瀑布反應(yīng)，進(jìn)一步加重缺血區(qū)域腦組織損傷，與本研究結(jié)論一致［38］。本研究發(fā)現(xiàn)，與Sham 組相比，TLR4、MyD88、IRAK、TRAF6、NF-κB及炎癥因子IL-1β、TNF-α表達(dá)明顯上調(diào)，與MCAO 組相比，化濁解毒活血通絡(luò)方治療后上述指標(biāo)均不同程度下調(diào)，表明化濁解毒活血通絡(luò)方可調(diào)控LPS-TLR4/NF-κB 信號(hào)通路改善CIRI。

綜上所述，本研究證實(shí)化濁解毒活血通絡(luò)方可保護(hù)腸道黏膜屏障，明顯降低CIRI 大鼠血清LPS 水平，抑制TLR4/NF-κB 通路過(guò)度激活，降低促炎因子IL-1β、TNF-α表達(dá)，對(duì)CIRI起保護(hù)作用，為臨床用藥提供了理論支持。