梁茜（Liang Qian），王學(xué)鋒（Wang Xue-feng）

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海200025；Department of Laboratory Medicine，Ruijin Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200025，China）

【編者按】本文于2022年6月發(fā)表于《Blood》雜志，發(fā)表后引起業(yè)內(nèi)廣泛關(guān)注，在Blood Podcast（Episode 22 Season 3，https：／／ashpublications.org／blood／pages／blood_podcast）和《JTH》雜志W(wǎng)hat The Neighbors Say欄目（J Thromb Haemost，2022，20：1036）重點介紹。本文文章題錄為：Zeng JW，Shu ZM，Liang Q，Zhang J，Wu WM，Wang XF，Zhou AW. Structural basis of Von Willebrand Factor multimerization and tubular storage，Blood，2022 Jun 2；139（22）：3314-3324.該研究首次通過單顆粒冷凍電鏡技術(shù)獲得了高分辨率的由VWF N端結(jié)構(gòu)域（D1D2D’D3結(jié)構(gòu)域）形成的管狀多聚體結(jié)構(gòu)，揭示了VWF多聚體組裝和Weibel-Palade小體儲存的結(jié)構(gòu)機制。該理論不僅解開了VWF多聚體組裝和儲存機制的謎團，也為2A型血管性血友?。╒WD）患者基因治療新策略奠定了理論基礎(chǔ)。經(jīng)通信作者許可，再次通過佳文解讀的方式來闡述這一發(fā)現(xiàn)。

1 研究背景

血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）由內(nèi)皮細(xì)胞及巨核細(xì)胞合成，可介導(dǎo)血小板粘附于受損內(nèi)皮下暴露的膠原，也是凝血因子Ⅷ的保護性載體。VWF多聚體是血循環(huán)中分子量最大的蛋白成分，只有高分子量VWF多聚體才具備生物學(xué)功能［1-3］。VWF多聚體組裝障礙可導(dǎo)致2A型血管性血友?。╲on Willebrand disease，VWD）［4］。VWF蛋白由2813個氨基酸組成，其結(jié)構(gòu)域以D1-D2-D’-D3-A1-A2-A3-D4-C1-C2-C3-C4-C5-C6-CK順序排列，包括22個氨基酸組成的信號肽、741個氨基酸組成的前肽（D1-D2結(jié)構(gòu)域）以及2050個氨基酸組成的成熟VWF蛋白（D’-CK結(jié)構(gòu)域）。VWF單體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（中性環(huán)境）通過CK結(jié)構(gòu)域的分子間二硫鍵形成“尾尾相連”的二聚體，隨后該二聚體在高爾基體內(nèi)（弱酸性環(huán)境）以D3結(jié)構(gòu)域分子間二硫鍵進一步形成“頭頭相連”的多聚體［5-7］。一部分VWF多聚體能夠以基礎(chǔ)分泌的形式直接分泌進入血漿，另一部分則堆積成有序的管狀結(jié)構(gòu)且進一步壓縮組裝成超大分子量VWF多聚體儲存于Weibel-Palade小體（WP小體）中，以調(diào)節(jié)性胞吐的形式分泌進入血循環(huán)中。

雖然VWF前肽（D1D2結(jié)構(gòu)域）會在VWF蛋白分泌入血漿后與VWF多聚體分離，但是其對于胞內(nèi)VWF多聚體組裝及WP小體儲存均至關(guān)重要。前肽區(qū)域突變或缺失均可導(dǎo)致VWF多聚體組裝及WP小體儲存障礙［8-9］。此外，體外研究表明，VWF前肽與成熟VWF蛋白分別在兩個單獨的質(zhì)粒上表達也可以促進VWF多聚體組裝，提示VWF前肽無需與成熟VWF蛋白在物理上相連也可發(fā)揮作用［8］。但是，VWF前肽參與VWF多聚體組裝及WP小體儲存過程的具體作用機制以及VWF多聚體組裝與WP小體形成之間的關(guān)聯(lián)尚未完全闡明。

近幾年，冷凍電鏡和圖像處理技術(shù)飛速發(fā)展，為我們“看清”生物大分子結(jié)構(gòu)和作用方式提供了強有力的手段。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院王學(xué)鋒課題組從事出血病和血栓病的基礎(chǔ)與臨床研究已60余年，累積了豐富的VWD臨床病例資料，為科學(xué)研究提供了精確的切入點和強有力的支撐。借助上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院周愛武和清華大學(xué)曾建偉課題組在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域的實驗技術(shù)平臺，共同解析了高分辨率的由VWF N端結(jié)構(gòu)域（D1D2D’D3結(jié)構(gòu)域）形成的管狀多聚體結(jié)構(gòu)，闡明了VWF多聚體組裝和WP小體儲存的結(jié)構(gòu)機制。該工作不僅提高了我們對VWF多聚體組裝機制的認(rèn)識，也為因VWF前肽突變導(dǎo)致的2A型VWD患者基因治療提供了新策略。

2 研究概述

2.1 研究路線

作者借助先進的單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，通過高分辨率結(jié)構(gòu)解析，闡明了VWF前肽在VWF多聚體組裝和WP小體形成過程的作用機制。作者對不同條件下（包括不同pH、加入或不加入CaCl2、不同反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間）反應(yīng)后的VWF D1D2二聚體和D1D2-D’D3二聚體復(fù)合物進行負(fù)染，并對質(zhì)量合格的樣品進行冷凍樣品的制備。本研究解析的所有蛋白結(jié)構(gòu)均為弱酸性條件下形成（20mM MES pH6.0、100 mM NaCl、10 mM CaCl2），VWF前肽與D’D3二聚體形成管狀結(jié)構(gòu)的反應(yīng)條件為pH6.0、10 mM CaCl2、4℃反應(yīng)8分鐘至過夜。利用Talos Arctica 200 kV電子顯微鏡確認(rèn)冷凍樣品質(zhì)量，并通過Titan Krios G3i 300 kV冷凍透射電鏡進行數(shù)據(jù)收集。經(jīng)多輪的2D分類、3D分類和優(yōu)化，獲得高分辨率的VWF管狀多聚體結(jié)構(gòu)。此外，作者還通過一系列生化實驗和結(jié)構(gòu)分析闡明并驗證了VWF前肽突變的分子致病機制。

2.1.1 冷凍電鏡解析的VWF分子頭部片段（D1D2D’D3結(jié)構(gòu)域）形成的管狀結(jié)構(gòu)

經(jīng)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，VWF管狀結(jié)構(gòu)由多個重復(fù)單元組成，圖1B、1F和1G分別是一個、兩個和八個重復(fù)單元結(jié)構(gòu)示意圖。兩個重復(fù)單元之間通過D2：D2相互作用界面相連。每個重復(fù)單元包括一個“甜甜圈樣”D1D2二聚體和一個D’D3二聚體（圖1B-E）。每個D1D2單體呈拱形，D1和D2結(jié)構(gòu)域之間由D1結(jié)構(gòu)域的TIL-1和E1模塊銜接（“搖籃”結(jié)構(gòu)），兩個D1D2分子通過D1：D2間相互作用形成二聚體。兩個D’D3分子分別嵌入“搖籃”結(jié)構(gòu)并面對面擺放，形成兩對分子間二硫鍵（Cys1097-Cys1097’和Cys1142-Cys1142’）而組裝成多聚體。兩個重復(fù)單元之間通過D2：D2作用界面相連。每個重復(fù)單元以右手螺旋方式沿縱軸旋轉(zhuǎn)86.8°、上升29.4 ?堆積形成“圓筒刷子樣”管狀結(jié)構(gòu)。VWF前肽組成管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)層，D’D3組成管狀結(jié)構(gòu)的外層。該管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)徑為11 nm，外徑為28 nm（圖2）。

圖1 冷凍電鏡解析的VWF管狀結(jié)構(gòu)重復(fù)單元

圖2 VWF蛋白形成的管狀結(jié)構(gòu)組裝模型

2.1.2 VWF管狀結(jié)構(gòu)中VWF分子間相互作用界面分析

參與VWF分子管狀結(jié)構(gòu)形成的相互作用界面主要有5個（圖3），包括：①D2：D2結(jié)合面，主要有His460參與；②D1D2：D’D3結(jié)合面，D’結(jié)構(gòu)域主要通過His831與D2結(jié)構(gòu)域中Glu543相互作用；③D1：D2結(jié)合面，主要有His395參與；④D3：D3結(jié)合面，主要有Cys1097和Cys1142參與，形成分子間二硫鍵；⑤D1：D1結(jié)合面，VWF分子間縱向相互作用力，主要由D1結(jié)構(gòu)域的His288與Glu333間相互作用介導(dǎo)。

圖3 VWF管狀結(jié)構(gòu)相互作用界面分析

2.1.3 弱酸性環(huán)境下VWF前肽二聚體結(jié)構(gòu)

VWF分子頭部片段（D1D2D’D3結(jié)構(gòu)域）形成的管狀結(jié)構(gòu)解析明確了VWF分子間相互作用的最終狀態(tài)，但其具體的步驟仍不得而知。比如，VWF前肽分子間D1：D2相互作用和D2：D2相互作用是孰先孰后仍不明了（圖4A）。為了進一步明確VWF管狀結(jié)構(gòu)形成的始動環(huán)節(jié)，作者進一步解析了弱酸性環(huán)境下VWF前肽（D1D2結(jié)構(gòu)域）二聚體的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)（圖4B）。結(jié)果顯示，VWF前肽二聚體為分子間D2：D2相互作用形成的“飛梭狀”結(jié)構(gòu)，提示該結(jié)構(gòu)是弱酸性條件下VWF前肽結(jié)構(gòu)變換的第一步。由于組氨酸對pH變化比較敏感，中性條件下不帶電，在酸性環(huán)境中會發(fā)生質(zhì)子化帶正電，可能是誘導(dǎo)VWF前肽在酸性環(huán)境下相互作用的重要因素。作者對VWF分子管狀結(jié)構(gòu)形成過程參與分子間／分子內(nèi)相互作用的所有組氨酸進行了詳細(xì)分析，結(jié)果表明，在D1：D2和D1D2：D’D3相互作用界面無組氨酸參與，D2結(jié)構(gòu)域VWD2模塊內(nèi)His460質(zhì)子化后可與另一個D2分子E2模塊的Asp720和Phe716形成分子間鹽橋，穩(wěn)定分子間D2：D2相互作用（圖4E）；同時，D2結(jié)構(gòu)域VWD2模塊的His395質(zhì)子化后可與C8-2模塊的Asp611形成分子內(nèi)鹽橋，穩(wěn)定D2結(jié)構(gòu)域的內(nèi)部堆積作用（圖4CD）。此外，在D1：D1縱向相互作用中，His288質(zhì)子化后可與另一個分子D1結(jié)構(gòu)域的Glu333發(fā)生離子相互作用，穩(wěn)定VWF管狀結(jié)構(gòu)在縱向上的堆積。

圖4 弱酸性環(huán)境誘導(dǎo)的VWF前肽同源二聚體結(jié)構(gòu)

2.1.4 VWF前肽在VWF多聚體組裝和WP小體形成過程的模板機制

基于弱酸性條件下VWF前肽二聚體結(jié)構(gòu)以及VWF分子頭部片段（D1D2D’D3結(jié)構(gòu)域）形成的管狀結(jié)構(gòu)，作者提出了VWF前肽在VWF多聚體組裝和WP小體儲存過程的模板機制（圖5）。當(dāng)VWF二聚體由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入高爾基體后，細(xì)胞器內(nèi)環(huán)境由中性變?yōu)槿跛嵝裕琕WF前肽組氨酸發(fā)生質(zhì)子化帶正電，VWF二聚體頭部因分子間D2：D2相互作用形成閉合的VWF前體二聚體（Step i）。隨后，VWF前肽二聚體可作為模板招募兩個D’D3分子分別嵌入“搖籃”結(jié)構(gòu)內(nèi)形成相互纏繞的D1D2D’D3二聚體（最小重復(fù)單元）（Step ii）。此重復(fù)單元借助前肽分子間D1：D2相互作用使D1D2D’D3二聚體以右手螺旋方式緊密排列堆積形成管狀結(jié)構(gòu)（Step iii）。與此同時，D1D2D’D3二聚體的有序堆積使不同D1D2D’D3二聚體上的D3結(jié)構(gòu)域在空間上彼此靠近并形成分子間二硫鍵，最終組裝成管狀多聚體（Step iv）。因此，無論是VWF多聚體組裝還是WP小體形成，均由弱酸性環(huán)境下VWF前肽二聚體形成所啟動，VWF前肽二聚體不僅為D3結(jié)構(gòu)域分子間二硫鍵形成（多聚體組裝）創(chuàng)造了條件，同時也促進了VWF分子有序堆積并形成管狀結(jié)構(gòu)而儲存。

圖5 VWF前肽在VWF多聚體組裝和WP小體形成過程的模板機制

2.1.5 臨床上VWF前肽突變導(dǎo)致2A型VWD的分子致病機制

VWF前肽突變可因VWF多聚體組裝障礙而導(dǎo)致2A型VWD。從蛋白結(jié)構(gòu)分析，臨床數(shù)據(jù)庫中已報道的2A型VWD致病突變通過破壞分子內(nèi)部堆積作用和／或分子間相互作用界面影響VWF多聚體組裝的不同步驟，最終導(dǎo)致血漿中高分子量VWF多聚體選擇性減少。比如，D1結(jié)構(gòu)域Tyr87Ser突變可能通過影響與另一分子D2結(jié)構(gòu)域的Arg575位點相互作用而影響Step iii［10］；瑞金醫(yī)院先前報道的VWF 8號外顯子缺失突變（因剪切位點突變c.875-5T＞G導(dǎo)致的8號外顯子跳躍）則由于缺失了大部分D1結(jié)構(gòu)域的TIL1模塊，影響了D’D3結(jié)構(gòu)域的嵌入（Step ii）［11］。體外生化實驗也進一步證實了Tyr87Ser突變型VWF前肽與D’D3結(jié)合能力與野生型無顯著差異，而8號外顯子缺失突變型VWF前肽與D’D3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合能力顯著減弱。該團隊提出的VWF前肽在VWF多聚體組裝和WP小體形成過程的模板機制可為VWF前肽突變導(dǎo)致2A型VWD的致病機制提供合理的解釋。同時，臨床患者的突變也反向證實了該理論的準(zhǔn)確性。

2.2 研究意義

本研究證實了VWF分子由中性環(huán)境的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入弱酸性環(huán)境的高爾基體后，VWF前肽相當(dāng)于一個對pH變化極其敏感的開關(guān)，通過形成同源二聚體為VWF多聚體組裝及WP小體儲存提供模板，啟動并促進管狀結(jié)構(gòu)形成和VWF多聚化?；诒狙芯繉θ跛嵝原h(huán)境下高分辨率的VWF前肽二聚體以及VWF管狀結(jié)構(gòu)冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析，揭示了VWF前肽在VWF多聚體組裝和WP小體儲存過程的模板機制。依賴于VWF前肽分子間相互作用的重復(fù)單元的有序堆積不以D3結(jié)構(gòu)域分子間二硫鍵形成（VWF多聚體組裝）為前提；相反，重復(fù)單元的有序堆積為D3結(jié)構(gòu)域分子間二硫鍵形成和VWF進一步多聚化創(chuàng)造了條件。本研究顯著提高了我們對VWF多聚體組裝和WP小體儲存機制的認(rèn)知。

基因治療是治愈遺傳性疾病的唯一手段。目前，國際上有少量研究報道通過病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)野生型全長VWF基因可提升VWF敲除小鼠的血漿VWF水平，但治療效果極為有限［12-15］。全長VWF基因長達8 kb以上，病毒載體的容量限制是影響VWD基因治療效果的主要障礙之一［16-18］?；谥耙褕蟮赖腣WF前肽無需與成熟VWF蛋白在物理上相連也可以促進VWF多聚體組裝和本研究闡明的VWF前肽在多聚體組裝和WP小體形成過程的模板機制，提示外源性導(dǎo)入野生型前肽或許可與體內(nèi)突變的VWF前肽競爭，替換突變的VWF前肽，為體內(nèi)異常的VWF分子多聚體組裝提供正確的模板，從而糾正VWF突變體的多聚體組裝障礙。該設(shè)想在既往研究的細(xì)胞實驗中（VWF前肽437-442位氨基酸缺失突變，破壞D2：D2相互作用）已初步得到證實［19］。VWF前肽全長2.3 kb，完全滿足腺相關(guān)病毒包裝條件，可參照血友病A基因治療的方法，通過特異性啟動子使VWF前肽在內(nèi)皮細(xì)胞中長期特異表達而糾正VWF前肽突變相關(guān)2A型VWD患者的多聚體組裝障礙，為2A型VWD患者基因治療帶來曙光。

作者貢獻聲明梁茜負(fù)責(zé)撰寫文章；王學(xué)鋒負(fù)責(zé)修改文章語言并監(jiān)督此項目

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突