李琪琪，李天歌，焦穎澤，盧雪嬌，毛學(xué)英

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，鄭州 450002）

0 引 言

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，該疾病已成為全球性公共衛(wèi)生問題。目前2 型糖尿病發(fā)病率逐年增高，國際糖尿病聯(lián)盟調(diào)查顯示2021 年全球有5.37 億人患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2045 年全球糖尿病患病人數(shù)將達(dá)到7.83 億。其中，2021 年中國的成人糖尿病患者數(shù)量高達(dá)1.4 億，位居世界第一位[1]。而2 型糖尿病是最常見的糖尿病類型，約占所有糖尿病病例的90%。2 型糖尿病以多種病理缺陷為特征，包括胰島素抵抗和進(jìn)行性胰腺β細(xì)胞功能障礙，還會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥如糖尿病足病、腎病、視網(wǎng)膜病變、心腦血管疾病等。因此，尋求預(yù)防和緩解2 型糖尿病的有效干預(yù)措施已引起越來越廣泛的關(guān)注。

目前2 型糖尿病的治療以西藥為主，主要包括磺脲類、雙胍類、噻唑烷二酮類、二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-IV，DPP-Ⅳ）抑制劑等[2]。DPP-Ⅳ抑制劑可與DPP-Ⅳ酶活性部位的205 位和206 位谷氨酸形成鹽橋[3]，從而降低DPP-Ⅳ酶的催化活性，提高胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依賴性胰島素分泌多肽（glucosedependent insulinotropic peptide，GIP）等腸促胰島素的濃度，進(jìn)而通過抑制胰島α細(xì)胞分泌胰高血糖素、促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素、改善胰島β細(xì)胞存活、再生和增殖等發(fā)揮降低血糖、保護(hù)胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞功能等作用[4]。此外，由于腸促胰島素的釋放依賴于血液中的葡萄糖水平，在低于正常空腹血糖水平的狀態(tài)下，腸促胰島素水平并不會(huì)顯著升高，因此DPP-IV抑制劑可以有效減少低血糖的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5-7]。DPP-Ⅳ抑制劑的有效性已經(jīng)經(jīng)過了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。如Liu 等證明了在16.7 mmol/L葡萄糖和10 nmol/L GLP-1 作用下，DPP-IV 抑制劑維格列?。?00 nmol/L）使INS-1 832/13 細(xì)胞中葡萄糖刺激的胰島素分泌（glucose stimulated insulin secretion ，GSIS）增加了22.0%[4]。Mu 等用DPP-IV 抑制劑去氟西格列汀治療胰島素分泌缺陷小鼠，可顯著增加離體胰島的胰島素含量，改善葡萄糖刺激的胰島素分泌[8]。在臨床環(huán)境中，DPP-IV 抑制劑阿格列汀單藥或與其他藥物聯(lián)合使用可以顯著改善2 型糖尿病患者的血糖控制[9]。但是臨床研究表明，這些化學(xué)合成的DPP-Ⅳ抑制劑會(huì)引起頭痛、眩暈、外周性水腫、肝功能異常等副作用[10]。因此，亟需尋找天然、無副作用的活性物質(zhì)作為化學(xué)合成DPP-Ⅳ抑制劑的替代物。

生物活性肽因其安全性高、副作用低、生物活性多樣化而受到人們的關(guān)注[11-12]。天然食物蛋白經(jīng)體外蛋白酶水解或體內(nèi)消化道酶水解后，會(huì)產(chǎn)生許多具有生理作用的活性肽，對人體發(fā)揮多種生理調(diào)節(jié)作用[13]。其中，來源于牛乳酪蛋白、牛乳乳清蛋白、牦牛乳、駱駝乳等的水解物和活性肽已被證明具有良好的DPPIV 抑制活性[14-18]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DPP-IV 抑制肽具有一些共同特點(diǎn)：（1）疏水性氨基酸含量較高；（2）序列中有脯氨酸或丙氨酸，并且優(yōu)先分布在N 端的第二位上，這是因?yàn)镈PP-IV 能優(yōu)先裂解氨基末端第二位上含有脯氨酸殘基或丙氨酸殘基的多肽。但是其兩側(cè)的氨基酸類型也會(huì)影響多肽對DPP-IV 的抑制活性；（3）氨基酸序列長度也會(huì)影響其活性，DPP-IV 抑制肽長度多為2-8 個(gè)氨基酸殘基[5-6,18-19]。牛乳酪蛋白糖巨肽是一種含有唾液酸的糖肽[20]，來源于κ-酪蛋白C-末端殘基106-169 區(qū)域，具有兩親性，富含疏水性的支鏈氨基酸（Leu、Val、Ile）。我們課題組前期研究發(fā)現(xiàn)酪蛋白糖巨肽酶解物及活性肽段在體內(nèi)和體外能夠通過調(diào)控胰島素信號緩解胰島素抵抗，從而進(jìn)一步改善2 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展[21-23]。然而，關(guān)于酪蛋白糖巨肽酶解物的DPP-IV 抑制活性及其DPP-IV 抑制肽的分離鑒定尚待研究。

因此，本研究以牛乳酪蛋白糖巨肽為原料酶解制備牛乳酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物（即酪蛋白糖肽），以其DPP-IV 抑制活性為指標(biāo)，篩選DPP-IV 抑制活性最高的酶解產(chǎn)物，并對其進(jìn)行分離鑒定，旨在為功能性乳配料的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳酪蛋白糖巨肽，丹麥Arla 公司；風(fēng)味蛋白酶，丹麥諾維信公司。

氫氧化鈉（分析純）、鹽酸（分析純）、三氯乙酸（TCA）（分析純）、Tris 粉末（分析純），北京化工廠；DPP-Ⅳ、Gly-Pro-PNA，美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS124S 電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；DK-8D 電熱恒溫水槽，上海一恒科技有限公司；JJ-1 精密定時(shí)自動(dòng)攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FE28 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SC-3612 低速離心機(jī)，安徽科大中佳；DRP-9082 電恒溫培養(yǎng)箱，上海森信；iMark 酶標(biāo)儀，Bio-Rad Laboratories,Inc.；LGJ-72 冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技儀器有限公司；BSZ-100 自動(dòng)收集器，蘇州江東精密儀器有限公司；HL-2S 恒流泵，上海嘉鵬科技有限公司；UV-2600 紫外可見分光光度計(jì)，日本島津有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛乳酪蛋白糖肽的制備

參考Li 等[24]的方法利用風(fēng)味蛋白酶水解牛乳酪蛋白糖巨肽。具體為，稱取一定量的牛乳酪蛋白糖巨肽，按底物濃度5%（w/v）加水，在室溫下充分溶解。將溫度和pH 值調(diào)節(jié)至蛋白酶的最適溫度和最適pH值，按酶與底物的比例為5%（w/w）加入蛋白酶進(jìn)行水解，水解在恒溫水浴鍋中進(jìn)行，在水解過程中維持體系pH 不變。分別于水解后0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5 h取樣，85 ℃滅酶20 min 終止反應(yīng)，4 000 r/min 離心20 min 取上清液，凍干后待用。

1.3.2 牛乳酪蛋白糖肽DPP-Ⅳ抑制活性測定

參考Song 等[25]的方法。將凍干樣品用100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）配制成10 mg/mL 溶液。取20 μL樣品溶液和100 μL 底物Gly-Pro-pNA 溶液于96 孔板上，在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育10 min，再加入30 μL DPP-Ⅳ溶液，在37 ℃孵育40 min，使酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光值。同時(shí)設(shè)置空白對照組，陰性對照組以及陽性對照組。

1.3.3 牛乳酪蛋白糖肽水解度測定

參考Ma 等[26]的方法。吸取0.5 mL 已滅酶的樣品，冷卻后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，用質(zhì)量濃度為10 mg/mL的十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液定容，靜置。取0.125 mL 酶解液的SDS 溶液與1 mL磷酸鹽緩沖液（pH 8.2，0.2 mol/L）和1 mL 質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的三硝基苯磺酸溶液振蕩混合，于50 ℃避光水浴反應(yīng)60 min，反應(yīng)完畢后，用2 mL 0.1 mol/L HCl 溶液立即終止反應(yīng)。室溫放置30 min 后，于波長420 nm 處測定其吸光度。利用0～5.0×10-3mol/L L-亮氨酸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 牛乳酪蛋白糖肽氨基酸組成測定

使用氨基酸分析儀測定牛乳酪蛋白糖肽的氨基酸組成[27]。樣品前處理方法：準(zhǔn)確稱取10～20 mg 試樣于水解管中，加入10～15 mL 6 mol/L 鹽酸溶液和苯酚3～4 滴，放入冷凍劑中冷凍3～5 min，重復(fù)抽真空-充入氮?dú)? 次，在充氮?dú)鉅顟B(tài)下封口，放在110±1 ℃的水解爐內(nèi)水解22 h，冷卻至室溫，將水解液定容至50 mL。準(zhǔn)確吸取1.0 mL 濾液移入15 mL 試管內(nèi)，在40～50 ℃加熱環(huán)境下減壓蒸干。用1.0～2.0 mL pH 2.2 檸檬酸鈉緩沖溶液溶解樣品，過0.22 μm 濾膜上樣。

1.3.5 牛乳酪蛋白糖肽不同組分的分離

參考Harnedy 等[28]的方法，采用G-25 凝膠過濾層析對酪蛋白糖肽進(jìn)行分離。具體為，將溶脹好的Sephadex G-25 介質(zhì)填充到層析柱中，用去離子水進(jìn)行平衡。酪蛋白糖肽溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜除去雜質(zhì)，樣品進(jìn)樣量為1 mL，洗脫劑為去離子水，洗脫流速為1 mL/min，在220 nm 波長下進(jìn)行檢測。收集各洗脫峰，冷凍干燥。

1.3.6 牛乳酪蛋白糖肽的純化及氨基酸序列鑒定

通過RP-HPLC 對酪蛋白糖肽DPP-IV 抑制活性較高組分進(jìn)行純化，得到不同保留時(shí)間的樣品，測定其DPP-IV 抑制活性，再利用LC-ESI-MS/MS 對DPPIV 抑制活性最強(qiáng)的分離組分進(jìn)行分析，鑒定具有DPP-IV 抑制活性的牛乳酪蛋白糖肽的氨基酸序列。

RP-HPLC 條件：色譜柱：C18 柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：超純水；流量：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；檢測波長：220 nm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)至少重復(fù)3 次，取其平均值，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（x ± SD）表示。采用SPSS 19.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，當(dāng)P＜0.05 時(shí)認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物（酪蛋白糖肽）對DPP-Ⅳ的抑制作用

酪蛋白糖巨肽不同酶解時(shí)間酶解產(chǎn)物的水解度及其DPP-Ⅳ抑制率如圖1 所示。由圖1 可知，隨著水解時(shí)間的延長，酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物的水解度呈上升趨勢，在前30 min 水解時(shí)間內(nèi)變化最為明顯，水解60 min 時(shí)酶解產(chǎn)物的水解度上升至17.41±0.80%。此后水解度的增長較緩慢，水解5 h 后，酶解產(chǎn)物的水解度達(dá)到23.10±0.42%。Gao 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也展現(xiàn)出類似的趨勢，從0 h 到3 h，水解度隨水解時(shí)間的延長而增加，且在水解前30 min 水解度的變化幅度最大[29]。此外，為了篩選DPP-IV 抑制活性最高的酶解產(chǎn)物，測定了不同酶解時(shí)間酶解產(chǎn)物的DPP-Ⅳ抑制活性，如圖1 所示，相比于其他時(shí)間點(diǎn)的酶解產(chǎn)物，45 min時(shí)獲得的酶解產(chǎn)物對DPP-Ⅳ活性的抑制率最高，為54.55±3.65%。該結(jié)果的出現(xiàn)可能是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長，酶解45 min 時(shí)產(chǎn)生的DPP-IV 抑制肽進(jìn)一步被降解為更短的肽段或氨基酸而降低或失去了活性；與此同時(shí)，在后續(xù)的酶解過程中可能又產(chǎn)生了新的活性肽段。因此，該結(jié)果說明在本研究的水解條件下酶解時(shí)間為45 min 時(shí)水解物中含有更多具有DPP-IV 抑制活性的肽段或者此時(shí)酶解物中的肽段DPP-IV 抑制活性最強(qiáng)。已有報(bào)道也發(fā)現(xiàn)DPP-IV 抑制活性的最高點(diǎn)均出現(xiàn)在酶解過程中的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)而非酶解時(shí)間最長的樣品[29-31]。因此，本研究選擇水解45 min 時(shí)獲得的酶解產(chǎn)物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 酶解時(shí)間對酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物水解度及DPP-Ⅳ抑制率的影響

2.2 具有DPP-Ⅳ抑制活性的酪蛋白糖肽的氨基酸組成

具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物（命名為酪蛋白糖肽）的氨基酸組成如表1 所示。從表中可以看出，酪蛋白糖肽的谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）、脯氨酸（Pro）、異亮氨酸（Ile）的含量較高，分別為14.14%、11.53%、7.78%、7.62%。相比于酪蛋白糖巨肽，酪蛋白糖肽的天冬氨酸（Asp）和谷氨酸（Glu）含量明顯提高。文獻(xiàn)報(bào)道表明，具有較高含量的Ile 和Pro 等疏水性氨基酸是DPP-IV 抑制肽的共同特征之一[19]。

表1 酪蛋白糖巨肽及其具有DPP-Ⅳ抑制活性酶解產(chǎn)物的氨基酸組成

2.3 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽的分離純化

利用G-25 葡聚糖凝膠柱分離具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽，樣品吸光值如圖2（a）所示，測定分離組分26～42 號（F1 組分）和43～61 號（F2 組分）的DPP-Ⅳ抑制率，結(jié)果如圖2（b）所示，相比于未經(jīng)凝膠柱分離的樣品和F2 組分，F(xiàn)1 組分的DPP-Ⅳ抑制率明顯提高，達(dá)到63.27±3.24% 。因此選用F1 組分進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。據(jù)報(bào)道，活性肽的氨基酸序列長度會(huì)影響其DPP-IV 抑制活性[19]，在F1 組分中含量可能較高，而F2組分后于F1 組分流出，其中可能含有游離氨基酸。

圖2 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽的G-25分離組分及其DPP-Ⅳ抑制率

采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）對F1 組分進(jìn)行進(jìn)一步分離。F1 組分經(jīng)RP-HPLC 分離后得到的色譜圖，如圖3 所示。分離得到2 個(gè)峰，保留時(shí)間分別為3.33 min 和4.35 min。

圖3 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽分離組分F1 的RP-HPLC 色譜圖

2.4 具有DPP-Ⅳ抑制活性分離組分F1 的氨基酸序列

采用LC-ESI-MS/MS 對反向高效液相色譜分離組分F1 進(jìn)行氨基酸序列鑒定，通過一級和二級質(zhì)譜分析，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對及與其他文獻(xiàn)比較，得到了可能具有DPP-IV 抑制活性的肽段，序列信息見表2?；钚噪亩味壻|(zhì)譜圖如圖4 所示，質(zhì)荷比為685.88 的雙電荷離子的LC-MS/MS 譜圖與序列MAIPPKKNQDKT 匹配，質(zhì)荷比為402.98 的四電荷離子的LC-MS/MS 譜圖與序列PPKKNQDKTEIPTI匹配，質(zhì)荷比為655.83 的雙電荷離子的LC-MS/MS譜圖與序列SPEVIESPPEIN 匹配。這3 條肽段都含有Ala、Pro，且Pro 含量較高，而Pro 已被報(bào)道與DPP-Ⅳ抑制活性有關(guān)。

表2 具有DPP-Ⅳ抑制活性酪蛋白糖肽的活性肽段信息

3 結(jié) 論

本研究收集不同時(shí)間的酶解產(chǎn)物，通過測定酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物的DPP-IV 抑制率，篩選出DPPIV 抑制活性最高的酶解物（酪蛋白糖肽），抑制率為54.55±3.65%，酪蛋白糖肽中Glu、Thr、Pro、Ile 氨基酸含量較高。具有DPP-IV 抑制活性的酪蛋白糖肽經(jīng)Sephadex G-25 分離獲得兩個(gè)組分，其中F1 組分具有較強(qiáng)的DPP-IV 抑制活性，抑制率為63.27±3.24%。采用RP-HPLC 對F1 組分進(jìn)一步分離并通過LC-ESIMS/MS 進(jìn)行氨基酸序列鑒定，得到DPP-Ⅳ抑制肽MAIPPKKNQDKT、PPKKNQDKTEIPTI、SPEVIESPPE IN。本研究主要對酪蛋白糖肽的DPP-IV 抑制活性進(jìn)行了體外評價(jià)，后續(xù)將采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

由于糖尿病的發(fā)病率逐年增加及人們對健康需求的不斷提高，天然食物蛋白源DPP-Ⅳ抑制肽類降血糖功能食品的研發(fā)逐漸受到關(guān)注與重視。本研究明確了酪蛋白糖巨肽酶解產(chǎn)物的DPP-Ⅳ抑制活性，并對其中的DPP-Ⅳ抑制肽進(jìn)行了分離和鑒定，為酪蛋白糖肽在降糖功能食品的開發(fā)應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。