張玉梅 朱 琳 師 健 張春芳 張辰龍 郭凱航 王玉潔 李鵬飛

肝細(xì)胞癌(肝癌)是全球發(fā)病率極高的惡性腫瘤之一，發(fā)病率為4.7%，位居全球惡性腫瘤第6位，病死率8.3%，位于全球癌癥第3位[1]。中國(guó)肝癌發(fā)病率和病死率均高于全球平均水平，疾病負(fù)擔(dān)重。基于“肝臟-膽汁酸-腸道微生態(tài)軸”“腸-肝循環(huán)”概念，研究人員發(fā)現(xiàn)膽汁酸-腸道菌群生理病理相互影響，膽汁酸代謝障礙和腸道微生態(tài)之間的失衡參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展[2]。茵陳蒿湯是《傷寒雜病論》中治療濕熱黃疸的著名方，具有保肝、利膽等功效。肝癌屬于中醫(yī)“黃疸”“肝積”“癥瘕”等范疇，在治療肝癌的經(jīng)典方劑中，該方使用頻次位列前3[3]，臨床效果明確但其作用機(jī)制尚不清楚。根據(jù)中醫(yī)“肝與大腸相通”的理論及茵陳蒿提取物促進(jìn)大鼠膽汁分泌的基礎(chǔ)，筆者推測(cè)茵陳蒿湯可能通過(guò)平衡膽汁酸代謝-腸道微生態(tài)的關(guān)系進(jìn)而控制肝癌的發(fā)生發(fā)展。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)別雄性 BABL/C 小鼠，30只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(閩)2018-0009。本實(shí)驗(yàn)符合廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則和要求，倫理號(hào)：XMULAC20200062。

1.2 藥品與試劑茵陳蒿湯(茵陳蒿18 g，生大黃6 g，炒梔子6 g)，飲片購(gòu)自廈門(mén)守一真源健康管理有限公司。將飲片于6倍量水中浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，藥液濃縮至生藥質(zhì)量濃度分別為0.45 g/ml、0.9 g/ml、1.8 g/ml，4 ℃保存?zhèn)溆谩?6 S rDNA測(cè)序分析技術(shù)試劑盒：DNA試劑盒(批號(hào)：3302050)、DNA質(zhì)檢瓊脂糖凝膠(批號(hào)：AD1200)、AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(批號(hào)：AP-GX-250)、qiagen糞便細(xì)菌DNA分離試劑盒(批號(hào)：51604)、DNA質(zhì)檢瓊脂糖(批號(hào)：AN34L071)、TransStart Fastpfu DNA Polymerase(批號(hào)：JLC-R11648)、PCR建庫(kù)試劑接頭引物(批號(hào)：TD203)、上機(jī)前質(zhì)檢 qPCR Mix(批號(hào)：21612)、qPCR標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：GF-170F)、TruSeqTM DNA Sample Prep Kit(批號(hào)：NT0911-100)，以上均購(gòu)自上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 儀器精密電子天平(Sartorius)，1290 Infinity series UHPLC System 超高液相色譜(Agilent)與Q Exactive Focus 質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific)，MultiskanTMGO酶標(biāo)儀(Thermo Fisher Scientific)，高速冷凍型離心機(jī)(DRAGONLAB)，F(xiàn)orma 8800型超低溫冰箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

2 方法

2.1 分組及建模將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(SOG)、肝癌模型組(MG)、茵陳蒿湯高/中/低劑量組(HDG/MDG/LDG組)，每組6只。模型組和治療組小鼠取濃度2×107個(gè)/ml H22肝癌細(xì)胞0.1 ml注于肝臟左葉建模，SOG組注入等量生理鹽水。治療組造模后24 h分別予1.8 g/ml、0.9 g/ml、0.45 g/ml茵陳蒿湯1 ml/log小鼠體質(zhì)量灌胃，MG、SOG組給予等體積生理鹽水，每日上午9:00～10:00給藥1次，連續(xù)14 d。

2.2 樣本收集末次給藥24 h后，將小鼠頸椎脫臼處死，將完整肝臟稱(chēng)重，選取一部分用于HE染色，一部分用于膽汁酸分析。取盲腸末端的內(nèi)容物置于液氮速凍，-80 ℃保存，用于腸道菌群多樣性分析。

2.3 UHPLC-MS/MS分析①標(biāo)本預(yù)處理：25 mg肝組織樣品中加入1000 μl含0.1% 甲酸提取液(甲醇∶乙腈:水=2∶2∶1，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo))，渦旋混勻30 s；再加入鋼珠，用35 Hz的頻率研磨4 min，再于冰水浴超聲5 min，重復(fù)步驟3 次。低溫靜置1 h后在4 ℃離心機(jī)中以1 2000 rpm離心15 min；取上清加至LC進(jìn)樣瓶中，用于UHPLC-MS/MS分析。②流動(dòng)相條件：Agilent 1290 Infinity series (Agilent Technologies)超高效液相色譜儀，通過(guò)Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150×2.1 mm,1.7 μm,Waters)液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為1 mmol/L的乙酸銨和1 mmol/L的乙酸水溶液，B相為乙腈。柱溫箱溫度為60 ℃，樣品盤(pán)設(shè)為4 ℃，進(jìn)樣體積為1 μl。③質(zhì)譜條件：使用Q Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀，以平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Parallel Reaction Monitoring,PRM)模式進(jìn)行質(zhì)譜分析。離子源參數(shù)如下：Spray voltage=3500/-3100 V,Sheath gas (N2) flow rate=40,Aux gas (N2) flow rate=15,Sweep gas (N2) flow rate =0,Aux gas (N2) temperature=350 ℃,Capillary temperature=320 ℃。

2.4 16SrDNA 測(cè)序分析菌群多樣性使用DNA提取試劑盒對(duì)糞便標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌DNA提取。以菌群基因中的V3-V4區(qū)為靶標(biāo)，以帶有barcode的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和純化，得到樣本PCR產(chǎn)物。使用熒光定量系統(tǒng)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)定量。構(gòu)建Miseq文庫(kù)，使用Illumina MiSeq PE 300平臺(tái)進(jìn)行Miseq測(cè)序，得到菌群V3-V4區(qū)的高通量數(shù)據(jù)。將Miseq測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，采用PCA分析組間菌群差異、LEfSe分析優(yōu)勢(shì)菌屬。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肝重比較與SOG組比較，MG組肝重顯著增加(P<0.01)；經(jīng)茵陳蒿湯干預(yù)后，治療組肝重顯著減少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中高劑量效果最顯著。表明茵陳蒿湯縮小了瘤體，可能具有一定抗腫瘤效果。見(jiàn)圖1。

注：與SOG組比較，***P<0.001；與MG組比較，##P<0.01；與MG組比較，###P<0.001。圖1 茵陳蒿湯對(duì)肝癌原位移植瘤小鼠肝臟重量的影響

3.2 HE染色SOG組未見(jiàn)肝癌組織，MG組見(jiàn)大片肝癌組織，且肝癌細(xì)胞核深染。LDG、MDG、HDG組均見(jiàn)肝癌組織部分壞死，并且肝癌組織細(xì)胞核染色較MG組淺。見(jiàn)圖2。

圖2 肝癌原位移植瘤小鼠肝組織病理(HE * 20 倍)

3.3 膽汁酸代謝差異性分析使用UHPLC-MS/MS分析肝組織中膽汁酸，可測(cè)出?；铅潦竽懰?T-α-MCA)、?；切苊撗跄懰?TUDCA)、T-β-MCA、牛磺膽酸(TCA)、?；敲撗跄懰?TDCA)等。其中各組TUDCA、TCA和TDCA差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MG組中T-α-MCA較SOG組顯著降低(P<0.001)。與SOG組相比，MG組的初級(jí)結(jié)合膽汁酸T-β-MCA濃度顯著降低(P<0.001)，而茵陳蒿湯治療后逐漸升高(P<0.01)。說(shuō)明茵陳蒿湯可能促進(jìn)T-β-MCA的生成。見(jiàn)圖3。

注：與SOG 組比較，***P<0.001；與 MG 組比較，##P<0.01；與 MG 組比較，###P<0.001。圖3 茵陳蒿湯對(duì)肝癌原位移植瘤小鼠肝組織中膽汁酸的影響

3.4 腸道菌群屬水平分析采用PCA分析不同組別小鼠菌群屬水平的差異性。MG組與SOG組在空間圖中距離較遠(yuǎn)，表明二者在屬水平上的菌群物種差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。LDG、MDG、HDG組均與MG組距離較遠(yuǎn)，其中MDG組與HDG組在空間分布上顯著與SOG組聚集，表明中高劑量的茵陳蒿湯在恢復(fù)肝癌小鼠屬水平上的菌群失調(diào)可能有一定的作用。見(jiàn)圖4。

圖4 茵陳蒿湯對(duì)肝癌原位移植瘤小鼠腸道菌群 PCA 分析

3.5 優(yōu)勢(shì)菌種差異性分析采用LEfSe分析不同類(lèi)群的相似性和優(yōu)勢(shì)菌種。SOG組中的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌科的乳酸桿菌屬、小鼠桿菌科的小鼠桿菌屬，MG組為螺旋桿菌科的螺旋桿菌屬、毛螺菌科的毛螺菌屬NK4A136和A2芽孢桿菌屬，LDG組為脫硫弧菌科、毛螺菌科的毛螺菌屬，MDG 組為擬桿菌科的擬桿菌屬和另枝菌屬，HDG組為顫螺菌屬和梭狀芽胞桿菌屬。表明MG組和SOG組的優(yōu)勢(shì)菌屬不同，而茵陳蒿湯治療后可以改變優(yōu)勢(shì)菌屬種類(lèi)的構(gòu)成，且不同劑量組具有差異性。

4 討論

茵陳蒿湯對(duì)肝癌的治療作用得到了臨床的肯定，但是其機(jī)制尚未清晰。研究人員發(fā)現(xiàn)茵陳蒿湯可能通過(guò)抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖與凋亡[5]；茵陳提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖具有抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5]；大黃中的大黃素通過(guò)miR-429/SOX2軸調(diào)控癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[6]；梔子提取物可能通過(guò)下調(diào)腫瘤凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡[7]。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)茵陳蒿湯在體內(nèi)可能存在抗肝癌的作用。

膽汁酸代謝異常參與了腸道微生態(tài)失衡及肝癌的發(fā)生發(fā)展。膽汁酸是膽固醇在肝細(xì)胞中經(jīng)過(guò)一系列的生化反應(yīng)所形成。鼠類(lèi)肝細(xì)胞中主要合成膽酸和β-鼠膽酸，與?；撬峤Y(jié)合為T(mén)CA和T-β-MCA被肝細(xì)胞排入膽管中。初級(jí)膽汁酸排放量減少會(huì)導(dǎo)致腸道潛在致病菌群增加從而影響腸道微生態(tài)。肝癌、肝硬化等慢性肝病過(guò)程中產(chǎn)生的初級(jí)膽汁酸減少，常伴隨菌群的生態(tài)失調(diào)[8]。T-β-MCA可促進(jìn)肝臟CXCR6+自然殺傷T細(xì)胞的選擇性增加，發(fā)揮抗腫瘤作用[9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示茵陳蒿湯可能促進(jìn)T-β-MCA生成且高劑量效果更佳。

本研究發(fā)現(xiàn)，中高劑量的茵陳蒿可使肝癌小鼠的PCA評(píng)分與SOG組相近。SOG組中的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬、小鼠桿菌屬，屬于正常菌屬，具有促消化、提高腸道免疫、拮抗有害菌屬繁殖等作用[10]。MG組中，隨著T-β-MCA排泄減少，優(yōu)勢(shì)菌屬變?yōu)槁菪龡U菌屬、毛螺菌屬NK4A136和A2菌屬等有害菌。螺旋桿菌可通過(guò)門(mén)靜脈到達(dá)肝臟，激活肝癌細(xì)胞的Toll樣受體2，活化腫瘤細(xì)胞中有絲分裂原蛋白激酶和NFκB，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和浸潤(rùn)[11]。NK4A136被視為肝癌早期生物標(biāo)志物[12]。LDG組中的優(yōu)勢(shì)菌屬為脫硫弧菌科、毛螺菌科的毛螺菌屬。脫硫弧菌被證明可能與肝纖維化有關(guān)，其產(chǎn)生的H2S氣體對(duì)腸道上皮具有毒性作用[13]。MDG組中的優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌屬和另枝菌屬。擬桿菌含有的膽鹽水解酶可促進(jìn)結(jié)合膽汁酸解離，因此可存活在較高濃度的T-β-MCA中。另枝菌屬于革蘭氏陰性菌，大部分耐膽汁[14]。擬桿菌和另枝菌屬都能產(chǎn)生丙酸鹽，門(mén)靜脈內(nèi)的丙酸鹽水平增高可以減少炎癥因子表達(dá)，抑制Th17細(xì)胞在肝臟中募集，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖[14]。HDG 組中的優(yōu)勢(shì)菌屬為梭狀芽胞桿菌屬和顫螺菌屬。梭狀芽孢桿菌屬可產(chǎn)生乙酸鹽、丙酸鹽等[15]。顫螺菌屬被視為下一代益生菌的候選者，能夠產(chǎn)生丁酸鹽[16]。丁酸鹽可通過(guò)抑制Kupffer細(xì)胞中NF-κB的激活來(lái)抑制TNF-α、IL-6和髓過(guò)氧化物酶活性，從而減少肝臟損傷，甚至抑制肝癌進(jìn)展[17]。綜上所述，經(jīng)茵陳蒿湯治療后，各組優(yōu)勢(shì)菌種發(fā)生改變，且不同劑量組也存在差異性，這可能與隨著藥物濃度的增加初級(jí)膽汁酸排放量逐漸增加有關(guān)，不同優(yōu)勢(shì)菌在肝癌發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著不用作用。

綜上所述，茵陳蒿湯可能通過(guò)促進(jìn)初級(jí)結(jié)合膽汁酸 T-β-MCA 的合成，進(jìn)而改變腸道優(yōu)勢(shì)菌種，從而發(fā)揮治療肝癌的作用。