唐華英，羅欣錦，張?jiān)埔?，楊睿睿，葉廣彬，王長(zhǎng)麗

（右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000）

0 引 言

乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）胞外多糖（expolysaccharides, EPS）是由乳酸菌在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中發(fā)酵產(chǎn)生并分泌到細(xì)胞外的黏液或莢膜多糖，是常滲入培養(yǎng)基中的一種糖類化合物[1]。根據(jù)合成位點(diǎn)和模式的不同，乳酸菌EPS 可以分為同型多糖和異型多糖[2]。

乳酸菌是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物，EPS 作為乳酸菌重要的次生代謝產(chǎn)物，具有很高的研究和利用價(jià)值。與其他微生物多糖相比，乳酸菌EPS 不僅具有改善腸道微生態(tài)、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等生物活性[3-5]。還具有良好的流變學(xué)特性，能改善發(fā)酵乳的風(fēng)味、質(zhì)地和性質(zhì)，使產(chǎn)品增稠、乳化，質(zhì)地細(xì)膩均勻，口感潤(rùn)滑[6]。產(chǎn)EPS 的乳酸菌主要有乳桿菌屬、鏈球菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬及雙歧桿菌屬等[7]。不同乳酸菌菌株產(chǎn)生的EPS 量不同，其形成的多糖種類也有差別。培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基成分及相關(guān)酶類都可以影響乳酸菌EPS 的產(chǎn)量[8]。因此，本研究以能夠產(chǎn)EPS 的一株乳酸菌為出發(fā)菌株，利用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化菌株產(chǎn)EPS 條件，并探究該EPS 的乳化性和黏度穩(wěn)定性。本研究成果可以為乳酸菌EPS 食品添加劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

假腸膜明串珠菌GX-3 分離自東北自然發(fā)酵酸菜樣品。

1.1.2 儀器與設(shè)備

LS-B50L 立式壓力蒸汽滅菌鍋，上?；h醫(yī)療有限公司；DNP-9082 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-B11-420-S 恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；UVmini-1240 紫外可見分光光度計(jì)，島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司；TGL-16G 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FE20 pH 計(jì)，梅特勒-托利多（上海）有限公司；PL1501 電子分析天平，梅特勒-托利多公司；LVDV-C 旋轉(zhuǎn)數(shù)顯黏度計(jì)，美國(guó)Brookfield博勒飛公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS 培養(yǎng)基（w/v）：葡萄糖2%、胰蛋白胨1%、牛肉膏1%，酵母提取物0.5%，K2HPO40.2%，無(wú)水乙酸鈉0.5%，檸檬酸銨0.2%，MgSO4·7H2O 0.058%，MnSO4·H2O 0.025%，吐溫80 1 mL，用于供試菌活化及種子液制備；產(chǎn)糖培養(yǎng)基：用蔗糖代替MRS 培養(yǎng)基中的葡萄糖。

1.2 方法

1.2.1 制備種子液

取50 μL 甘油管保存的菌液接種于30 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)12 h，為種子液。

1.2.2 EPS 的提取

將種子液以2%（體積比）的接種量接種于100 mL產(chǎn)糖培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)48 h 后，將發(fā)酵液在4 ℃4 000 g 條件下離心60 min，取上清[9]。上清液加入100 mL 10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）三氯乙酸，4 ℃條件下攪拌4 h 后，4 ℃12 000 g 離心40 min 取出沉淀。收集上清液加入3 倍體積的預(yù)冷95%乙醇，4 ℃過(guò)夜沉淀后，4 ℃12 000 g 離心40 min 收集EPS 沉淀，并溶于20 mL 超純水中，裝入透析袋（截留分子量14 000 u）中，4 ℃透析2 d，每8 h 換一次水。

1.2.3 EPS 的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定提取的EPS，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

1.2.4 單因素法優(yōu)化產(chǎn)糖條件

通過(guò)單因素試驗(yàn)，調(diào)整產(chǎn)糖培養(yǎng)基中的蔗糖濃度、胰蛋白胨濃度、牛肉膏濃度，酵母提取物濃度，K2HPO4濃度，無(wú)水乙酸鈉濃度，檸檬酸銨濃度、初始pH 值和培養(yǎng)溫度，考察這9 個(gè)因素對(duì)產(chǎn)糖的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)法優(yōu)化產(chǎn)糖條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇4 個(gè)對(duì)菌株產(chǎn)糖起顯著影響的因素，進(jìn)行4 因素3 水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化產(chǎn)糖發(fā)酵條件。

1.2.6 產(chǎn)糖發(fā)酵進(jìn)程測(cè)定

將種子液以2%（體積比）的接種量分別接種于初始MRS 培養(yǎng)基和優(yōu)化后的MRS 培養(yǎng)基中，30 ℃靜止培養(yǎng)60 h，每個(gè)6 h 取樣，測(cè)定EPS 含量。

1.2.7 EPS 乳化能力測(cè)定

分別取2.5 mL 汽油、柴油、煤油、棕櫚油、葵花油和大豆油與2.5 mL 50 mg/mL 的EPS 溶液振蕩混勻，于4 ℃條件下靜止放置12 h 后，利用游標(biāo)卡尺測(cè)定乳化層的高度，計(jì)算乳化能力。

1.2.8 EPS 的黏度穩(wěn)定性

取2.5 g EPS 溶于50 mL 去離子水或緩沖液（0.1 mol/L）中，選擇合適的轉(zhuǎn)子及轉(zhuǎn)速，利用旋轉(zhuǎn)數(shù)顯黏度計(jì)測(cè)定不同條件下EPS 的黏度。主要考察不同溫度（4、20、30、40 ℃）和不同pH 值（3、6、9）對(duì)EPS 溶液黏度的影響。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)處理均設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的顯著水平設(shè)定為0.05，極顯著水平設(shè)定為0.01。利用JMP（Version 9.0.2，SAS，Inc）軟件進(jìn)行方差分析及多重比較，并用Sigmaplot（Version 10.0，Systat Software，Inc）軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)分析

2.1.1 底物濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS 的影響

當(dāng)蔗糖濃度如圖1（a）為5%時(shí)，EPS 含量最高（19.17 ± 1.23 g/L）。研究表明，蔗糖不僅作為底物被乳酸菌利用產(chǎn)EPS，同時(shí)作為誘導(dǎo)劑提高葡聚糖蔗糖酶的活性，進(jìn)而提高催化合成效率[11]。然而，高濃度的蔗糖并不能促進(jìn)EPS 的產(chǎn)生，是因?yàn)镋PS具有高黏度的特性，使得菌株表面被覆蓋，菌株活性降低，葡聚糖蔗糖酶不能有效的釋放至培養(yǎng)基中。因此，適宜濃度的蔗糖是菌株高產(chǎn)EPS 的重要前提。

當(dāng)胰蛋白胨濃度如圖1（b）、牛肉膏濃度圖1（c）和酵母提取物圖1（d）濃度分別為1.2%、0.8%和0.6%時(shí)，EPS 的含量分別為20.56±1.38 g/L、21.79±1.02 g/L和25.17±2.04 g/L，其中酵母提取物可以顯著提高EPS 的含量。而Xing 等優(yōu)化Leu. mesenteroides DRP105產(chǎn)EPS，發(fā)現(xiàn)，胰蛋白胨對(duì)菌株產(chǎn)EPS 影響顯著[12]。產(chǎn)生這樣的差異，可能是因?yàn)榫陙?lái)源和生長(zhǎng)特性不同所致。

圖1 底物濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS 的影響

2.1.2 無(wú)機(jī)鹽離子濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS 的影響

當(dāng)K2HPO4濃度圖2（a）、無(wú)水乙酸鈉濃度圖2（b）和檸檬酸銨濃度圖2（c）分別為0.25%、0.4%和0.25%時(shí)，EPS 的含量分別為26.54 ± 1.51 g/L、30.42 ± 2.71 g/L和32.72 ± 1.24 g/L，其中無(wú)水乙酸鈉可以顯著提高EPS 的產(chǎn)量。雖然這3 個(gè)因素在原始培養(yǎng)基中的含量不多，但不同的菌株對(duì)生長(zhǎng)條件要求不同，使得發(fā)酵產(chǎn)EPS 的條件存在差異。

圖2 無(wú)機(jī)鹽離子濃度對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS 的影響

2.1.3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS 的影響

隨著pH 值圖3（a）的升高，EPS 的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在強(qiáng)酸性環(huán)境下EPS 的含量低于堿性環(huán)境，在pH 值為6 時(shí)，EPS 含量最高，為38.87 ±2.92 g/L。研究表明，葡聚糖蔗糖酶一般在中性或弱酸性的環(huán)境下活性較高，可以催化蔗糖生成EPS[13]。因此pH 值對(duì)菌株產(chǎn)EPS 具有重要的影響。

當(dāng)溫度圖3（b）為30 ℃時(shí)，EPS 的含量最高，為40.27±1.26 g/L。一般而言，乳酸菌的最適生長(zhǎng)溫度在30～37 ℃之間，較高的溫度會(huì)使菌株分泌的葡聚糖蔗糖酶失去活性，進(jìn)而影響催化活性[14]。

圖3 培養(yǎng)條件對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)EPS 的影響

2.1.4 不同因素對(duì)菌株產(chǎn)EPS 影響的多重比較分析

培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件共9 個(gè)因素對(duì)EPS 產(chǎn)量的影響結(jié)果如表1 所示，通過(guò)優(yōu)化，最終EPS 的產(chǎn)量達(dá)到40.27±1.26 g/L，是未優(yōu)化前的3.02 倍。其中蔗糖濃度、酵母提取物濃度、無(wú)水乙酸鈉濃度以及初始pH值對(duì)EPS 的產(chǎn)量起到顯著影響，分別使EPS 產(chǎn)量提高了43.92%、15.51%、14.62%和18.80%。因此在后續(xù)的正交試驗(yàn)中，選擇這4 個(gè)因素進(jìn)行研究。

表1 不同因素對(duì)Leu. pseudomesenteroides GX-3 產(chǎn)EPS 影響的多重比較結(jié)果

2.2 正交試驗(yàn)分析

本研究在確定最佳單因素條件的前提下，采取L9(34)4 因素3 水平正交試驗(yàn)，考察蔗糖濃度（A）、酵母提取物濃度（B）、無(wú)水乙酸鈉濃度（C）和初始pH 值對(duì)菌株產(chǎn)EPS 的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2 所示，結(jié)果如表3所示。

表2 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果分析

由極差分析可知，各因素對(duì)菌株產(chǎn)EPS 的影響大小順序依次為無(wú)水乙酸鈉濃度＞蔗糖濃度＞酵母提取物濃度＞初始pH 值，獲得最佳培養(yǎng)條件為A3B1C3D2，即蔗糖濃度為7%、酵母提取物濃度為0.6%、無(wú)水乙酸鈉濃度為0.6%、初始pH 值為7 時(shí)，EPS 含量最高，為50.76 g/L，比優(yōu)化前提高了3.81 倍。通過(guò)3 組平行驗(yàn)證試驗(yàn)，菌株產(chǎn)糖能力與正交試驗(yàn)結(jié)果無(wú)顯著差異（P＞0.05）。Du 等對(duì)Leu. mesenteroides TDS2-19 產(chǎn)EPS條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果同樣表明蔗糖、無(wú)水乙酸鈉和初始pH 值顯著影響菌株產(chǎn)EPS[15]。先前的研究中，我們利用響應(yīng)面法優(yōu)化Leu. citreumTD1 產(chǎn)EPS，優(yōu)化后EPS 含量達(dá)到57.58 ± 2.04 g/L，是單因素試驗(yàn)后（32.71 g/L）的1.76 倍[16]，高于本研究結(jié)果。因此，在后續(xù)的研究中，我們進(jìn)一步利用響應(yīng)面優(yōu)化GX-3 EPS產(chǎn)量。

2.3 菌株產(chǎn)EPS 發(fā)酵進(jìn)程分析

菌株GX-3 在最適條件下的生長(zhǎng)情況和產(chǎn)糖進(jìn)程如圖4 所示，隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行，菌株的OD600值與EPS 產(chǎn)量正向耦合，呈現(xiàn)先急速增長(zhǎng)后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在發(fā)酵30 h 時(shí)，EPS 的含量最高，此時(shí)菌體生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，在后續(xù)的EPS 提取工藝中，菌株培養(yǎng)至30 h 最適。

圖4 Leu. pseudomesenteroides GX-3 發(fā)酵體系中OD600 值及EPS 含量動(dòng)態(tài)變化

2.4 GX-3 EPS 乳化性分析

GX-3 EPS 對(duì)油類和烴類化合物的乳化性能力如表4 所示，隨著時(shí)間增加，GX-3 EPS 的乳化作用增強(qiáng)，在24 h 時(shí)，乳化率從大到小分別為：大豆油＞葵花油＞柴油＞柴油＞棕櫚油＞煤油＞汽油，其中對(duì)大豆油和葵花油的乳化率均高于70%，分別為（79.35±1.67）%和（74.29±3.71）%。Meneghine 等研究Sphingomonas sp.EPS 的乳化性發(fā)現(xiàn)，該EPS 對(duì)汽油、煤油和食用油的乳化率達(dá)到70%以上[17]。

表4 GX-3 EPS 對(duì)有油類和烴類化合物的乳化能力

2.5 GX-3 EPS 黏度穩(wěn)定性分析

EPS 的流變學(xué)特性顯著影響發(fā)酵食品的質(zhì)地和口感，優(yōu)質(zhì)的乳制品往往與EPS 的黏度密切相關(guān)。溫度和pH 值對(duì)GX-3 EPS 黏度的影響如圖5 所示，該EPS 展現(xiàn)出剪切稀釋特性，隨著剪切的增加，黏度下降，是一種假塑性流體。GX-3 EPS 黏度隨著溫度的升高而下降，在中性環(huán)境下黏度較高，其次是堿性環(huán)境、酸性環(huán)境。此結(jié)果與Lactobacillus plantarum HM47 EPS的黏度特異性相一致[18]。因此可以看出，GX-3 EPS 黏度受環(huán)境的溫度和pH 值影響較大，可能是因?yàn)椴煌沫h(huán)境使得EPS 的分子量和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而應(yīng)其物理性質(zhì)[19]。此外，從上可知，GX-3 EPS 溶液具有非牛頓流體的特征。因此，可以通過(guò)改變環(huán)境條件來(lái)改善EPS 生物制品的特性。

圖5 GX-3 EPS 黏度穩(wěn)定性分析

3 結(jié) 論

乳酸菌產(chǎn)EPS 是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選得到蔗糖濃度、酵母提取物濃度、無(wú)水乙酸鈉濃度以及初始pH 值對(duì)菌株GX-3 產(chǎn)EPS 起到顯著影響。正交試驗(yàn)優(yōu)化后，當(dāng)蔗糖濃度為7%、酵母提取物濃度為0.6%、無(wú)水乙酸鈉濃度為0.6%、初始pH 值為7 時(shí)，EPS 含量最高，為50.76 g/L，比優(yōu)化前提高了3.81 倍。此外，GX-3 EPS 展現(xiàn)出良好的乳化特性和黏度穩(wěn)定性，具有開發(fā)成食品添加劑及增稠劑的潛質(zhì)。