陸靈松 沈梅玲 祝珊珊 劉 敏 畢麗偉 李海浪 秦 飛 李 杰

（廈門醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系藥物檢測(cè)中心，廈門 361026）

雄激素受體（androgen receptor，AR）是一種激素誘導(dǎo)型的DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，屬于類固醇受體家族成員，在生物體的器官發(fā)生、生理和病理中發(fā)揮關(guān)鍵性作用［1-4］。研究發(fā)現(xiàn)AR 的紊亂激活與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌及膠質(zhì)瘤［5-10］。AR在腫瘤中發(fā)揮的作用主要是通過與其他信號(hào)通路發(fā)生廣泛關(guān)聯(lián)，由上游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游與癌癥相關(guān)基因表達(dá)，如CyclinD1、PI3K/AKT 信號(hào) 及Hippo mTOR 信 號(hào) 等。特別是在PI3K/AKT 通路中，有研究顯示，在前列腺癌的發(fā)生過程中，PTEN 信號(hào)的突變或缺失可能為AR 和PI3K/AKT 信號(hào)的關(guān)聯(lián)提供了便利［11-12］。本研究通過構(gòu)建3 對(duì)shRNA 干擾的AR 慢病毒載體，利用慢病毒感染肝癌細(xì)胞Hep3B 抑制細(xì)胞內(nèi)AR 的表達(dá)，并驗(yàn)證在肝癌細(xì)胞中AR 的活性與PI3K/AKT/PTEN 信號(hào)通路是否有關(guān)，為以雄激素-AR 信號(hào)軸作為腫瘤細(xì)胞內(nèi)生物學(xué)靶點(diǎn)的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 pLKO.1-GFP-puro、慢病毒重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒（pVSVG 和pHR）購自廈門生命互聯(lián)生物科技公司；PCR 引物由江蘇金維智生物有限公司合成；AR 寡核苷酸鏈及shRNA 質(zhì)粒測(cè)序由廈門紐克泰公司完成；DNA Marker、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ、T4DNA連接酶等購自Fermentas 公司；DNA 提取試劑盒和膠回收試劑盒購自天根；DMEM、1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和青、鏈霉素購自Hyclone 公司；Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑購自Thermo Fisher；Western blot抗體AR（ab198394）、PTEN（ab32199）購自Abcam，p-AKTs473（#4060）購自CST；人胚腎細(xì)胞HEK-293T，肝癌細(xì)胞HepG2、Bel-7402、Hep3B、Huh-7以及正常肝細(xì)胞LO2 均來自本實(shí)驗(yàn)室液氮罐內(nèi)凍存細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 AR-shRNA 慢病毒干擾載體的構(gòu)建 以人AR（GeneBank：NM20132.1）基因設(shè)計(jì)3 條特異性shRNA 序列和1 條陰性對(duì)照序列，合成表達(dá)shRNA的互補(bǔ)單鏈，分別為AR-shRNA-F1R1、AR-shRNAF2R2、AR-shRNA-F3R3?；パa(bǔ)序列如表1 所示，其中畫線部分為反義互補(bǔ)序列，兩端為保護(hù)堿基及AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶位點(diǎn)。

表1 AR慢病毒質(zhì)粒序列引物Tab.1 Primer sequences for AR lentiviral interference plasmid

引物由廈門紐克泰公司合成后，經(jīng)退火反應(yīng)，再同pLKO.1-GFP-puro空載體以限制性內(nèi)切酶AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切，再通過T4DNA連接酶將AR-shRNA片段與載體連接，4 ℃過夜，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α內(nèi)，24 h 后對(duì)陽性菌進(jìn)行菌落PCR 合成擴(kuò)增后（引物如表2 所示），進(jìn)行DNA 電泳、酶切鑒定和測(cè)序，最終獲得的陽性質(zhì)粒命名為pLKO.1-AR-shRNAF1R1、pLKO.1-AR-shRNA-F2R2、pLKO.1-AR-sh-RNA-F3R3。其中測(cè)序引物采用pLKO 的通用測(cè)序引物進(jìn)行擴(kuò)增。

表2 AR shRNA載體的PCR引物Tab.2 PCR primer of AR shRNA vector

1.2.2 慢病毒包裝與病毒滴度測(cè)定 293T 細(xì)胞接種到6 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h，使用Lipo3000 轉(zhuǎn)染試劑分別將3 對(duì)AR 干擾質(zhì)粒和陰性對(duì)照質(zhì)粒以及包裝質(zhì)粒（pVSVG、pHR）加入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，更換新鮮的DMEM培養(yǎng)液（10%的胎牛血清，1 μg/ml嘌呤霉素，1×105U/L 的青霉素及100 mg/L 的鏈霉素），收集293T 細(xì)胞內(nèi)富含慢病毒顆粒的上清液，0.45 μm 濾器過濾病毒上清液并進(jìn)行超速離心，獲得慢病毒濃縮液，分裝后置于-80 ℃冰箱。采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)熒光細(xì)胞法測(cè)定各組的病毒滴度，293T細(xì)胞采用3.5 cm 盤鋪板，每盤1×105個(gè)細(xì)胞。利用不同濃度的病毒上清感染相同數(shù)量的293T 細(xì)胞，48 h后經(jīng)流式細(xì)胞熒光數(shù)檢測(cè)，利用公式：病毒滴度=感染時(shí)細(xì)胞數(shù)（個(gè)）×陽性細(xì)胞（%）/病毒液體積（ml）計(jì)算病毒滴度。各組病毒滴度如表3所示，3組慢病毒的病毒滴度均為2×108TU/ml。

表3 AR慢病毒滴度測(cè)定Tab.3 Titer detection of AR lentivirus

1.2.3 Real-time PCR 檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá) 培養(yǎng)肝細(xì)胞LO2，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、BEL-7402、7702，待細(xì)胞長(zhǎng)滿10 cm 盤后，采用Trizol 法提取細(xì)胞內(nèi)mRNA，利用試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)AR 表達(dá)。同樣的方法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后AR 表達(dá)。RT-PCR 引物設(shè)計(jì)：AR 正向引物5'-CGCAGGCAAGAGCACTGAAGA-3'，反 向引 物5'-ACCACCACCACACGGTCCATA-3'，內(nèi) 參GAPDH 正向引物5'-TGACCACAGTCCATGCCATCA-3'，反向引物5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3'，利用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá) 培養(yǎng)肝細(xì)胞LO2，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、BEL-7402、Huh-7，待細(xì)胞長(zhǎng)滿10 cm 盤后，利用RIPA 法提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，BCA 法測(cè)定總蛋白濃度。制備10% 的SDSPAGE 蛋白膠，每孔蛋白上樣量為30 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、2%脫脂奶粉封閉，并按照AR 一抗（1∶1 000），PTEN 一抗（1∶4 000），p-AKT（1∶2 000）進(jìn)行4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h 后，曝光顯影，得到蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 病毒感染 將肝癌細(xì)胞內(nèi)AR 表達(dá)較高的Hep3B 細(xì)胞作為AR 慢病毒干擾細(xì)胞株。Hep3B 細(xì)胞傳代于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，待細(xì)胞24 h 貼壁后加入慢病毒上清液進(jìn)行RNA 干擾。24 h 后更換新鮮培養(yǎng)基，48 h 后熒光顯微鏡下觀察GFP 表達(dá)效率。將加入的不同質(zhì)粒的病毒上清液細(xì)胞分別命名為Hep3B-shAR1、Hep3B-shAR2、Hep3B-shAR3。Hep3B細(xì)胞提取RNA 和蛋白進(jìn)行后續(xù)分析，得到AR mRNA 和蛋白表達(dá)結(jié)果，同時(shí)鑒定AR 干擾后PTEN的蛋白表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 6.0 進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AR 慢病毒干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及測(cè)序鑒定 慢病毒載體pLKO.1GFP 經(jīng)過酶切的片段在DNA 電泳中的條帶大小為8 kb（圖1A）。經(jīng)過連接酶連接后的3 條AR shRNA 干擾質(zhì)粒和空白對(duì)照重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化后得到陽性菌，經(jīng)質(zhì)粒抽提后電泳結(jié)果如圖1B 所示，4 個(gè)重組質(zhì)粒條帶大小正確，送公司測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示3 個(gè)AR shRNA 慢病毒載體構(gòu)建成功（圖1C）。

圖1 RA干擾序列連接pLKO.1載體并測(cè)序Fig.1 RA interference sequence was linked to pLKO.1 vector and sequenced

2.2 AR 重組慢病毒質(zhì)粒的包裝 慢病毒質(zhì)粒在293T細(xì)胞內(nèi)包裝，細(xì)胞加藥篩選3周后，經(jīng)單克隆形成的4 組293T 細(xì)胞在熒光顯微鏡下拍照，結(jié)果顯示強(qiáng)烈的綠色熒光（圖2）。

圖2 293T細(xì)胞病毒包裝（熒光和常光，×10）Fig.2 Virus packaging in 293T cells（fluorescent & white light，×10）

2.3 不同肝癌細(xì)胞內(nèi)AR 表達(dá) 利用RT-PCR 和Western blot 檢測(cè)肝細(xì)胞LO2，肝癌細(xì)胞HepG2、Hep3B、BEL-7402、Huh-7 內(nèi)AR 的基因和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果如圖3 所示，Hep3B 細(xì)胞內(nèi)的AR mRNA和蛋白水平表達(dá)高于其他肝細(xì)胞。選擇Hep3B 細(xì)胞進(jìn)行AR基因沉默實(shí)驗(yàn)。

圖3 5株不同肝細(xì)胞內(nèi)AR的表達(dá)情況Fig.3 AR expression in 5 hepatomas cells

2.4 AR 慢病毒感染Hep3B 細(xì)胞效果 將包裝好的慢病毒液體以相同滴度加入Hep3B 細(xì)胞，48 h 后在熒光顯微鏡下的綠色熒光蛋白表達(dá)如圖4A所示；Western blot 檢測(cè)3 個(gè)質(zhì)粒的干擾效率，如圖4B 所示，pLKO.1-AR-shRNA-F3R3 慢病毒的AR 蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯減弱。mRNA 表達(dá)效率如圖4C 所示，pLKO.1-AR-shRNA-F2R2和pLKO.1-ARshRNA-F3R3 的AR mRNA 與對(duì)照組相比表達(dá)降低，其中F3R3 的mRNA 干擾效率較對(duì)照組相比降低達(dá)50%。

圖4 AR干擾Hep3B細(xì)胞后AR的表達(dá)情況Fig.4 AR expression after lentivirus affect in Hep3B cells

2.5 AR 沉默對(duì)PTEN 信號(hào)及p-AKT 表達(dá)的影響Hep3B 細(xì)胞AR 基因敲減48 h 后，Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖5所示，AR 基因敲減后，PTEN 蛋白表達(dá)升高，p-AKT 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。提示AR對(duì)PTEN/ATK 信號(hào)通路的表達(dá)有影響，具有相關(guān)性。

圖5 Hep3B細(xì)胞AR干擾后PTEN和p-AKT蛋白表達(dá)Fig.5 PTEN and p-AKT protein expressions after AR interference in Hep3B cells

3 討論

AR 是與雄激素一起參與生命活動(dòng)調(diào)節(jié)代謝的DNA 轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)雄激素與AR 結(jié)合后調(diào)節(jié)下游靶基因活性，對(duì)肌肉、骨骼、第二性器官的發(fā)育和維持以及其他組織的發(fā)育具有重要作用。雄激素和AR信號(hào)軸的紊亂表達(dá)與多種腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路有關(guān)，如TGF-β、β-catenin、FOXA1 信號(hào)等［13-14］。近年利用RNAi 技術(shù)或shRNA 沉默靶基因表達(dá)的方式已經(jīng)成為研究腫瘤基因靶向治療的重要工具，而利用shRNA 干擾基因時(shí)的脫靶效應(yīng)會(huì)低于siRNA 轉(zhuǎn)染［15-16］。本研究成功構(gòu)建了3 條AR 慢病毒干擾質(zhì)粒。

肝癌是目前世界上致死率較高的癌癥之一，有研究發(fā)現(xiàn)男性患肝癌的比例比女性高2.5～11.1倍，而雄激素與AR 的作用在這一比例中發(fā)揮巨大影響［17-19］。盡管一些研究已經(jīng)揭示了雄激素/AR 信號(hào)軸與肝癌發(fā)病率間的相關(guān)性，但一些機(jī)制仍不明確。本研究利用5 個(gè)肝細(xì)胞系中AR 基因表達(dá)水平較高的Hep3B細(xì)胞為載體，通過RNA 干擾技術(shù)誘導(dǎo)AR 蛋白低表達(dá)，檢測(cè)了PTEN/AKT 信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中敲減AR 后，能激活PTEN 蛋白表達(dá)，并下調(diào)磷酸化AKT蛋白表達(dá)。PTEN 是一個(gè)抑癌基因，通常與PI3K/AKT 信號(hào)通路活性相關(guān)。有研究顯示在癌細(xì)胞狀態(tài)下PTEN 基因一般屬于缺失或突變狀態(tài)，而PI3K/AKT 信號(hào)與AR表達(dá)呈正相關(guān)。本研究降低了肝癌細(xì)胞Hep3B 內(nèi)AR 的表達(dá)，激活了PTEN 表達(dá)，說明AR 與細(xì)胞內(nèi)PTEN 的表達(dá)可能存在某種負(fù)反饋?zhàn)饔茫捎贏R 在細(xì)胞中的作用需要通過與雄激素結(jié)合到達(dá)細(xì)胞核才能發(fā)生，因此這種作用是否直接依賴AR 的表達(dá)目前尚不明確。課題組后續(xù)將通過雄激素與AR 干擾載體結(jié)合來進(jìn)一步確認(rèn)AR 與PTEN/AKT 信號(hào)通路間的調(diào)控機(jī)制，為闡明AR與PTEN/AKT信號(hào)通路的作用機(jī)理提供更詳細(xì)的依據(jù)。