李理，朱珺，林國棟，陳蘇，陳麗娥，陳作國

（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司浙江省食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018）

0 引 言

硒是人體必需的14 種微量元素之一，動(dòng)物和人體內(nèi)不能合成，必須通過飲食獲得。1957 年首次認(rèn)識(shí)到硒對(duì)營養(yǎng)性肝壞死的保護(hù)作用后[1]，其抗氧化、抗癌、保護(hù)心臟、提高機(jī)體免疫力、防治近視以及白內(nèi)障、解毒、延緩衰老、增強(qiáng)生殖功能等多種生物活性和藥理作用被相繼報(bào)道，被譽(yù)為“生命火種”、“心臟的守護(hù)神”和“抗癌之王”[2-3]。我國約2/3 的地區(qū)近7 億人口處于缺硒的狀態(tài)[4]。與我國硒攝取的實(shí)際狀況相結(jié)合，1988 年中國營養(yǎng)家學(xué)會(huì)將微量元素硒列入我們每日必須攝入的15 種膳食營養(yǎng)素之中。為了保證人體日均生理補(bǔ)硒的安全性，我國對(duì)富硒食品中硒的限量也有嚴(yán)格的要求，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB14880-2012 中對(duì)大米、小麥粉、面包、餅干、含乳飲料中硒的使用量進(jìn)行了限制，其中含乳飲料中硒的使用量為50～200 μg/kg。

大量研究表明，硒元素在人體內(nèi)的吸收、代謝以及生物功效的發(fā)揮，與其形態(tài)有著緊密的聯(lián)系[5]。一般而言，無機(jī)硒的水溶性高，毒性最大，生物利用率低；有機(jī)硒毒性較無機(jī)硒小，可以與功能性大分子物質(zhì)的結(jié)合，能夠在抗氧化、抗腫瘤等生物活性方面產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，且生物利用率高，能夠滿足人體多樣化的營養(yǎng)需求[6]；納米硒毒性最小，易于被人體吸收且能夠發(fā)揮無機(jī)硒和有機(jī)硒所共有的功能性質(zhì)[7]。目前硒的富集方法主要有植物富集法、動(dòng)物富集法和微生物富集法[4]。采用微生物轉(zhuǎn)化富集到的有機(jī)硒與天然食物的有機(jī)硒的組成相似，如硒代半胱氨酸、硒代蛋氨酸等，既可提高硒的生理活性，又可降低其毒性，有利于機(jī)體吸收[6，8]。

近年來，許多研究報(bào)道了乳酸菌可以將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒[9-11]?？紤]到有機(jī)硒和乳酸菌均具有一定的生物活性，對(duì)人體健康和人體營養(yǎng)需求的重要作用，在飲食中添加硒，尤其是富硒的發(fā)酵食品和含硒的膳食補(bǔ)充劑，已經(jīng)受到廣泛重視和認(rèn)可。本研究以32 株乳酸菌為材料，通過檢測對(duì)亞硒酸鈉的耐受性和轉(zhuǎn)化能力來篩選富硒性能優(yōu)良的菌株，再通過優(yōu)化菌株發(fā)酵性能、亞硒酸鈉添加量、亞硒酸鈉添加方式等，確定富硒發(fā)酵乳的最佳制備工藝，最后檢測抗氧化活性的相關(guān)指標(biāo)，評(píng)價(jià)富硒發(fā)酵乳的抗氧化活性，以期為富硒發(fā)酵食品的開發(fā)提供原料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

32 株乳酸菌，由浙江省食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主分離得到，其中菌株4030、4394、4187 分離自貴州發(fā)酵蔬菜，菌株4115 分離自貴州米酒，菌株4246、4446 分離自貴州腌肉糟，菌株823 分離自內(nèi)蒙古發(fā)酵酸牛奶，菌株815、918 分離自青海發(fā)酵酸牛奶，菌株1577、1602、1774、1818、1610 分離自西藏傳統(tǒng)發(fā)酵酸牛奶、菌株1800 分離自西藏青稞酒曲、菌株1636、1595、3888 分離自西藏乳扇，菌株1626、1643 分離自西藏酥油，菌株3471 分離自新疆發(fā)酵酸馬奶，菌株2538、3708、2518、3816、3824 分離自新疆發(fā)酵酸牛奶，菌株3788、3828、3832 分離自新疆奶疙瘩，菌株3379分離自新疆酥油；MRS 肉湯、技術(shù)瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；M17 肉湯，青島海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉，恒天然（中國）有限公司；細(xì)菌/細(xì)胞總DNA 提取試劑盒，北京天根生化科技有限公司；亞硒酸鈉，Sigma 生物試劑有限公司；1,1-二苯肼-2-三硝基苯肼（DPPH），上海麥克林生化試劑有限公司；過氧化氫、甘油、氯化鈉、硝酸、鹽酸、高氯酸、氫氧化鈉、硼氫化鈉、鐵氰化鉀、亮綠、硫酸亞鐵、無水乙醇，均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

SG604 生物安全柜，美國Baker 公司；OptimaTMXPN 超速離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特有限公司；DNP-111 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海海向儀器的設(shè)備廠；DU800 紫外分光光度計(jì)，美國Beckman 公司；AFS9330 原子熒光光譜儀（配硒空心陰極燈），北京吉天儀器有限公司；分析天平、Delta320pH 計(jì)，瑞士梅特勒-托利多有限公司；MSH-R-O3P 數(shù)顯加熱型磁力攪拌器，澳大利亞KEWLAB 公司；HH-US 恒溫水浴鍋，上海赫田科學(xué)儀器有限公司；7000 PCR 擴(kuò)增儀，美國Applied Bio Systems 公司；KQ-300GVDV 雙頻恒溫超聲清洗破碎儀，昆山舒美超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化、鑒定和保藏

采用平板劃線法分離純化，得到的單菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，菌液進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和H2O2酶試驗(yàn)，初步鑒定為乳酸菌后，再進(jìn)行16S rDNA測序鑒定。

取適量菌株純化后的培養(yǎng)物，離心棄上清后用細(xì)菌/細(xì)胞總DNA 試劑盒提取DNA，選擇乳酸菌通用引物27F 和1492R 對(duì)菌株的16S rDNA 片段進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 產(chǎn)物寄送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對(duì)，確定菌株種屬。經(jīng)鑒定后的菌株純培養(yǎng)物連續(xù)傳代2 次后，獲得的菌液加甘油作為保護(hù)劑，-80 ℃保存。

1.2.2 菌株活化

將甘油管中保存的菌液在無菌條件下分別接種至MRS/M17 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12～24 h，活化2～3 代后即可供菌株篩選使用。

1.2.3 富硒乳酸菌的篩選

將活化的菌液按3%比例接種至含有亞硒酸鈉（15 mg/L）的MRS/M17 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至大約對(duì)數(shù)生長期（10～12 h），分光光度計(jì)測600 nm 處的吸光值，3 次平行試驗(yàn)。取10 mL 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的菌液，12 000 rpm 離心10 min 后，上清液過0.22 μm 針頭式水系濾膜以完全除去菌體。按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中硒的測定》GB5009.93-2017 中第一法氫化物原子熒光光譜法分別檢測培養(yǎng)基中和菌上清中的總硒含量，根據(jù)檢測結(jié)果，計(jì)算各菌株的硒轉(zhuǎn)化率。

硒轉(zhuǎn)化率=（培養(yǎng)基中硒含量-上清中硒含量）/培養(yǎng)基中硒含量×100%

1.2.4 富硒乳酸菌發(fā)酵性能評(píng)價(jià)

將篩選得到的富硒性能較優(yōu)的菌株按接種量為3×106CFU/mL 分別接種至10%脫脂乳+3%蔗糖中，40 ℃培養(yǎng)12 h，每隔1 h 測定pH 值，3 次平行試驗(yàn)。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以pH 值為縱坐標(biāo)，繪制生產(chǎn)酸曲線。發(fā)酵結(jié)束后，取終點(diǎn)樣品測定發(fā)酵乳中乙醛、雙乙酰含量，并進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。其中乙醛和雙乙酰含量測定方法參考文獻(xiàn)[12]，感官評(píng)價(jià)方法參考文獻(xiàn)[13]。

1.2.5 適宜亞硒酸鈉濃度的確定

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》GB14880-2012 中對(duì)乳飲料中硒含量的要求，分別配置含亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為50、75、100、125、150、200 μg/L 的發(fā)酵基料，菌株按3×106CFU/mL 接種至發(fā)酵基料中，40 ℃培養(yǎng)至pH 值接近4.6，觀察發(fā)酵乳顏色，同時(shí)測定硒轉(zhuǎn)化率，確定最適加硒量。

1.2.6 發(fā)酵乳中硒含量的測定

發(fā)酵乳中總硒含量測定采用《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定》GB5009.93-2017 中第一法氫化物原子熒光光譜法進(jìn)行。發(fā)酵乳中無機(jī)硒含量檢測如下：準(zhǔn)確移取試樣30.00 mL（精確到0.01 mL）于100 mL 小燒杯中，加熱濃縮值5 mL 以下，轉(zhuǎn)移至10 mL 離心管中，純水定容值10 mL，渦旋混勻，超聲10 min 后，于80～90 ℃水浴振蕩提取1 h，其間每隔20 min 取出上下顛倒，使樣品充分混勻，水浴結(jié)束后，再使用超聲提取20 min。提取完畢，冷卻至室溫，以8 000 rpm 離心15 min。取上層清液，用NaOH 溶液（5 g/L）調(diào)節(jié)pH值至4～7后，經(jīng)0.22 μm 針頭式有機(jī)過濾膜過濾，濾液采用GB5009.93-2017 中第一法進(jìn)行硒含量檢測。

1.2.7 富硒發(fā)酵乳的制備

準(zhǔn)確稱取100.0 g 脫脂乳粉、30.0 g 白砂糖、870.0 g飲用水混合均勻，預(yù)熱至70 ℃、20 MPa 均質(zhì)，105 ℃殺菌10 min，冷卻至40 ℃左右。優(yōu)選菌株按3×106CFU/mL的量接種至含有亞硒酸鈉的發(fā)酵基料中，40 ℃發(fā)酵至pH 值4.6 左右，破乳終止發(fā)酵，冷卻至10 ℃，無菌分裝，得到富硒發(fā)酵乳。

1.2.8 富硒發(fā)酵乳抗氧化活性的測定

按1.2.7 所述制備富硒發(fā)酵乳，同時(shí)制備原料乳中不添加亞硒酸鈉發(fā)酵的無硒發(fā)酵乳和原料乳中添加亞硒酸鈉，但不經(jīng)菌株發(fā)酵的無機(jī)硒乳，參考許牡丹等人[14]方法，并作適當(dāng)改進(jìn)，比較3 種乳樣品的抗氧化活性。

1.2.8.1 羥自由基清除能力測定

取1.0 mL 1,10-鄰菲羅啉溶液（6 mmol/L）與2.0 mL PBS 溶液混合，再加入1.0 mL 硫酸亞鐵溶液（6 mmol/L），立即混勻。準(zhǔn)確加入1.0 mL 乳樣品后加入1.0 mL 過氧化氫溶液（0.1%）和無菌水，反應(yīng)總體積為8.0 mL。混合好的溶液37 ℃孵育1 h 后，于536 nm 處測定吸光值。羥自由基清除率=（As-Ac）/（Ab-Ac）×100%，式中：As為樣品組吸光值；Ac為對(duì)照組吸光值（包括鄰菲羅啉、PBS、硫酸亞鐵和過氧化氫）；Ab為空白組吸光值（包括鄰菲羅啉、PBS 和硫酸亞鐵）。

1.2.8.2 DPPH 自由基清除能力測定

用無水乙醇配置0.2 mmol/L 的DPPH 溶液。1 mL DPPH 乙醇溶液與1 mL 乳樣品充分混勻，避光室溫反應(yīng)30 min，于517 nm 處測定吸光值，記為As，以等體積無水乙醇替換DPPH 溶液測量吸光值，記為Ab，以等體積蒸餾水替換樣品測量吸光值，記為Ac。

DPPH 自由基清除率= [1-（As-Ab）/Ac] ×100%

1.2.8.3 超氧陰離子自由基清除率

取0.1 mL 乳樣品于4.5 mL 的Tris-HCl 緩沖溶液（50 mmol/L，pH=8.0）混合，25 ℃水浴20 min 后，加入0.4 mL 鄰苯三酚溶液（以HCl 為溶劑配置成25 mmol/L），25 ℃水浴反應(yīng)5 min，立即用2 滴HCl 溶液（8 mmol/L）終止反應(yīng)，于325 nm 處測吸光值，記為As，用無菌水調(diào)零，無菌水代替樣品測得的吸光值，記為A0。

超氧陰離子自由基清除率=（A0-As）/ A0×100%

1.2.9 統(tǒng)計(jì)分析

測定指標(biāo)均表示為3 次平行試驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。顯著性分析采用SPSS 17.0 軟件中的Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行分析，顯著水平設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的16S 鑒定結(jié)果

將分離得到的32 株菌的測序結(jié)果在GenBank 的BLAST 數(shù)據(jù)庫中比對(duì)核苷酸序列的同源性，同源性在98%以上認(rèn)為是同一種屬。鑒定結(jié)果如表1 所示，32 株菌均為乳酸菌。

表1 菌株16S rDNA 鑒定結(jié)果

2.2 富硒菌株的篩選

32 株乳酸菌在亞硒酸鈉添加量為15 mg/L 的MRS/M17 液體培養(yǎng)基上菌體生長情況如圖1 所示。由圖1 可知，與未加硒培養(yǎng)的對(duì)照組相比，菌株1577、1818、1643、2518、3816、3824、3832、4030、4115、3728、1800、3471 的生長明顯受到抑制，OD 值下降顯著（P＜0.05），菌株1602、1774、981、1595、1626、3473、4187 的生長抑制更加明顯，OD 值下降極顯著（P＜0.01），其余13 株菌的OD 值變化不明顯，說明在添加15 mg/L 的亞硒酸鈉后菌株的生長沒有受到明顯的影響，具有良好的硒耐受性，本研究中菌株硒耐受性的測試結(jié)果與韋夢(mèng)婷等人[11]的研究結(jié)果相似。

圖1 菌株硒耐受性篩選

對(duì)硒耐受性良好的菌株培養(yǎng)液上清中的硒含量進(jìn)行測定，并計(jì)算各菌株的富硒率，結(jié)果如表2 所示。由表可知，在含15 mg/L 的亞硒酸鈉的培養(yǎng)基中菌株的富硒性能差別明顯，菌株1610 的富硒率最高為81.1%，菌株3888、815、3379 的富硒率在70.00%～80.00%，菌株823、1636、2538、3708、4246 的富硒率在60.00%～70.00%，菌 株4394、4446、3788、3828 的 富 硒 率 在50.00%以下，其中菌株3828 的富硒率最低為27.87%。韋夢(mèng)婷等人[11]的研究中指出，經(jīng)過優(yōu)化后部分乳酸菌菌株的富硒率提高至70%以上，且菌株的富硒率最高可達(dá)到81.80%，與本文研究篩選結(jié)果較為一致，因此我們篩選富硒率70%以上的菌株，分別為菌株1610、3888、815、3379 進(jìn)行發(fā)酵性能的評(píng)價(jià)，以便獲得兼具優(yōu)良富硒性能和發(fā)酵性能的菌株。

表2 耐受菌株的硒富集情況

2.3 富硒菌株的發(fā)酵性能

菌株的產(chǎn)酸速率、后酸穩(wěn)定性以及產(chǎn)生乙醛、雙乙酰的量是評(píng)價(jià)其發(fā)酵性能的重要指標(biāo)。由圖2 可知，菌株3888 和3379 的產(chǎn)酸速率適中，但pH 值達(dá)到4.5 左右后繼續(xù)深度發(fā)酵，至發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)，pH 值分別下降至3.49 和3.70；菌株815 的產(chǎn)酸延遲期較長，從4.5 h 左右才開始產(chǎn)酸，pH 值到達(dá)4.5 之后的發(fā)酵程度也比較深，到終點(diǎn)時(shí)pH 值低至3.68；菌株1610 整體的產(chǎn)酸速率適中，發(fā)酵5 h 后pH 值達(dá)到4.52，之后緩慢產(chǎn)酸至發(fā)酵終點(diǎn)，pH 值為4.20，后酸比較平穩(wěn)。

圖2 富硒菌株發(fā)酵乳產(chǎn)酸曲線

由表3 結(jié)果可知，以單菌株發(fā)酵獲得發(fā)酵乳中乙醛和雙乙酰的含量各有不同，結(jié)合風(fēng)味評(píng)價(jià)描述發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙醛含量較高時(shí)，發(fā)酵乳呈現(xiàn)典型發(fā)酵乳香氣，當(dāng)雙乙酰含量較高時(shí)，發(fā)酵乳的乳脂風(fēng)味突出。菌株815 的乙醛產(chǎn)量最高，但雙乙酰含量較低，因此缺乏乳脂香氣；菌株1610 的雙乙酰產(chǎn)量最高，呈現(xiàn)出濃郁的乳脂風(fēng)味。一般認(rèn)為，乙醛由保加利亞乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生，雙乙酰由嗜熱鏈球菌產(chǎn)生，且當(dāng)酸奶中乙醛含量較低時(shí)，雙乙酰占主導(dǎo)地位，形成具有獨(dú)特奶香味的發(fā)酵乳[15-16]，本研究中的菌株1610 為一株嗜熱鏈球菌，菌株815 為一株德氏乳桿菌保加利亞亞種，其發(fā)酵產(chǎn)生的特征風(fēng)味物質(zhì)以及呈現(xiàn)出的風(fēng)味符合這一特點(diǎn)。

綜合分析各菌株產(chǎn)酸特性和特征風(fēng)味物質(zhì)含量發(fā)現(xiàn)，菌株3379 的產(chǎn)酸速率較慢，且風(fēng)味欠佳，不適合酸奶發(fā)酵，其余3 株發(fā)酵性能良好，其中菌株1610的產(chǎn)酸速率適中，后酸化穩(wěn)定，且能夠形成較高含量的乙醛和雙乙酰，呈現(xiàn)出乳脂香氣濃郁的發(fā)酵乳風(fēng)味，發(fā)酵性能最優(yōu)。

2.4 不同濃度亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵乳感官品質(zhì)和硒轉(zhuǎn)化的影響

有研究指出，亞硒酸鈉的濃度會(huì)對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)，如顏色、味道產(chǎn)生影響，也會(huì)影響菌株對(duì)硒的轉(zhuǎn)化[17]。乳酸菌自身在亞硒酸鈉環(huán)境中具有解毒作用，可將富集的硒一部分轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒，而另外一部分可以被還原成零價(jià)態(tài)的單質(zhì)硒，單質(zhì)硒在溶液中呈紅色[7]。本研究中，不同濃度亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵乳的顏色和味道影響不明顯，添加量為最高200 μg/L 時(shí)，發(fā)酵乳均呈現(xiàn)乳白色，顏色沒有變化，也沒有金屬味道產(chǎn)生，說明實(shí)驗(yàn)中各濃度的亞硒酸鈉沒有對(duì)菌株形成毒性，硒的轉(zhuǎn)化為生理性富集，絕大部分以有機(jī)硒形式存在。另一方面，不同濃度的亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵過程硒轉(zhuǎn)化率影響較大，且各菌株的變化趨勢較為一致，如圖3 所示。當(dāng)濃度為50 μg/L 時(shí)，轉(zhuǎn)化率較低，隨后逐漸升高，當(dāng)濃度增加至125 μg/L 以后，轉(zhuǎn)化率趨于穩(wěn)定。其中菌株3888 整體硒轉(zhuǎn)化水平較低，原因可能是由于該菌的產(chǎn)酸速率較快，發(fā)酵時(shí)間比另外兩株菌少0.75 h 造成的，Alzate 等人[18]的研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，乳酸菌發(fā)酵12 h 時(shí)，硒轉(zhuǎn)化率為89±1%，發(fā)酵24 h 時(shí)增加至94±1%。綜合考慮法規(guī)要求、硒轉(zhuǎn)化率和有機(jī)硒生成量，確定150 μg/L 為亞硒酸鈉的最優(yōu)濃度。

圖3 不同濃度亞硒酸鈉對(duì)發(fā)酵乳中菌株硒轉(zhuǎn)化的影響

2.5 富硒發(fā)酵乳抗氧化活性的研究

2.5.1 羥自由基清除能力

羥自由基能夠降解DNA、損傷細(xì)胞膜和多糖化合物，是導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化和人體細(xì)胞損傷的最主要的自由基之一。在本研究中,如圖4 所示，3 種乳樣品都有一定的羥自由基清除能力，其中富硒發(fā)酵乳的清除能力最強(qiáng)，顯著高于無機(jī)硒乳和無硒發(fā)酵乳（P＜0.05）。3 株乳酸菌相比，菌株1610 制備的富硒發(fā)酵乳清除能力最強(qiáng)，清除率為45.69±3.61%，分別是無機(jī)硒乳和無機(jī)硒發(fā)酵乳的2.99 倍和2.49 倍，分析原因可能是由于菌株1610 在乳中的硒轉(zhuǎn)化率較高，發(fā)酵乳中有更多的有機(jī)硒產(chǎn)生。Penas 等人[19]在制作德國泡菜時(shí)，在發(fā)酵前加入0.3 mg 亞硒酸鈉，發(fā)酵后發(fā)現(xiàn)泡菜的抗氧化活性因?yàn)橛袡C(jī)硒的生產(chǎn)而顯著提高，為對(duì)照組的1.75 倍。

圖4 富硒發(fā)酵乳羥自由基清除能力

2.5.2 DPPH 自由基清除能力

清除DPPH 自由基能力被廣泛應(yīng)用于抗氧化能力評(píng)價(jià)中，本研究中如圖5 所示，經(jīng)過乳酸菌富硒的發(fā)酵乳的DPPH 自由基清除能力最強(qiáng)，顯著高于無機(jī)硒乳和無硒發(fā)酵乳（P＜0.05），3 株乳酸菌制備的富硒發(fā)酵乳的DPPH 自由基清除率為1610（47.15±3.20%）＞815（34.64±1.44%）＞3888（30.90±2.97%）。發(fā)酵乳通常具有一定抗氧化活性，但一般活性較低，乳酸菌是有機(jī)硒的良好載體，在乳原料中添加適量無機(jī)硒，經(jīng)過特定菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化后，使得發(fā)酵乳的抗氧化活性顯著提高，形成協(xié)同效果。

圖5 富硒發(fā)酵乳DPPH 自由基清除能力

2.5.3 超氧陰離子自由基清除能力

超氧陰離子自由基是生物體代謝過程中產(chǎn)生的一種自由基，多種乳酸菌被報(bào)道過其發(fā)酵液、菌上清和菌體均有超氧陰離子自由基清除的能力[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，富硒后的發(fā)酵乳超氧陰離子的清除能力最強(qiáng)，顯著高于無機(jī)硒乳和無硒發(fā)酵乳（P＜0.05），3 株乳酸菌制備的富硒發(fā)酵乳的超氧陰離子自由基清除能力為1610（70.20±3.32%）＞3888（64.35±3.35%）＞3888（60.72±4.18%）。超氧陰離子的清除主要通過超氧化物歧化酶進(jìn)行，有研究報(bào)道，采用含有機(jī)硒的飼料飼喂仔兔后，兔血清中的SOD 酶顯著升高，說明有機(jī)硒可以促進(jìn)SOD 酶的生產(chǎn)，從而提高超氧陰離子的清除能力[21]。本研究中富硒發(fā)酵乳超氧陰離子清除能力的增強(qiáng)可能也是通過有機(jī)硒的生成，從而促進(jìn)了SOD 酶的活性。

圖6 富硒發(fā)酵乳超氧陰離子自由基清除能力

3 結(jié) 論

本研究從32 株乳酸菌中篩選得到了3 株硒轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)且發(fā)酵性能優(yōu)良的菌株，分別是嗜熱鏈球菌1610、乳酸乳球菌3888 和得到乳桿菌乳亞種815。當(dāng)培養(yǎng)基中添加15 mg/L 的亞硒酸鈉時(shí)，1610 的富硒率為81.11±2.07%，3888 的富硒率為78.47±3.10%，815的富硒率為71.20±3.47%。以3 種菌株為發(fā)酵菌種制備富硒發(fā)酵乳，亞硒酸鈉最適添加量為150 μg/L，富硒率最高可達(dá)到88.39±10.61%，且發(fā)酵乳顏色呈現(xiàn)乳白色和典型發(fā)酵乳香氣，沒有紅色和金屬味，感官品質(zhì)良好。與無機(jī)硒乳和無硒發(fā)酵乳相比，3 株菌制備的富硒發(fā)酵乳的羥自由基、DPPH 自由基和超氧陰離子自由基的清除能力顯著升高，說明經(jīng)過含有有機(jī)硒的發(fā)酵乳具有更好的抗氧化活性。

乳酸菌是有機(jī)硒良好的載體，利用特定乳酸菌菌株能夠?qū)o機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒的特性，賦予發(fā)酵乳雙重的功能特性，具有良好的市場空間。本研究發(fā)現(xiàn)篩選獲得的富硒菌株可在發(fā)酵乳時(shí)對(duì)無機(jī)硒進(jìn)行快速高效的轉(zhuǎn)化，當(dāng)?shù)孜餄舛群线m時(shí)，絕大部分以有機(jī)硒形態(tài)存在，且顯著提高了發(fā)酵乳的抗氧化活性。后期研究將進(jìn)一步分析發(fā)酵乳中有機(jī)硒的形態(tài)以及有機(jī)硒與抗氧化活性之間的聯(lián)系，為富硒功能性發(fā)酵乳制品的開發(fā)提供支撐。