孫文萍 趙得雄 王榀華 王生蘭 李 潔 康 燕 （青海紅十字醫(yī)院婦產(chǎn)科，青海 810000）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）屬育齡期女性內(nèi)分泌代謝性疾病，以雄激素過多和持續(xù)無排卵為主要特征，主要并發(fā)癥包括一系列代謝異常相關(guān)疾病，其中包括：2 型糖尿病、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、代謝綜合征、慢性炎癥等，已成為研究熱點(diǎn)［1］。PCOS 患者IR 占50%～60%，增加了患者患高血壓、脂質(zhì)代謝紊亂等風(fēng)險(xiǎn)［2］。且PCOS患者促炎癥因子水平升高，是一種低度慢性炎癥疾?。?］。硫氧還蛋白相互作用蛋白/NOD 樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（thioredoxininteracting protein/NOD-like receptor pyrin domaincontaining protein 3，TXNIP/NLRP3）信號(hào)通路參與抗氧化應(yīng)激和IR，是炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激重要信號(hào)通路之一，推測(cè)TXNIP/NLRP3 信號(hào)通路影響PCOS-IR大鼠卵巢慢性炎癥［4］?；诖?，建立PCOS-IR 大鼠模型，抑制TXNIP 觀察卵巢慢性炎癥情況，為臨床治療提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性SD 大鼠SPF 級(jí)均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（京）-2018-0102，使用許可證號(hào)：SYXK（京）-2019-0075，體 質(zhì) 量（220±10）g。所 有 大 鼠 均 在 溫 度（24.5±0.5）℃、濕度（50±5）%、光照/黑暗12 h/12 h環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)，本研究符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》，符合3R原則，并經(jīng)青海紅十字醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）（北京中科恒壹科技有限公司，CAS：53-43-0）；白藜蘆醇（resveratrol，RES）（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)：34092-100 mg）；siRNA NC、TXNIP siRNA（廣州銳博生物有限公司）；大鼠空腹胰島素（fasting insulin，F(xiàn)INS）ELISA 試劑盒（美國(guó)RD 公司，貨號(hào)：L-741）；IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA 試劑盒、一抗兔抗TXNIP、NLRP3、pro-半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase1，caspase-1）、GAPDH（英國(guó)Abcam 公司，貨號(hào)分別為：ab203360、ab197742、ab208348、ab188865、ab263899、ab179515、ab8245）；caspase-1（美國(guó)Biovision 公司，貨號(hào)：7524-100）；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）試劑盒（美國(guó)Acmec 公司，貨號(hào)：H69840）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）儀（賽默飛世爾公司，型號(hào)：PikoREAL）；血糖儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：Cholestech LDX）；蛋白凝膠成像儀（上海Tanton 公司，型號(hào)：4800）。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組 建立PCOS-IR模型大鼠，大鼠頸背部皮下注射溶于注射芝麻油0.2 ml 的DHEA 溶液（6 mg/100 g），1 次/d，連續(xù)20 d 后巴氏染色方法觀察大鼠陰道脫落細(xì)胞變化，若陰道上皮細(xì)胞持續(xù)10 d 為角化狀態(tài)的大鼠為誘導(dǎo)成功的PCOS模型大鼠；將成功PCOS 模型大鼠當(dāng)晚8 時(shí)禁食，次晨8 時(shí)眼眶靜脈取血做空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）和FINS 檢測(cè)，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR），計(jì)算方法：HOMA-IR=FBG（mmol/L）×FINS（mU/L）/22.5。 實(shí) 驗(yàn) 中 將HOMA-IR＞2.8 的PCOS 大鼠，作為成功的PCOS-IR 模型，進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。共建模成功大鼠32 只，隨機(jī)分為模型組、siRNA NC 組、TXNIP siRNA 組、RES 干預(yù)組，每組8 只，溶劑對(duì)照組大鼠頸背部皮下注射0.2 ml 芝麻油處理相同天數(shù)。

siRNA NC、TXNIP siRNA、RES 均溶于生理鹽水備用。siRNA NC 組、TXNIP siRNA 組分別頸背部皮下注射5 nmol siRNA NC、TXNIP siRNA，5 d/次；RES干預(yù)組頸背部皮下注射50 mg/kg RES［5］，溶劑對(duì)照組和模型組頸背部皮下注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)10 d。

1.2.2 血清中卵巢功能相關(guān)指標(biāo)以及血糖（FBG）、胰島素（FINS）相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后抽靜脈血，放射免疫試劑盒檢測(cè)血清中睪酮（testosterone，T）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、雌二醇（estradiol，E2）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）水平，血糖儀檢測(cè)血清中FBG 水平，ELISA 檢測(cè)血清中FINS 水平，并計(jì)算HOMA-IR、胰島素敏感指 數(shù)（insulin sensitivity index，ISI），ISI=1/FINS×FBG［6］。

1.2.3 HE 染色觀察卵巢卵泡發(fā)育情況 立即處死大鼠，卵巢分2 份，其中一份卵巢置于4%多聚甲醛中固定，一份置于-80 ℃冰箱保存待檢。4%多聚甲醛中固定的卵巢組織，經(jīng)過乙醇一系列脫水后石蠟包埋，切成6 μm 切片。經(jīng)蘇木精染色、伊紅復(fù)染后顯微鏡下觀察卵巢組織形態(tài)。

1.2.4 ELISA 檢測(cè)血清 中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平 取5 ml 靜脈血，室溫靜置2 h，1 000 r/min 離心10 min，取血清，采用大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒檢測(cè)血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 qRT-PCR 檢測(cè)卵巢組織中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平 -80 ℃取50 mg卵巢組織，RNA 提取試劑盒提取卵巢組織中總RNA，cDNA 第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，qRT-PCR 儀檢測(cè)組織中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平。引物序列如下：TXNIP F 5'-AAGCGTTGAGTAGTACAGATGAG-3'，R 5'-ATGGCGTGGCAAGAGTA-3'；NLRP3 F 5'-AGCCTCAGGGCACCAA-3'，R 5'-GGGATGAAGAACATAGTAAACA-3'；β-actin F 5'-GGAAATCGTGCGTGACATTAAAG-3'，R 5'-CGGCAGTGGCCATCTCTT-3'。反應(yīng) 體 系：10×Mix 10 μl、cDNA（50 ng/μl）1 μl、F/R（0.5/0.5）μl、ddH2O 8 μl。反應(yīng)條件：94 ℃60 s；95 ℃30 s；（TXNIP 56.8 ℃、NLRP3 61.3 ℃）60 s，40 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算TXNIP、NLRP3 mRNA 相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)卵巢組織TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1 蛋白水平 -80 ℃取30 mg卵巢組織，添加蛋白裂解液冰上裂解20 min，13 400 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清即為總蛋白，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白總濃度。每孔上樣30 ng，PAGE 膠分離蛋白質(zhì)，PVDF 轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉后，對(duì)應(yīng)加入一抗TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1、GAPDH，4 ℃孵育過夜；對(duì)應(yīng)加入二抗，室溫孵育1 h。DAB 顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.00 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TXNIP 對(duì)大鼠血清中卵巢功能相關(guān)指標(biāo)及FBG、FINS 的影響 與溶劑對(duì)照組相比，模型組、siRNA NC 組T、LH、E2、IGF-1、FBG、FINS、HOMA-IR水平升高，F(xiàn)SH 水平降低（P＜0.05）；與模型組、siRNA NC 組相比，TXNIP siRNA 組、RES 干預(yù)組T、LH、E2、IGF-1、FBG、FINS、HOMA-IR 水平降低，F(xiàn)SH水平升高（P＜0.05，見表1。

表1 5組血清中卵巢功能相關(guān)指標(biāo)以及血糖、胰島素相關(guān)指標(biāo)水平比較（xˉ±s，n=8）Tab.1 Comparison of ovarian function-related indexes and blood glucose and insulin-related indexes in serum of 5 groups（xˉ±s，n=8）

2.2 TXNIP 對(duì)大鼠卵巢發(fā)育情況的影響 溶劑對(duì)照組存在不同發(fā)育階段的健康卵泡和黃體；模型組和siRNA NC 組卵泡腔變大、出現(xiàn)囊腫現(xiàn)象，顆粒細(xì)胞層減少；TXNIP siRNA 組和RES干預(yù)組出現(xiàn)黃體，卵泡腔變小，顆粒層增厚。見圖1。

圖1 5組大鼠卵巢形態(tài)情況（×100）Fig.1 Morphology of ovary in 5 groups（×100）

2.3 TXNIP 對(duì)大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平的影響 與溶劑對(duì)照組相比，模型組、siRNA NC 組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.05）；與模型組、siRNA NC 組相比，TXNIP siRNA 組、RES 干預(yù)組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平降低（P＜0.05，表2）。

表2 5 組血清中IL-6、IL-1β、TNF-α 水平比較（±s，ng/ml，n=8）Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in 5 groups（±s，ng/ml，n=8）

Note：Compared with solvent control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with siRNA NC group，3）P＜0.05.

Groups Solvent control Model siRNA NC TXNIP siRNA RES intervention F P IL-6 1.96±0.35 3.06±0.381）3.02±0.421）2.39±0.352）3）2.31±0.312）3）13.783 0.000 IL-1β 0.22±0.06 0.43±0.051）0.44±0.061）0.31±0.042）3）0.34±0.052）3）23.971 0.000 TNF-α 254.36±34.48 516.42±61.521）532.14±56.821）315.15±34.582）3）289.15±36.142）3）65.388 0.000

2.4 TXNIP 對(duì)大鼠TXNIP、NLRP3 mRNA 水平的影響 與溶劑對(duì)照組相比，模型組、siRNA NC 組卵巢組織中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平升高（P＜0.05）；與模型組、siRNA NC 組相比，TXNIP siRNA 組、RES干預(yù)組卵巢組織中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平降低（P＜0.05，表3）。

表3 5 組卵巢組織中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of TXNIP and NLRP3 mRNA levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

表3 5 組卵巢組織中TXNIP、NLRP3 mRNA 水平比較（±s，n=8）Tab.3 Comparison of TXNIP and NLRP3 mRNA levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

Note：Compared with solvent control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with siRNA NC group，3）P＜0.05.

Groups Solvent control Model siRNA NC TXNIP siRNA RES intervention F P TXNIP 1.01±0.16 2.75±0.511）2.79±0.381）1.42±0.252）3）1.96±0.312）3）42.530 0.000 NLRP3 0.99±0.09 3.48±0.391）3.57±0.411）2.45±0.242）3）1.86±0.342）3）95.573 0.000

2.5 TXNIP 對(duì)大鼠TXNIP、NLRP3、caspase-1、procaspase-1 蛋白水平的影響 與溶劑對(duì)照組相比，模型組、siRNA NC 組卵巢組織中TXNIP、NLRP3、procaspase-1/caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組、siRNA NC 組相比，TXNIP siRNA 組、RES 干預(yù)組卵巢組織中TXNIP、NLRP3、pro-caspase-1/caspase-1蛋白水平降低（P＜0.05，圖2、表4）。

圖2 5 組大鼠卵巢組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1、procaspase-1蛋白表達(dá)情況Fig.2 TXNIP，NLRP3，caspase-1，pro-caspase-1 protein expressions in ovarian tissues of rats in 5 groups

表4 5 組卵巢組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1蛋白水平比較（±s，n=8）Tab.4 Comparison of TXNIP，NLRP3，caspase-1，procaspase-1 protein levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

表4 5 組卵巢組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1、pro-caspase-1蛋白水平比較（±s，n=8）Tab.4 Comparison of TXNIP，NLRP3，caspase-1，procaspase-1 protein levels in ovarian tissues of 5 groups（±s，n=8）

Note：Compared with solvent control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with siRNA NC group，3）P＜0.05.

Groups Solvent control Model siRNA NC TXNIP siRNA RES intervention F P TXNIP 0.23±0.03 0.76±0.081）0.78±0.081）0.46±0.052）3）0.39±0.042）3）129.056 0.000 NLRP3 0.09±0.01 0.68±0.071）0.72±0.071）0.38±0.042）3）0.16±0.022）3）281.277 0.000 caspase-1 0.69±0.08 0.72±0.10 0.70±0.08 0.65±0.08 0.73±0.09 1.040 0.400 pro-caspase-1/caspase-1 0.32±0.06 0.83±0.081）0.79±0.061）0.46±0.052）3）0.25±0.032）3）167.647 0.000

3 討論

IR 是指骨骼、脂肪、肝等對(duì)胰島素的敏感性下降，表現(xiàn)為對(duì)葡萄糖的攝取和利用障礙，機(jī)體代償性產(chǎn)生更多胰島素用于維持血糖水平，但隨著β 細(xì)胞功能減弱，不能產(chǎn)生更多的胰島素，增強(qiáng)胰島素敏感性時(shí)，會(huì)出現(xiàn)糖耐量降低現(xiàn)象［7］。在PCOS 中，IR 時(shí)體內(nèi)出現(xiàn)過多的葡萄糖、胰島素和游離脂肪酸等在體內(nèi)過多積累，胰島素與其特異性受體結(jié)合后，造成受體結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，導(dǎo)致胰島素功能逐漸喪失，出現(xiàn)高糖狀態(tài)［8］。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子是IR 的始動(dòng)因素，炎癥因子可作用于胰島素信號(hào)通路的特定位點(diǎn)，從而影響信號(hào)傳導(dǎo)［9］；在長(zhǎng)期的慢性炎癥反應(yīng)過程中，各種炎癥因子一方面可引起β 細(xì)胞功能衰退及IR，另一方面不同炎癥因子通過協(xié)同作用干擾機(jī)體正常的葡萄糖代謝平衡進(jìn)而影響血糖水平［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，與溶劑對(duì)照組相比，模型組T、LH、E2、IGF-1、FBG、FINS、HOMA-IR水平升高，F(xiàn)SH 水平降低，提示PCOS-IR 造成卵巢功能障礙、處于高糖狀態(tài)且發(fā)生IR。

RES 屬于一種天然的抗炎劑，在葡萄、花生、虎杖、桑葚等植物中存在，屬活性氧自由基強(qiáng)力清除劑，可抑制TXNIP 活性和表達(dá)，與si-TXNIP 有類似影響TXNIP 功能［11］。在脂多糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞中，RES 能夠明顯抑制TXNIP/NLRP3 信號(hào)通路從而抑制炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)從而影響炎癥損傷［12］。本 研 究 以RES 和TXNIP siRNA 分 別 處 理PCOS-IR 模型，相互驗(yàn)證TXNIP 功能，添加RES 或TXNIP siRNA 后卵巢功能相關(guān)激素水平得以緩解、血糖水平降低、IR指標(biāo)緩解。

TXNIP 是硫氧還蛋白的內(nèi)源性抑制蛋白，可直接結(jié)合減少硫氧還蛋白起催化作用的活性中心并且抑制其表達(dá)和活性［13］；可通過相互結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)活性氧化物的堆積進(jìn)而誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞的損傷及凋亡［14］。NLRP3 炎癥小體可觸發(fā)炎癥反應(yīng)過程，在宿主對(duì)抗病原體、自身免疫性疾病、代謝性疾病等過程中研究廣泛［15］。炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致IR 的主要分子機(jī)制，NLRP3 通過ASC 募集caspase-1 前體，形成復(fù)合物，活化的caspase-1 促進(jìn)多種炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α 等的分泌，從而引起胰島素信號(hào)通路受阻，如PI3K 等信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)而誘發(fā)IR［16］。IL-1β 作為促細(xì)胞炎癥因子，可調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞因子的早期極化及與其他因子協(xié)同作用調(diào)節(jié)Th17 細(xì)胞因子的產(chǎn)生，可介導(dǎo)胰島β 細(xì)胞凋亡或激活NF-κB 過程，進(jìn)而促進(jìn)炎癥因子釋放誘導(dǎo)IR 過程［17］。IL-6主要由脂肪細(xì)胞表達(dá)，而PCOS慢性炎癥的機(jī)制之一是脂肪細(xì)胞的肥大，脂肪細(xì)胞肥大會(huì)促進(jìn)基質(zhì)血管壓迫組織低灌注而缺氧，缺氧調(diào)控炎癥反應(yīng)關(guān)鍵基因激活，進(jìn)而釋放更多的炎癥介質(zhì)，參與PCOS-IR 過程［18］。TNF-α 主要由分泌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，參與IR 和刺激脂肪分解過程［19］。TXNIP通過氧化應(yīng)激等過程從硫氧還蛋白中解離出來，可直接結(jié)合并激活NLRP3，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1β 的產(chǎn)生［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，與溶劑對(duì)照組相比，模型組卵巢組織中TXNIP、NLRP3 mRNA和蛋白水平、血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高，提示PCOS-IR 卵巢組織中處于慢性炎癥狀態(tài)，可抑制TXNIP 與硫氧還蛋白的結(jié)合，從而游離出TXNIP，TXNIP 直接結(jié)合并激活NLRP3，通過促進(jìn)內(nèi)分泌或旁分泌等多種分泌途徑促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α 的分泌，IL-6、TNF-α 直接參與IR過程，IL-1β介導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡或激活NF-κB過程促進(jìn)IL-6、TNF-α 釋放誘導(dǎo)IR 過程。而抑制TXNIP 表達(dá)后可緩解上述過程，從而減輕卵巢功能相關(guān)激素、血糖、IR 相關(guān)激素表達(dá)，從而達(dá)到緩解疾病的目的，且RES與TXNIP siRNA有類似功效。

綜上所述，抑制TXNIP/NLRP3 信號(hào)通路可緩解PCOS-IR大鼠卵巢慢性炎癥，從而緩解疾病。